Последние, в свою очередь, разделяются на. Тонкослойная хроматография

Одна из важных задач современной химии – надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства.

Один из наиболее чувствительных методов – хроматографический анализ, впервые предложенный российским ученым М.С.Цветом в начале XX в. и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого уже не могут обходиться как синтетики, так и химики, работающие в других областях.

Разделение Цвет проводил в колонке, показанной на рис. 1. Смесь веществ А, Б и В – природных пигментов, первоначально находящихся в зоне е, – разделяется при приливании соответствующего растворителя Д (элюент) на отдельные зоны.

Как всегда, все началось, казалось бы, c самого простого, что мог проделать любой школьник. В прежние годы школьники, в том числе и автор этой статьи, писали чернилами. И если промокашка попадала на чернильное пятно, то можно было заметить, что раствор чернил разделялся на ней на несколько «фронтов». Хроматография основана на распределении одного из нескольких веществ между двумя, как говорят, фазами (например, между твердым телом и газом, между двумя жидкостями и др.), причем одна из фаз постоянно перемещается, т. е. является подвижной.

Это значит, что такая фаза, например газ или жидкость, все время продвигается, нарушая равновесие. При этом чем лучше то или иное вещество сорбируется (поглощается) или растворяется в неподвижной фазе, тем скорость его движения меньше, и, наоборот, чем меньше сорбируется соединение, т. е. обладает меньшим сродством к неподвижной фазе, тем скорость перемещения больше. В итоге, как показано на рис. 2, если вначале мы имеем смесь соединений, то постепенно все они, подталкиваемые подвижной фазой, движутся к «финишу» с различными скоростями и в конце концов разделяются.

Рис. 2. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А 1 разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А 2 – к неподвижной фазе. А " 1 и А " 2 – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой

Практически образец смеси веществ вводят, например, шприцем в слой неподвижной фазы, а затем различные соединения, входящие в состав смеси, вместе с подвижной фазой (элюент) двигаются вдоль слоя, подгоняемые этой фазой. Скорость перемещения зависит от величины взаимодействия (сродство) компонентов в неподвижной и подвижной фазах, и в результате достигается разделение компонентов.

После разделения необходимо идентифицировать все компоненты и оценить их количественно. Такова общая схема хроматографии.

Следует отметить, что этот современный метод позволяет в течение нескольких минут определить содержание десятков и сотен различных соединений в смеси, причем даже в ничтожных, «следовых» количествах ~10–8%.

Рассмотрим подробнее хроматографический способ анализа. Хроматографические системы можно разделить по следующим принципам:

– агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз;
– геометрические характеристики системы;
– механизм взаимодействия между разделяемым веществом и фазами.

В качестве подвижной фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной, фазы применяются твердые вещества или жидкости.

По расположению фаз хроматографические системы подразделяют на две группы: плоскостные и колоночные.

Последние, в свою очередь, разделяются на:

– насадочные, заполненные зернистым твердым материалом (мелкие шарики), либо являющимся разделительной средой, либо служащим носителем неподвижной жидкой фазы;
– капиллярные, внутренние стенки которых покрыты пленкой неподвижной жидкости или слоем твердого адсорбента (поглотитель).

Взаимодействие между разделяемым веществом и фазами хроматографической системы может осуществляться или на поверхности фазы, или в объеме. В первом случае хроматография называется адсорбционной , во втором – распределительной .

Механизмы разделения молекул в хроматографических системах чаще всего сводятся к следующим:

– неподвижная фаза физически поглощает (сорбирует) разделяемые вещества;
– неподвижная фаза химически взаимодействует с разделяемыми веществами;
– неподвижная фаза растворяет разделяемые вещества из раствора в несмешивающемся растворителе;
– неподвижная фаза имеет пористую структуру, затрудняющую диффузию молекул разделяемых веществ в этой фазе.

Хроматография, начавшись с самодельных устройств типа полоски бумаги, опущенной в растворитель, в настоящее время представлена сложнейшими инструментальными системами, основанными на современных точнейших, или прецизионных, принципах и оснащенными компьютерным обеспечением. Достаточно сказать, что одна из лучших компьютерных фирм «Хъюлетт-Паккард» одновременно выпускает и современные хроматографы.

Схема процесса хроматографирования, в сущности, очень проста и показана на рис. 3. Далее примерно в такой последовательности будет рассмотрен принцип работы хроматографа.

Основные виды хроматографии

К основным видам хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Адсорбционная хроматография. В этом случае разделение веществ осуществляется за счет выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная адсорбция обусловлена сродством того или иного соединения к твердому адсорбенту (неподвижной фазе), а оно, в свою очередь, определяется полярными взаимодействиями их молекул. Поэтому часто хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определяются числом и типом полярных групп. К адсорбционной хроматографии причисляют ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную и газо-адсорбционную хроматографию. Газоадсорбционная хроматография более детально описана в разделе «Элюентный анализ».

Ионообменная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют ионообменные смолы (рис. 4) как в колонках, так и в виде тонкого слоя на пластинке или бумаге. Разделение обычно проводят в водных средах, поэтому этот метод используется главным образом в неорганической химии, хотя применяются и смешанные растворители. Движущей силой разделения в этом случае является различное сродство разделяемых ионов раствора к ионообменным центрам противоположной полярности в неподвижной фазе.

Жидкостная хроматография. В этом случае неподвижной фазой служит жидкость. Наиболее распространенным случаем является адсорбционный вариант жидкостной колоночной хроматографии. Пример разделения природных пигментов представлен на рис. 5.

Рис. 5. Хроматографическое разделение природных пигментов (флавонов и изофлавонов)

Бумажная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют полосы или листы бумаги (рис. 6). Разделение происходит по адсорбционному механизму, причем иногда его проводят в двух перпендикулярных направлениях.

Тонкослойная хроматография – это любая система, в которой неподвижной фазой является тонкий слой, в частности слой оксида алюминия (толщина 2 мм) в виде пасты, нанесенной на стеклянную пластинку. Пример такой системы и результаты разделения показаны на рис. 7.

Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

По другому способу для присоединения белков к гидроксильной группе целлюлозы последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим -триазином, а затем продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка по схеме 2:

Конечно, число способов хроматографирования не ограничивается перечисленными выше. Часто хроматографию сочетают с другими физико-химическими методами, например с масс-спектрометрией, но в данной статье стоит задача познакомить читателя лишь с общими принципами хроматографии. Поэтому далее рассмотрим обработку результатов хроматографирования.

Методы проявления хроматограмм

Проявлением называется процесс переноса разделяемых веществ подвижной фазой. Проявление можно осуществить тремя основными способами: фронтальным анализом, вытеснением и элюированием. Наиболее широко используется элюирование.

Фронтальный анализ. Это случай наиболее простой, т. к. здесь проба и служит подвижной фазой. Ее непрерывно добавляют в систему, поэтому нужны большие объемы пробы. Результаты показаны на рис. 9.

Образование нескольких зон обусловлено различным сродством разных компонентов к неподвижной фазе. Передний край называют фронтом, отсюда и название. В первой зоне находится только наименее удерживаемое вещество А, которое движется быстрее всего. Вторая зона содержит вещество А и Б. Третья зона – смесь веществ А, Б и В. Во фронтальном анализе только компонент А получают в жидком виде.

Вытеснительный анализ. В этом случае подвижная фаза обладает большим сродством к неподвижной фазе, чем разделяемое вещество. В неподвижную фазу вводят небольшую пробу. Но из-за большого сродства подвижная фаза вытесняет и проталкивает все компоненты. Она вытесняет наиболее сильно сорбирующийся компонент В, который, в свою очередь, вытесняет вещество Б, а тот вытесняет наименее сорбирующийся компонент А. В отличие от фронтального анализа с помощью этого способа можно получить все основные компоненты в индивидуальном (жидком) виде.

Элюентный анализ. Подвижную фазу для перемещения растворенного вещества пропускают через хроматографическую систему. Разделение происходит за счет различного сродства компонентов смеси к неподвижной фазе и, следовательно, за счет разных скоростей их перемещения. Пробу малого объема вводят в хроматографическую систему. В итоге зоны с компонентами будут постепенно образовывать отдельные участки, разделенные чистым элюентом. Благодаря высокой эффективности разделения метод получил наиболее широкое распространение и в значительной степени вытеснил другие варианты разделения. Поэтому далее рассмотрим теорию и аппаратное оформление этого метода.

Немного теории. Хроматографические процессы часто удобно рассматривать как серии экстракционных процессов, при этом могут быть разделены вещества с очень близкими свойствами, т. к. в ходе хроматографических процессов быстро и одновременно происходят сотни и даже тысячи циклов экстракции.

Для оценки эффективности хроматографических процессов, исходя из теоретического представления о дистилляции (по аналогии с разделением нефти на ректификационных колоннах, где теоретическая тарелка соответствует части ректификационной колонны, в которой пар и жидкость находятся в равновесии), вводят понятие «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ). Хроматографическая колонка, таким образом, рассматривается как набор гипотетических слоев (тарелок). Под ВЭТТ обычно подразумевают такую толщину слоя, которая необходима для того, чтобы смесь, поступившая из предыдущего слоя, пришла в равновесие со средней концентрацией вещества в подвижной фазе этого слоя. Ее можно описать следующей формулой:

ВЭТТ = L /N ,

где L – длина колонки, N – число теоретических тарелок.

ВЭТТ является суммарной характеристикой разделения веществ. Однако разделить компоненты смеси важно, но недостаточно. Необходимо идентифицировать каждый компонент и определить его количество в пробе. Обычно это осуществляют с помощью обработки хроматограмм – зависимости интенсивности сигнала, пропорционального концентрации вещества, от времени разделения. Некоторые примеры хроматограмм показаны на рис. 10, 11.

Время от момента ввода пробы в колонку до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (tR ). В оптимальных условиях оно не зависит от количества введенной пробы и с учетом геометрических параметров колонки определяется строением того или иного соединения, т. е. является качественной характеристикой компонентов. Количественное содержание компонента характеризуется величиной пика, точнее его площадью. Подсчет площади пика обычно осуществляют автоматически с помощью прибора интегратора, который фиксирует и время удерживания, и площадь пика. Современная аппаратура позволяет сразу получать компьютерную распечатку с указанием содержания всех компонентов разделяемой смеси.

Работа хроматографа. Схема установки наиболее простого газового хроматографа приведена на рис. 12. Она состоит из газового баллона, содержащего подвижную инертную фазу (газ-носитель), чаще всего гелий, азот, аргон и др. С помощью редуктора, уменьшающего давление газа до необходимого, газ-носитель поступает в колонку, представляющую собой трубку, заполненную сорбентом или другим хроматографическим материалом, играющим роль неподвижной фазы.

Рис. 12. Схема работы газового хроматографа:
1 – баллон высокого давления с газом-носителем; 2 – стабилизатор потока; 3 и 3 " – манометры; 4 – хроматографическая колонка; 5 – устройство для ввода пробы; 6 – термостат; 7 – детектор; 8 – самописец; 9 – расходомер

Хроматографическая колонка – это «сердце» хроматографа, поскольку именно в ней происходит разделение смесей. Колонки чаще всего изготавливают из стекла; бывают стальные, тефлоновые, а также капиллярные колонки. Вблизи от ввода газа в колонку устанавливают устройство для ввода пробы. Чаще всего вводят пробу с помощью шприца, протыкая резиновую мембрану. Анализируемая смесь разделяется в колонке и поступает в детектор – прибор, преобразующий результаты разделения в форму, удобную для регистрации.

Одним из наиболее используемых детекторов является катарометр, принцип действия которого основан на измерении теплоемкости разных тел.

На рис. 13 показана схема катарометра. В цилиндрическую полость помещена металлическая спираль (нить сопротивления), нагревающаяся в результате прохождения через нее постоянного электрического тока. При протекании через нее газа-носителя c постоянной скоростью температура спирали остается постоянной. Однако если состав газа меняется при появлении элюируемого вещества, то температура спирали меняется, что и регистрируется прибором.

Другой распространенный детектор – пламенно-ионизационный, схема которого представлена на рис. 14. Он гораздо более чувствителен, чем катарометр, но требует подачи не только газа-носителя, но и водорода. Выходящий из колонки газ-носитель, содержащий элюент, смешивается с водородом и проходит в форсунку горелки детектора. Пламя ионизирует молекулы элюента, в результате чего электрическое сопротивление между электродами уменьшается, а ток увеличивается.

В жидкостной хроматографии применяются спектрофотометрические детекторы (в видимой, УФ- и ИК-областях), а также рефрактометрические детекторы, основанные на измерении показателей преломления растворов.

Таковы в общих чертах азы хроматографического анализа. Конечно, в статье приведены только общие принципы хроматографии, а часто они просто обозначены. На самом же деле «кухня» этого метода достаточно большая и сложная. Главная цель этой статьи, по мнению автора, привлечь внимание юных читателей к этому могущественному методу.

Желающие более подробно ознакомиться с этой областью могут использовать литературу, приведенную ниже.

Л и т е р а т у р а

Жуховицкий А.А., Туркельтауб Н.М. Газовая хроматография. М.: Гостоптехиздат, 1962, 240 с.;
Сакодынский К.И., Киселев А.В., Иогансен А.В. и др. Физико-химическое применение газовой хроматографии. М.: Химия, 1973,
254 с.;
Жидкостная колоночная хроматография. В 3 т. Под ред. З.Дейла, К.Мацека, Я.Янака. М.: Мир, 1972;
Березкин В.Г., Алишоев В.Р., Немировская И.Б . Газовая хроматография в химии полимеров. М.: Наука, 1972, 287 с.;
Морозов А.А. Хроматография в неорганическом анализе. М.: Высш. шк., 1972, 233 с.;
Березкин В.Г., Бочков А.С . Количественная тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1980, 183 с.;
Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. В 2 т. Под ред. О.Микеш. М.: Мир, 1982, т. 1–2, 783 с.;
Хроматографический анализ окружающей среды. Под ред. Р.Гроба. М.: Мир, 1979, 606 с.;
Кирхнер Ю . Тонкослойная хроматография. В 2 т. М.: Мир, 1981, т. 1, 615 с., т. 2, 523 с.;
Экстракционная хроматография. Под ред. Т.Браун, Г.Герсини. М.: Мир, 1978, 627 с.

В.В.Сафонов,
профессор Московской
государственной текстильной
академии им. А.Н.Косыгина

Однако осуществлен и газовый вариант ТСХ. В качестве используют мелкозернистые , Аl 2 О 3 , и др. этих покрывают пластинки из стекла, фольги или ; для закрепления слоя применяют , или др. . Пром-стью выпускаются готовые пластинки с уже закрепленным слоем . Элюентами служат обычно смеси орг. р-рителей, водных р-ров к-т, комплексообразующих и др. в-в. В зависимости от выбора хроматографич. системы (состава подвижной и неподвижной фаз) в разделении в-в осн. роль могут играть процессы , . На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения.

В зависимости от положения пластинки и направления потока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную ТСХ. По технике работы выделяют фронтальный анализ (когда подвижной фазой служит анализируемая смесь) и обычно используемый элюционный вариант. Применяют также "круговую" (когда анализируемый р-р и р-ритель последовательно подаются в центр пластинки) и "антикруговую" ТСХ (когда анализируемый р-р наносится по окружности и элюент перемещается от периферии к центру пластинки), ТСХ под (когда р-ритель под пропускают через слой , покрытый плотно прижатой ), а также ТСХ в условиях градиента т-ры, состава и т. п. В т. наз. двухмерной ТСХ хроматографич. процесс осуществляют последовательно в двух взаимно перпендикулярных направлениях с разл. элюентами, что увеличивает эффективность разделения. С этой же целью применяют многократное элюирование в одном направлении.

В элюционном варианте на слой наносят капли (объемом 1-5 мкл) анализируемого р-ра и погружают край пластинки в элюент, к-рый находится на дне герметично закрываемой стеклянной камеры. Элюент продвигается по слою под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещается в том же направлении. В результате многократного повторения и в соответствии с коэф. распределения в выбранной разделяются и располагаются на пластинке отдельными зонами.

После завершения процесса пластинку вынимают из камеры, высушивают и обнаруживают разделенные зоны по собств. окраске или после опрыскивания их р-рами , образующих окрашенные или флуоресцирующие пятна с компонентами разделяемой смеси. Радиоактивные в-ва обнаруживают авторадиографически (экспонированием на , наложенную на , пластинку). Применяют также . и тивные методы детектирования. Полученная картина распределения хрома-тографич. зон наз. хроматограммой (см. рис.).

Хроматограмма, полученная при разделении смеси трех компонентов методом тонкослойной .

Положение хроматографич. зон на хроматограмме характеризует величина R f -отношение пути l i , пройденного центром зоны i-го компонента от линии старта, к пути l, пройденному элюентом: R f = l i /l; R f 1. Величина R f зависит от коэф. распределения () и от соотношения объемов подвижной и неподвижной фаз.

На разделение в ТСХ влияет ряд факторов-состав и св-ва элюента, природа, и , т-ра, размеры и толщина слоя , размеры камеры. Поэтому для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно стандартизовать условия опыта. Соблюдение этого требования позволяет устанавливать R f с относит. стандартным отклонением 0,03. В стандартных условиях R f постоянна для данного в-ва и используется для последнего.

Кол-во компонента в хроматографич. зоне определяют непосредственно на слое по площади зоны (обычно ее диаметр варьирует от 3 до 10 мм) или интенсивности ее окраски (). Используют также автоматич. сканирующие приборы, измеряющие поглощение, пропускание или отражение света, либо хроматографич. зон. Разделенные зоны можно соскоблить с пластинки вместе со слоем , экстрагировать компонент в р-ритель и анализировать р-р подходящим методом ( , люминесцентный, атомно-абсорбци-онный, атомно-флуоресцентный, радиометрич. анализ, и т.д.). Погрешность количественного определения обычно составляет 5-10%; пределы обнаружения в-в в зонах -10 -3 -10 -2 мкг (по окрашенным производным) и 10 -10 -10 -9 мкг (с применением ).

Достоинства ТСХ: простота, экономичность, доступность оборудования, экспрессность (продолжительность разделения 10-100 мин), высокие производительность и эффективность разделения, наглядность результатов разделения, простота обнаружения хроматографич. зон.

ТСХ применяют для разделения и анализа как орг., так и неорг. в-в: практически всех неорг.

-> Добавить материалы на сайт -> Аналитическая химия -> Золотов Ю.А. -> "Основы аналитической химии Том 2" ->

Основы аналитической химии Том 2 - Золотов Ю.А.