सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट. सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट (मछली)

कुछ मामलों में, एक साइटोजेनेटिक अध्ययन कैरियोटाइप के बारे में निष्कर्ष जारी करने के लिए पर्याप्त नहीं है; इन मामलों में, आणविक साइटोजेनेटिक तरीकों का उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से, सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति (अंग्रेजी - फ्लोरोसेंस इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन - मछली)।

आणविक साइटोजेनेटिक्स में नई प्रौद्योगिकियों के उद्भव, जो मुख्य रूप से न्यूक्लिक एसिड के स्वस्थानी संकरण पर आधारित हैं, ने क्रोमोसोमल डायग्नोस्टिक्स की संभावनाओं का काफी विस्तार किया है। साइटोलॉजिकल तैयारियों पर सीधे विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों को स्थानीयकृत करने के लिए स्वस्थानी संकरण विधि विकसित की गई है। गुणसूत्रों के साइटोलॉजिकल संगठन के विश्लेषण से लेकर उन्हें बनाने वाले डीएनए अनुक्रमों के विश्लेषण तक गुणसूत्रों और गुणसूत्र क्षेत्रों की पहचान में बदलाव आया है। क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्थाओं का पता लगाने और उनका विश्लेषण करने के लिए शास्त्रीय साइटोलॉजिकल तरीकों की प्रभावशीलता की तुलना, जैसे कि क्रोमोसोम के विभेदक धुंधलापन, आधुनिक आणविक साइटोजेनेटिक प्रौद्योगिकियों के साथ पता चला है कि, हेमटोलॉजिकल विकारों में, क्रोमोसोम का साइटोलॉजिकल विश्लेषण केवल एक तिहाई क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था का पता लगाता है और सही ढंग से पहचानता है। स्पेक्ट्रल कैरियोटाइपिंग (SKY) का उपयोग करना। लगभग एक तिहाई पुनर्व्यवस्थाओं को साइटोलॉजिकल तरीकों से गलत तरीके से पहचाना जाता है, और एक तिहाई पर पूरी तरह से ध्यान नहीं दिया जाता है। साइटोजेनेटिक विश्लेषण के शास्त्रीय तरीके SKY द्वारा पहचाने गए केवल 15% गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था का पता लगाना संभव बनाते हैं।

फिश विधि विवो में जीन या गुणसूत्रों को दागने के लिए फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग करती है। इस विधि का उपयोग जीन मानचित्रण और गुणसूत्र विपथन की पहचान के लिए किया जाता है।

तकनीक छोटे डीएनए अनुक्रमों की तैयारी से शुरू होती है, जिन्हें जांच कहा जाता है, जो डीएनए अनुक्रमों के पूरक होते हैं जो अध्ययन की वस्तु का प्रतिनिधित्व करते हैं। जांच पूरक डीएनए क्षेत्रों में संकरण (बांध) करती है और, इस तथ्य के कारण कि उन्हें फ्लोरोसेंट लेबल के साथ लेबल किया जाता है, आपको डीएनए या गुणसूत्रों में रुचि के जीन के स्थानीयकरण को देखने की अनुमति मिलती है। गुणसूत्रों के अध्ययन के अन्य तरीकों के विपरीत, जिनमें सक्रिय कोशिका विभाजन की आवश्यकता होती है, मछली का अध्ययन गैर-विभाजित कोशिकाओं पर किया जा सकता है, जिससे यह विधि लचीली हो जाती है।

तीन अलग-अलग प्रकार की जांचों का उपयोग करके मछली का उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है:

• * लोकस-विशिष्ट जांच जो गुणसूत्रों के कुछ हिस्सों से जुड़ती है। इन जांचों का उपयोग पृथक डीएनए के उपलब्ध संक्षिप्त अनुक्रम की पहचान करने के लिए किया जाता है, जिसका उपयोग एक लेबल जांच तैयार करने और उसके बाद गुणसूत्रों के एक सेट के साथ संकरण के लिए किया जाता है;
• * अल्फा या सेंट्रोमेरिक रिपीट जांच क्रोमोसोम के सेंट्रोमेरिक क्षेत्रों के दोहराए जाने वाले अनुक्रम हैं। उनकी मदद से, प्रत्येक गुणसूत्र को एक अलग रंग में रंगा जा सकता है, जो आपको गुणसूत्रों की संख्या और उनकी सामान्य संख्या से विचलन को जल्दी से निर्धारित करने की अनुमति देता है;
• * संपूर्ण गुणसूत्र के लिए जांच छोटे जांच का एक सेट है जो गुणसूत्र के अलग-अलग हिस्सों के पूरक हैं, लेकिन सामान्य तौर पर इसकी पूरी लंबाई को कवर करते हैं। ऐसी जांचों की एक लाइब्रेरी का उपयोग करके, कोई भी पूरे गुणसूत्र को "रंग" कर सकता है और किसी व्यक्ति का एक विभेदक वर्णक्रमीय कैरियोटाइप प्राप्त कर सकता है। इस प्रकार के विश्लेषण का उपयोग क्रोमोसोमल विपथन का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जैसे ट्रांसलोकेशन, जब एक गुणसूत्र का एक टुकड़ा दूसरे की बांह में स्थानांतरित हो जाता है।

फ्लोरोसेंट-टैग इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (मछली)

अध्ययन के लिए सामग्री रक्त, अस्थि मज्जा, ट्यूमर बायोप्सी, प्लेसेंटा, भ्रूण के ऊतक या एमनियोटिक द्रव है। विश्लेषण के लिए नमूने प्रयोगशाला में ताज़ा पहुंचाए जाने चाहिए। तैयारियां (स्लाइड्स) सीधे ऊतक के नमूनों से या उनकी खेती के बाद तैयार की जाती हैं। मेटाफ़ेज़ और इंटरफ़ेज़ सेल तैयारी दोनों का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट लेबल के साथ लेबल किए गए विशिष्ट डीएनए जांच क्रोमोसोमल डीएनए के साथ संकरण करते हैं, और विभिन्न लोकी में एक साथ कई जांच का उपयोग किया जा सकता है।

फिश मात्रात्मक और गुणात्मक क्रोमोसोमल विपथन जैसे विलोपन (माइक्रोडिलीशन सहित), ट्रांसलोकेशन, दोहरीकरण और एन्यूप्लोइडी का पता लगाने में साइटोजेनेटिक विश्लेषण की एक उपयोगी और संवेदनशील विधि है। इंटरफेज़ क्रोमोसोम पर फिश ट्राइसॉमी 21, 18 या 13 या सेक्स क्रोमोसोम विपथन के जन्मपूर्व निदान के लिए एक तीव्र विधि है। ऑन्कोलॉजी में, मछली हेमटोलॉजिकल विकृतियों से जुड़े कई ट्रांसलोकेशन (बीसीआर/एबीएल, एमएलएल, पीएमएल/आरएआरए, टीईएल/एएमएल1) का पता लगा सकती है। इस विधि का उपयोग कीमोथेरेपी और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद कैंसर के अवशिष्ट प्रभावों की निगरानी करने और कुछ ट्यूमर के लिए खराब पूर्वानुमान से जुड़े बढ़े हुए ऑन्कोजीन (सी-माइसी/एन-माइसी) का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। मछली का उपयोग विपरीत लिंग के व्यक्ति से प्राप्त अस्थि मज्जा एलोग्राफ़्ट के अस्तित्व की निगरानी के लिए भी किया जाता है।

फिश क्रोमोसोमल विपथन की पहचान करने और एक साथ बड़ी (> 500) कोशिका संख्याओं के त्वरित विश्लेषण के लिए एक संवेदनशील तरीका है। यह विधि गुणसूत्रों की प्रकृति और गुणसूत्र डीएनए के अज्ञात टुकड़ों की पहचान करने में अत्यधिक सटीक है।

पारंपरिक साइटोजेनेटिक्सकैरियोटाइप का अध्ययन करते समय, यह हमेशा रिज़ॉल्यूशन के बैंड स्तर तक सीमित था। यहां तक ​​कि गुणसूत्रों के उच्च रिज़ॉल्यूशन विभेदक धुंधलापन के साथ भी, हमें प्रति गुणसूत्र केवल अधिक बैंड मिले, लेकिन हमें यकीन नहीं था कि हम रिज़ॉल्यूशन के आणविक स्तर तक पहुंच रहे थे। डीएनए प्रौद्योगिकी और साइटोजेनेटिक्स में हालिया प्रगति ने आणविक स्तर पर क्रोमोसोमल डीएनए में परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए फिश विधियों का उपयोग करना संभव बना दिया है। आणविक साइटोजेनेटिक्स ने साइटोजेनेटिक्स में एक क्रांतिकारी सफलता प्रदान की है, जिससे अनुमति मिलती है:

10-100 किलोबेस की सीमा में गुणसूत्रों की डीएनए संरचना का विश्लेषण करना;
गैर-विभाजित इंटरफ़ेज़ कोशिकाओं का निदान करने के लिए, जिसका प्रसव पूर्व निदान और प्रीइम्प्लांटेशन आनुवंशिक निदान (पीजीडी) पर भारी प्रभाव पड़ा।

मछली प्रौद्योगिकीएक डीएनए जांच का उपयोग करता है जो एक गुणसूत्र के भीतर विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों को बांधता है या पुनर्निर्मित करता है। विकृत जांच को मूल कोशिका डीएनए के साथ जोड़ा जाता है, जिसे एकल फंसे हुए राज्य में भी विकृत किया जाता है। जांच बायोटिन डीऑक्सीरिडीन ट्राइफॉस्फेट या डिगॉक्सिजेनिन यूरिडीन ट्राइफॉस्फेट को थाइमिडीन से बदल देती है। जांच द्वारा मूल डीएनए के पुनर्रचना के बाद, फ्लोरोक्रोम-लेबल बायोटिन-बाइंडिंग एविडिन या फ्लोरोक्रोम-लेबल एंटीडिगॉक्सिजेनिन जोड़कर जांच-डीएनए कॉम्प्लेक्स का पता लगाया जा सकता है। अतिरिक्त सिग्नल प्रवर्धन एंटीविडिन जोड़कर और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिणामी कॉम्प्लेक्स की जांच करके प्राप्त किया जा सकता है। विभिन्न डीएनए जांचों को कई अलग-अलग फ़्लोरोक्रोम के साथ लेबल करके, एक ही कोशिका के भीतर कई गुणसूत्र या गुणसूत्र खंडों को एक साथ बहु-रंगीन संकेतों के रूप में देखा जा सकता है।

परिभाषित करने की क्षमता विशिष्ट जीन खंड, गुणसूत्रों पर मौजूद या अनुपस्थित, ने डीएनए स्तर पर जीन अनुक्रमों के सिंड्रोम का निदान करना संभव बना दिया, साथ ही इंटरफ़ेज़ नाभिक में ट्रांसलोकेशन, अक्सर व्यक्तिगत कोशिकाओं में भी।

के लिए सामग्री मछलीया तो विभाजित कोशिकाओं से प्राप्त मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र या उन कोशिकाओं से इंटरफ़ेज़ नाभिक जो विभाजन चरण में नहीं हैं, काम कर सकते हैं। आरएनए को हटाने के लिए अनुभागों को आरएनएएस और प्रोटीनेज़ के साथ पूर्व-उपचार किया जाता है जो जांच और क्रोमैटिन के साथ क्रॉस-हाइब्रिडाइज़ हो सकते हैं। फिर डीएनए को विकृत करने के लिए उन्हें फॉर्मामाइड में गर्म किया जाता है और बर्फ-ठंडी शराब के साथ स्थिर किया जाता है। फिर जांच को गर्म करके संकरण के लिए तैयार किया जाता है। उसके बाद, जांच और गुणसूत्र की तैयारी को मिश्रित किया जाता है और संकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कवरस्लिप के साथ सील कर दिया जाता है। ऊष्मायन तापमान या संकरण समाधान की नमक संरचना को बदलकर, बाध्यकारी विशिष्टता को बढ़ाया जा सकता है और पृष्ठभूमि लेबलिंग को कम किया जा सकता है।

सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट का अनुप्रयोग - मछली प्रौद्योगिकी

मछली प्रौद्योगिकी की प्रभावशीलताको पहली बार जीन का स्थानीयकरण करके प्रदर्शित किया गया था। फ्लोरोसेंट लेबलिंग विधि की शुरुआत के साथ, क्रोमोसोमल असामान्यताओं के निदान के लिए सीटू संकरण अपरिहार्य हो गया है जो पारंपरिक बैंडिंग विधियों द्वारा पता नहीं लगाया जाता है। मछली ने आधुनिक आनुवंशिकी में सबसे असाधारण खोजों में से एक, जीनोमिक इंप्रिंटिंग में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाई।

इसकी विकास तकनीक मछलीतीन रूपों में प्राप्त हुआ। सेंट्रोमेरिक, या अल्फा-सैटेलाइट, जांच को सापेक्ष गुणसूत्र विशिष्टता की विशेषता होती है; उनका उपयोग इंटरफेज़ कोशिकाओं के आनुवंशिकी में सबसे अधिक बार किया जाता था। ये जांचें सेंट्रोमियर क्षेत्र में पर्याप्त शक्ति के कुछ हद तक बिखरे हुए संकेत उत्पन्न करती हैं, लेकिन समान सेंट्रोमेरिक अनुक्रम वाले गुणसूत्रों के साथ क्रॉस-हाइब्रिडाइज़ नहीं करती हैं। वर्तमान में, एकल-प्रतिलिपि जांच विकसित की गई है जो एक विशिष्ट गुणसूत्र बैंड से एक अलग संकेत देती है और क्रॉस-हाइब्रिडाइजेशन की घटना से बचने की अनुमति देती है। इन जांचों का उपयोग प्रतिलिपि संख्या और किसी दिए गए सिंड्रोम से जुड़े संदिग्ध विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। क्रोमोसोम 13, 18, 21, एक्स और वाई के लिए डिज़ाइन की गई सिंगल कॉपी और सेंट्रोमेरिक जांच का उपयोग प्रसवपूर्व निदान के लिए किया जाता है।

संपूर्ण गुणसूत्रों को "दागदार" करना भी संभव है मछली. वर्णक्रमीय कैरियोटाइपिंग की तकनीक के लिए धन्यवाद, जो विभिन्न फ्लोरोक्रोम के मिश्रण का उपयोग करता है, अब 24 व्यक्तिगत रंगों के साथ प्रत्येक व्यक्तिगत गुणसूत्र के लिए एक अद्वितीय फ्लोरोसेंट पैटर्न बनाना संभव है। यह तकनीक उन जटिल गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं को निर्धारित करना संभव बनाती है जो पारंपरिक साइटोजेनेटिक तकनीकों का उपयोग करके दिखाई नहीं देती हैं।

तरीका मछलीप्रसवपूर्व निदान में. अधिक प्रजनन आयु की महिलाओं के लिए, गर्भावस्था खुशी का नहीं बल्कि चिंता का कारण हो सकती है। एक महिला की उम्र के साथ, भ्रूण में क्रोमोसोमल असामान्यताएं विकसित होने का खतरा जुड़ा होता है। गर्भावस्था के 16वें सप्ताह में एमनियोसेंटेसिस किया जाता है, इसके बाद कैरियोटाइप विश्लेषण में 10-14 दिन लगते हैं। पूर्व-परीक्षा में फिश का उपयोग तेजी से निदान और प्रतीक्षा समय को कम करने की अनुमति देता है। अधिकांश आनुवंशिकीविदों और प्रयोगशालाओं की राय है कि गर्भावस्था के भविष्य के प्रबंधन के बारे में निर्णय लेने के लिए फिश पद्धति का उपयोग अलग से नहीं किया जाना चाहिए। फिश विधि को कैरियोटाइपिक विश्लेषण द्वारा पूरक किया जाना चाहिए, और इसके परिणाम कम से कम अल्ट्रासाउंड (अल्ट्रासाउंड) या मां के रक्त की जैव रासायनिक जांच की पैथोलॉजिकल तस्वीर से संबंधित होने चाहिए।

जीन के सिंड्रोम दृश्योंइसे माइक्रोडिलीशन सिंड्रोम या सेग्मल एन्यूसोमिया के रूप में भी जाना जाता है। ये एक गुणसूत्र के आसन्न टुकड़ों का विलोपन है, जिसमें आमतौर पर कई जीन शामिल होते हैं। जीन अनुक्रम सिंड्रोम का वर्णन पहली बार 1986 में शास्त्रीय साइटोजेनेटिक तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। अब, फिश के लिए धन्यवाद, डीएनए स्तर पर सबमाइक्रोस्कोपिक विलोपन की पहचान करना संभव है, जिससे एक विशेष सिंड्रोम के विकास से जुड़े सबसे छोटे हटाए गए क्षेत्र की पहचान करना संभव हो गया है, जिसे महत्वपूर्ण क्षेत्र कहा जाता है। एक बार किसी सिंड्रोम के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्र की पहचान हो जाने के बाद, अक्सर विशिष्ट जीन की पहचान करना संभव होता है जिनकी अनुपस्थिति को सिंड्रोम से जुड़ा माना जाता है। जीन अनुक्रम सिंड्रोम के लिए एक हालिया गाइड 14 गुणसूत्रों से जुड़े 18 विलोपन और माइक्रोडिलीशन सिंड्रोम की रिपोर्ट करता है। कुछ सबसे सामान्य जीन अनुक्रम सिंड्रोम और उनकी नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ तालिका में दिखाई गई हैं। 5-2.

टेलोमेयर- संरचनाएँ जो गुणसूत्रों की लंबी और छोटी भुजाओं के सिरों को ढकती हैं। इनमें दोहराए जाने वाले TTAGGG अनुक्रम होते हैं और गुणसूत्रों के सिरों को एक साथ जुड़ने से रोकते हैं। टेलोमेरिक जांच उन जटिल ट्रांसलोकेशन की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है जिन्हें पारंपरिक साइटोजेनेटिक तरीकों से निर्धारित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, मानव जीनोम परियोजना की खोजों में से एक यह तथ्य था कि टेलोमेरेस से सटे गुणसूत्रों के क्षेत्र जीन से समृद्ध हैं। अब यह दिखाया गया है कि सबमाइक्रोस्कोपिक सबटेलोमेरिक विलोपन कई आनुवंशिक रूप से निर्धारित बीमारियों की घटना के लिए जिम्मेदार हैं।

न्यूक्लिक एसिड के सीटू संकरण में विधि एकल-फंसे अनुक्रमों (राइबो- या डीऑक्सीराइबो-, ऑलिगो- या पॉलीन्यूक्लियोटाइड) और उनके पूरक अनुक्रमों के आधार पर कृत्रिम रूप से बनाए गए लेबल जांच के बीच डबल-स्ट्रैंडेड संकर बनाने की संभावना पर आधारित है। लक्ष्य - डीएनए या आरएनए अणुओं का विश्लेषण किया गया। संकरण स्थलों की पहचान करने के लिए, एक डीएनए जांच (डीएनए जांच) को एक रिपोर्टर समूह के साथ लेबल किया जाता है: ü एक रेडियोधर्मी आइसोटोप, ü एक फ्लोरोक्रोम, ü एक एंजाइम जो एक दाग या एक ल्यूमिनसेंट उत्पाद देता है, ü एक हैप्टेन जिसके साथ लेबल किया गया शरीर बंधता है, वगैरह।

जांच में एक रिपोर्टर समूह की उपस्थिति के कारण एक संकर की पहचान करके, कोई - एक निश्चित प्रकार के आरएनए को एन्कोडिंग करने वाले जीन की संख्या का अनुमान लगा सकता है, - जीनोम में गैर-प्रतिलेखित डीएनए के अनुपात को निर्धारित कर सकता है, - कुछ निश्चित संबंध स्थापित कर सकता है एक दूसरे के साथ जीन - और गुणसूत्रों पर उनका सटीक स्थान। आणविक संकरण की विधि में उच्च संवेदनशीलता है (लेबल जांच (10 -15 और 10 -19 एम) की एक छोटी मात्रा का पता लगाना संभव है और, तदनुसार, लक्ष्य में इसका पूरक अनुक्रम) और तेजी से विश्लेषण, जो इसे बनाता है इस पद्धति का उपयोग अनुसंधान गतिविधियों और चिकित्सा, पशु चिकित्सा और फसल उत्पादन में वंशानुगत और संक्रामक रोगों के निदान दोनों के लिए संभव है।

आणविक साइटोजेनेटिक्स में नई प्रौद्योगिकियों के उद्भव, जो मुख्य रूप से न्यूक्लिक एसिड के स्वस्थानी संकरण पर आधारित हैं, ने क्रोमोसोमल डायग्नोस्टिक्स की संभावनाओं का काफी विस्तार किया है।

इंटरफेज़ साइटोजेनेटिक्स: 1. बहुरंगी गुणसूत्र बैंडिंग (एमसीबी)। 2. स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट। 3. अन्य विधियों के साथ मछली का संयोजन: -कोशिका विज्ञान + मछली; -हिस्टोलॉजी + मछली; -इम्यूनोफेनोटाइपिंग + मछली (फिक्शन); मेटाफ़ेज़ साइटोजेनेटिक्स: 1. गुणसूत्रों का ठोस धुंधलापन (संपूर्ण पेंटिंग)। 2. तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सीजीएच)। 3. रंग परिवर्तन कैरियोटाइपिंग (सीसीके)। 4. बहुरंगा कैरियोटाइपिंग: स्पेक्ट्रल कैरियोटाइपिंग (SKY); बहुरंगी मछली (एम - मछली, एम - बैंड)।

मछली - स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति - एक साइटोजेनेटिक विधि है जिसका उपयोग क्रोमोसोम, एमआरएनए आदि पर विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों का पता लगाने और स्थानीयकरण के लिए किया जाता है। यह तकनीक एक पूरक डीएनए/आरएनए अनुक्रम के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल वाले डीएनए/आरएनए जांच के संकरण पर आधारित है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लेबल का पता लगाया जाता है। फिश पद्धति 30 साल पहले शुरू की गई थी। यह गुणसूत्रों पर जीनों के भौतिक मानचित्रण की एक विधि के रूप में व्यापक हो गया है। बाद में, इसे अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों (नैदानिक ​​​​आनुवांशिकी, प्रजनन चिकित्सा, विष विज्ञान, विकासवादी जीवविज्ञान, तुलनात्मक और सेलुलर जीनोमिक्स और क्रोमोसोमल जीवविज्ञान के क्षेत्र में) में लागू किया गया था। फिलहाल, FISH का उपयोग मुख्य रूप से गुणसूत्रों के भौतिक और आनुवंशिक मानचित्र बनाने, संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था, स्थानान्तरण, सूक्ष्म विलोपन, इंटरफेज़ और मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों में जीन प्रवर्धन का पता लगाने के लिए किया जाता है। विज्ञान में प्रगति (न्यूक्लिक एसिड और क्रोमैटिन के रासायनिक और भौतिक गुणों की बेहतर समझ) के साथ-साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और डिजिटल इमेजिंग के विकास के परिणामस्वरूप, विधि में लगातार सुधार हुआ है (संवेदनशीलता, विशिष्टता, संकल्प में सुधार) और इस पद्धति के कई रूप विकसित किये गये हैं।

1) कोशिकाओं को एक ग्लास स्लाइड पर गिरा दिया जाता है जिससे गुणसूत्र फैल जाते हैं 4) क्रोमोसोम को डीएपीआई का उपयोग करके काउंटर स्टेन किया जाता है 2) फ्लोरोसेंटली लेबल जांच को क्रोमोसोम पर रखा जाता है और सील कर दिया जाता है। 3) जांच और गुणसूत्रों को विकृत किया जाता है, संकरित किया जाता है और फिर धोया जाता है 5) स्लाइड को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है

मछली की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल का सामान्य दृश्य निम्नानुसार प्रस्तुत किया जा सकता है: 1. हिस्टोलॉजिकल या साइटोलॉजिकल तैयारी की तैयारी। हिस्टोलॉजिकल तैयारी की तैयारी मानक योजना के अनुसार की जाती है: काटना, अंकन करना, वायरिंग करना, डालना, माइक्रोटॉमी, कट को कांच की स्लाइड पर रखना और डिपैराफिनाइजेशन। साइटोलॉजिकल तैयारी तैयार करते समय, विशेष अवक्षेपण समाधान और सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया जाता है, जिससे एक केंद्रित सेल निलंबन प्राप्त करना संभव हो जाता है। 2. पूर्व-उपचार (यदि आवश्यक हो)। संकरण में बाधा डालने वाले प्रोटीन की उपस्थिति को खत्म करने के लिए तैयारी को प्रोटीज़ द्वारा संसाधित किया जाता है। 3. तैयारी और उसके बाद विकृतीकरण के लिए डीएनए जांच लागू करना। जांच और नमूना डीएनए को विकृत करने के लिए, उन्हें फॉर्मामाइड से उपचारित किया जाता है और लगभग 85-900 C के तापमान तक गर्म किया जाता है।

4. संकरण. विकृतीकरण के बाद, दवा को एक निश्चित तापमान (नैदानिक ​​​​अध्ययन के मामले में 370 C) तक ठंडा किया जाता है और कई घंटों तक एक आर्द्र कक्ष में रखा जाता है (ऊष्मायन की अवधि प्रत्येक विशिष्ट प्रोटोकॉल में इंगित की जाती है)। वर्तमान में, स्वचालित हाइब्रिडाइज़र का उपयोग विकृतीकरण और संकरण के लिए किया जाता है। 5. धुलाई. एक बार जब संकरण पूरा हो जाता है, तो अनबाउंड जांच को धोया जाना चाहिए, जो अन्यथा एक पृष्ठभूमि तैयार करेगा जिससे मछली के परिणामों का मूल्यांकन करना मुश्किल हो जाएगा। फ्लशिंग के लिए आमतौर पर साइट्रेट और सोडियम क्लोराइड (एसएससी) युक्त घोल का उपयोग किया जाता है। 6. प्रति-दाग लगाना। फ्लोरोसेंट रंगों (डीएपीआई - 4, 6-डायमिडिन-2 फेनिलइंडोल; प्रोपीडियम आयोडाइड) की मदद से, सभी परमाणु डीएनए को दाग दिया जाता है। 7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण नियमित संचालन (डीपराफिनाइजेशन, प्रीट्रीटमेंट, धुलाई) को स्वचालित किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके टेलोमेरिक क्षेत्रों की जांच। इंटरफ़ेज़ (नाभिक) और मेटाफ़ेज़ (व्यक्तिगत गुणसूत्र) के चरण में प्राप्त छवियां संयुक्त होती हैं। नीला रंग - डीएपीआई।

मछली-विधि के लाभ: 1. इंटरफ़ेज़ नाभिक में आनुवंशिक सामग्री का अध्ययन करने की संभावना; 2. हां/नहीं के आधार पर वस्तुनिष्ठ परिणाम प्राप्त करना एक मात्रात्मक विधि है; 3. परिणामों की अपेक्षाकृत सरल व्याख्या; उच्च रिज़ॉल्यूशन। फिश विधि के नुकसान: 1. फ्लोरोसेंट रंग जल्दी से "फीके" हो जाते हैं; माइक्रोस्कोप।

फिश विधि विशेष प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके बनाई गई डीएनए जांच के बीच संकरण प्रतिक्रिया पर आधारित है, जो एक सीमित आकार का न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम है, और अध्ययन के तहत साइटोजेनेटिक तैयारी के परमाणु डीएनए का एक पूरक खंड है। डीएनए जांच मछली की स्थापना के लिए मुख्य तत्व है और इसमें एक "लेबल" होता है, यानी इसमें न्यूक्लियोटाइड होते हैं जो फ्लोरोक्रोम ले जाने वाले एंटीबॉडी द्वारा आगे के दृश्य के लिए सीधे फ्लोरोक्रोम या हैप्टेन से जुड़े होते हैं। अनबाउंड लेबल वाले डीएनए को धो दिया जाता है और फिर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संकरित डीएनए जांच का पता लगाया जाता है।

डीएनए लेबलिंग को प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष में विभाजित किया गया है। प्रत्यक्ष लेबलिंग डीएनए में रिपोर्टर तत्वों का परिचय देती है - फ़्लोरोक्रोमेस (रोडामाइन, डायथाइलामिनोकौमरिन, टेक्सास रेड, आदि)। अप्रत्यक्ष लेबलिंग विधि - एक डीएनए नमूना मध्यवर्ती लिगैंड्स (बायोटिन, डाइऑक्सीजेनिन, 2, 4-डाइनिट्रोफेनोल) के साथ पूर्व-संयुग्मित होता है, जिसकी साइटोलॉजिकल तैयारी पर उपस्थिति का पता फ्लोरोक्रोम का उपयोग करके लगाया जाता है। इस मामले में, विधि की संवेदनशीलता काफी बढ़ जाती है, क्योंकि लिगैंड में फ्लोरोक्रोम के साथ बातचीत के कई स्थल हो सकते हैं। 32 पी-लेबल जांच के साथ स्वस्थानी संकरण का वर्णन पहली बार 1969 में किया गया था। डीएनए जांच को लेबल करने और पता लगाने के लिए गैर-रेडियोधर्मी प्रणालियों के विकास ने सीटू संकरण की विधि को सुरक्षित, निष्पादित करने में आसान और परिणामों को संसाधित करने में कम श्रमसाध्य बना दिया है। फ्लोरोसेंट रंग नरम और उपयोग में आसान होते हैं, अनिश्चित काल तक संग्रहीत किए जा सकते हैं, उच्च रिज़ॉल्यूशन देते हैं और एक साथ कई डीएनए अनुक्रमों की जांच करने की अनुमति देते हैं।

जांच: एकल-स्ट्रैंडेड/डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए/आरएनए प्राथमिक/द्वितीयक लेबल जांच। जांच को लेबल किया जाता है: 1) सीधे: न्यूक्लियोटाइड डालकर जिसमें एक फ्लोरोक्रोम जुड़ा होता है (पीसीआर या निक ट्रांसलेशन) 2) एक रिपोर्टर अणु के माध्यम से (उदा: डिगॉक्सिजेनिन, बायोटिन) जिससे फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटीबॉडी जुड़े होते हैं। सिग्नल को बढ़ाने के लिए, आप फ्लोरोसेंट लेबल के साथ लेबल किए गए माध्यमिक, तृतीयक, आदि एंटीबॉडी का उपयोग कर सकते हैं। DNase डीएनए निक ट्रांसलेशन डीएनए पोलीमरेज़ को हटाता है I 3' हाइड्रॉक्सिल डीएनए पोलीमरेज़ में नए न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है मैं 5' अंत क्रोमोसोम इमेजिंग से अलग-अलग आधारों को हटाता हूं: DAPI (2 mg/ml) का उपयोग करके। 4', 6-डायमिडीनो-2-फेनिलिंडोल; ए-टी समृद्ध डीएनए क्षेत्रों के लिए मजबूत बंधन; यूवी प्रकाश के साथ उत्तेजना; उत्सर्जन 461 एनएम (नीला)।

वर्तमान में, कई मुख्य दृष्टिकोण हैं जो आधुनिक आणविक साइटोजेनेटिक्स द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं: विस्तारित गुणसूत्र क्षेत्रों और संपूर्ण गुणसूत्रों की सामग्री की पहचान। एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की रुचि के क्षेत्र में पता लगाना। व्यक्तिगत गुणसूत्र क्षेत्रों के असंतुलन का विश्लेषण। विस्तारित गुणसूत्र क्षेत्रों और संपूर्ण गुणसूत्रों की सामग्री की पहचान करने के लिए, गुणसूत्र-विशिष्ट और क्षेत्र-विशिष्ट डीएनए जांच ("पेंटिंग जांच") का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

विभिन्न प्रकार की जांचों की विशेषताएं 1. लोकस-विशिष्ट जांच (एलएसआई - लोकस - विशिष्ट पहचानकर्ता जो गुणसूत्रों के कुछ क्षेत्रों से जुड़ते हैं।) इन जांचों का उपयोग पृथक डीएनए के उपलब्ध संक्षिप्त (गैर-दोहराए जाने वाले) अनुक्रम की पहचान करने के लिए किया जाता है, जिसका उपयोग किया जाता है एक लेबल जांच तैयार करने और उसके बाद गुणसूत्रों के सेट के साथ संकरण करने के लिए। इन्हें विभिन्न रोग स्थितियों (व्यक्तिगत गुणसूत्रों के लिए मोनोसॉमी और ट्राइसॉमी) में नैदानिक ​​और पूर्वानुमानित रूप से महत्वपूर्ण गुणसूत्र विपथन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इन नमूनों का सबसे व्यापक उपयोग प्रसव पूर्व साइटोजेनेटिक डायग्नोस्टिक्स में प्राप्त किया गया था, विशेष रूप से कोरियोनिक ऊतक कोशिकाओं और एमनियोसाइट्स के इंटरफेज़ नाभिक के अध्ययन में।

2. गुणसूत्रों के टेलोमेरिक क्षेत्रों की डीएनए जांच (टीईएल टेलोमेरिकप्रोब) गुणसूत्र भुजाओं के अंतिम क्षेत्रों को प्रभावित करने वाले विलोपन और पुनर्व्यवस्था का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई है। ऐसी जांचें गुणसूत्रों के पी- या क्यू-भुजाओं के लिए विशिष्ट होती हैं और लगभग 300 केबी लंबे क्षेत्र के पूरक होती हैं। गुणसूत्र के अंत से. एक नियम के रूप में, गुणसूत्रों की छोटी और लंबी भुजाओं के लिए डीएनए जांच अलग-अलग फ्लोरोक्रोम से जुड़ी होती है, जिससे एक साइटोजेनेटिक तैयारी पर गुणसूत्र के दोनों टेलोमेरिक क्षेत्रों का पता लगाना संभव हो जाता है।

3. सेंट्रोमियर रिपीट जांच, अल्फा या क्रोमोसोमल न्यूमरेटर्स (सीईपी - सेंट्रोमियर। एन्यूमरेशन। प्रोब) क्रोमोसोम-विशिष्ट डीएनए जांच हैं जो टेंडेम अल्फा और बीटा सैटेलाइट रिपीट के अनुक्रमों द्वारा दर्शाए जाते हैं। ये दोहराव मुख्य रूप से गुणसूत्रों के सेंट्रोमेरिक या पेरीसेंट्रोमेरिक हेटरोक्रोमैटिन क्षेत्रों में स्थित होते हैं। उनकी मदद से, प्रत्येक गुणसूत्र को एक अलग रंग में चित्रित किया जा सकता है, जो आपको गुणसूत्रों की संख्या और उनकी सामान्य संख्या से विचलन को जल्दी से निर्धारित करने की अनुमति देता है, जो गुणसूत्र के अलग-अलग वर्गों के पूरक हैं, लेकिन समग्र रूप से इसकी पूरी लंबाई को कवर करते हैं। ऐसी जांचों की एक लाइब्रेरी का उपयोग करके, कोई भी पूरे गुणसूत्र को "रंग" कर सकता है और किसी व्यक्ति का एक विभेदक वर्णक्रमीय कैरियोटाइप प्राप्त कर सकता है। इस प्रकार के विश्लेषण का उपयोग क्रोमोसोमल विपथन का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जैसे ट्रांसलोकेशन, जब एक गुणसूत्र का एक टुकड़ा दूसरे की बांह में स्थानांतरित हो जाता है।

अनुप्रयोग मछली का व्यापक रूप से निम्नलिखित नैदानिक ​​​​नैदानिक ​​कार्यों को हल करने के लिए उपयोग किया जाता है: 1. प्रसव पूर्व पेरिम्प्लांटेशन और क्रोमोसोमल असामान्यताओं का निदान। इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) क्लीनिकों और प्रसवकालीन केंद्रों में उपयोग किया जाता है। अजन्मे बच्चे में आनुवंशिक विकारों की पहचान करने और आवश्यक उपाय करने के लिए समय पर (आईवीएफ के मामले में भ्रूण के आरोपण से पहले या भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरण में) अनुमति देता है। 2. ऑनकोहेमेटोलॉजी। ऑनकोहेमेटोलॉजिकल रोग विभिन्न क्रोमोसोमल विपथन के परिणामस्वरूप उत्पन्न होते हैं, इसलिए, उनके निदान के लिए उपयुक्त सीईपी और एलएसआई जांच का उपयोग किया जाता है। 3. ठोस ट्यूमर का निदान. वर्तमान में, विशिष्ट कैंसर के विकास और उनके जीनोम में विशिष्ट परिवर्तनों के बीच अधिक से अधिक कारण संबंध स्थापित हो रहे हैं। इसलिए, उपयुक्त डीएनए जांच का उपयोग करते समय, ऑन्कोलॉजिकल फिश डायग्नोस्टिक्स करना संभव है।

इंटरफेज़ साइटोजेनेटिक्स: अन्य तरीकों के साथ मछली का संयोजन: - मछली इम्यूनोफेनोटाइपिंग (फिक्शन); + फिक्शन (नियोप्लाज्म की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में प्रतिदीप्ति इम्यूनोफेनोटाइपिंग और इंटरफेस साइटोजेनेटिक्स) - ट्यूमर कोशिकाओं के अध्ययन के लिए। इस विश्लेषण के लिए, रक्त, अस्थि मज्जा, या अन्य ऊतकों की तैयारी के बिना दाग वाले स्मीयर का उपयोग किया जाता है। चरण 1 - तैयारी को विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, चरण 2 - एंटीजन-मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के बाद के दृश्य के लिए फ्लोरोफोरस के साथ संयुग्मन किया जाता है। चरण 3 - डीएनए जांच के साथ यथास्थान संकरण करना। रंग में भिन्न फ्लोरोफोरस का उपयोग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और डीएनए जांच का पता लगाने के लिए किया जाता है। फिल्टर के आवश्यक सेट के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत तैयारी का अध्ययन इंटरफेज़ नाभिक में संकरण और संकेतों के इम्यूनोफेनोटाइप के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है।

सी में टीएनएफएआईपी 3 का क्रोमोसोमल विलोपन। इंटरफेज़ साइटोजेनेटिक्स द्वारा एचएल का पता लगाया गया। फिक्शन का विश्लेषण। प्रतिनिधि सी. एचएल मामले संयुक्त। टीएनएफएआईपी 3 और क्रोमोसोम 6 सेंट्रोमियर (नीला [बी]) के लिए सीडी 30 अभिव्यक्ति (लाल) और मछली जांच। ए-सी और ई और एफ में दोहरे रंग के परीक्षण में, टीएनएफएआईपी 3 जांच को हरे (जी) में लेबल किया गया है; डी में लागू ट्रिपल-रंग परख में, टीएनएफएआईपी 3 जांच एजी/नारंगी कोलोकलाइज्ड (सीओ) सिग्नल देती है। सीडी 30 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संयोजन में डबल और ट्रिपल-रंग मछली परख प्रदर्शित करने के लिए दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग किया जाता है; मैं। इ। , डबल-रंग परख (ए-सी और ई और एफ) को ट्रिपल-रंग डिस्प्ले का उपयोग करके दिखाया जाता है, जबकि आईसिस सॉफ़्टवेयर द्वारा प्राप्त एक गलत बहुरंगा डिस्प्ले को ट्रिपल-रंग परख (डी) के लिए एक साथ चार रंग दिखाने के लिए लागू किया जाता है ( यानी, सीडी 30 [आर], टीएनएफएआईपी 3 [जी] और नारंगी, और क्रोमोसोम 6 सेंट्रोमियर [बी])।

माइक्रोइमेज की डिजिटल रिकॉर्डिंग ने न केवल फ्लोरोफोरस के संयोजन को छद्म रंगों में परिवर्तित करने की संभावना खोली, बल्कि उनके अनुपात, तीव्रता को भी

गुणसूत्रों का बहुरंगा धुंधलापन (मुली. कलर बैंडिंग - एमएसवी) यह विधि सभी गुणसूत्रों के संपूर्ण विश्लेषण के लिए नहीं है, बल्कि एकल गुणसूत्र के विस्तृत विश्लेषण के लिए है। लोकस-विशिष्ट डीएनए जांच को अलग-अलग फ्लोरोफोरस या फ्लोरोफोरस के संयोजन के साथ लेबल किया जाता है ताकि प्रत्येक डीएनए जांच का सिग्नल स्तर तीव्रता में भिन्न हो। डीएनए जांच संकेतों की ओवरलैपिंग तीव्रता प्रोफाइल गुणसूत्र के साथ विभिन्न फ्लोरोफोरस की प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात में भिन्नता प्रदान करती है। तीव्रता अनुपात को छद्म रंगों में अनुवादित किया जा सकता है, और इस प्रकार, छवि के प्रत्येक बिंदु, और, परिणामस्वरूप, प्रत्येक गुणसूत्र लोकी का अपना छद्म रंग होगा। बहुरंगी मछली विधि का यह संस्करण न केवल इंटरक्रोमोसोमल बल्कि ऑन्कोलॉजिकल रोगों में इंट्राक्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था के विश्लेषण में अत्यधिक प्रभावी साबित हुआ। हालाँकि, इसके सफल अनुप्रयोग के लिए, पहले उस गुणसूत्र को निर्धारित करना आवश्यक है जिसकी जांच की जाएगी। आणविक साइटोजेनेटिक्स की यह विधि कुछ गुणसूत्रों से जुड़े कैरियोटाइप विकारों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।

आज तक, डीएनए जांच के सेट बनाए गए हैं जो क्रोमोसोम 5 पर सभी मानव गुणसूत्रों के लिए एमसीवी प्रदान करते हैं; क्रोमोसोम 5 की बहुरंगा बैंडिंग; क्रोमोसोम 5 का इडियोग्राम; एमएसवी के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम)।

मेटाफ़ेज़ साइटोजेनेटिक्स, जो ऐतिहासिक रूप से इंटरफ़ेज़ से पहले उत्पन्न हुआ था, क्रोमोसोमल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को निर्धारित करना संभव बनाता है, लेकिन इसके लिए आवश्यक है कि अध्ययन के तहत कोशिकाएं अर्धसूत्रीविभाजन के मेटाफ़ेज़ चरण में हों।

बहुरंगा कैरियोटाइपिंग विश्लेषण भुजाओं या पूरे गुणसूत्रों (डब्ल्यूसीपी जांच - पूरे गुणसूत्र पेंट) के निरंतर धुंधलापन की डीएनए जांच का उपयोग करके किया जाता है। इस तरह की जांच गुणसूत्र की पूरी लंबाई के साथ स्थित कई छोटे डीएनए अनुक्रमों के साथ संकरण करती है। इस प्रकार, जब एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है, तो गुणसूत्र एक निश्चित रंग में समान रूप से रंगा हुआ दिखाई देता है।

इस विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली डीएनए जांच में मानव गुणसूत्रों के पूरे सेट के लिए ठोस धुंधला जांच का मिश्रण होता है, जिसे कई फ्लोरोक्रोम के संयोजन के साथ लेबल किया जाता है, जिसका अनुपात गुणसूत्रों की प्रत्येक जोड़ी के लिए व्यक्तिगत रूप से चुना जाता है। छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त पंजीकरण विधियों और कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग, जो छवि के प्रत्येक बिंदु के लिए सभी फ्लोरोक्रोम की चमक की तीव्रता का मूल्यांकन करता है, कैरियोटाइपिंग को अंजाम देना संभव बनाता है, जिसमें गुणसूत्रों की प्रत्येक जोड़ी का अपना अनूठा "छद्म रंग" होता है ".

एम-फिश (मल्टीटार्गेट मल्टीफ्लोर मल्टीकोरर या मल्टीप्लेक्स। फिश) फ्लोरोक्रोम-विशिष्ट फिल्टर सेट का उपयोग करने वाली पारंपरिक मल्टीकोरर मछली का सामान्य नाम है। एम-फिश सिद्धांत में उपयोग किए गए सभी फ्लोरोक्रोम के सिग्नल की अलग-अलग डिजिटल रिकॉर्डिंग शामिल है, जो क्रमिक रूप से फ़िल्टर सेट को बदलकर हासिल की जाती है। सभी छवियां अलग-अलग फ़ाइलों में दर्ज की जाती हैं, जिससे सिग्नल और पृष्ठभूमि पृथक्करण के साथ-साथ सिग्नल मात्रा निर्धारण से संबंधित उनकी कुशल प्रसंस्करण करना संभव हो जाता है। विशेष सॉफ़्टवेयर की सहायता से सभी रिकॉर्ड की गई जानकारी का प्रसंस्करण छवि के प्रत्येक बिंदु पर फ़्लोरोक्रोम संकेतों के स्तर के बारे में जानकारी को छद्म रंगों में अनुवादित करता है। उपयोग किए गए डीएनए जांच की संख्या की मुख्य सीमाओं में से एक गैर-अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ उपलब्ध फ्लोरोक्रोम की संख्या और उपयुक्त फिल्टर सेट की उपलब्धता है।

24-रंग वाली मछली सभी मानव गुणसूत्रों से सामग्री की एक साथ पहचान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एम-मछली 24-रंग वाली मछली है। यह क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन का पता लगाने में अत्यधिक कुशल है, लेकिन इसे विलोपन और व्युत्क्रम का पता लगाने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है। हालाँकि, डीएपीआई के साथ गुणसूत्रों के एक साथ धुंधला होने से इस समस्या को आंशिक रूप से हल किया जा सकता है, जिससे उन गुणसूत्रों के विभेदक धारी का विश्लेषण करना संभव हो जाता है जिनकी गुणसूत्र सामग्री पहले ही पहचानी जा चुकी है। दुर्भाग्य से, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एम-फिश के बाद क्रोमोसोम डीएपीआई बैंडिंग की गुणवत्ता जीटीजी डिफरेंशियल स्टेनिंग और यहां तक ​​कि पारंपरिक सीटू संकरण के बाद डीएपीआई बैंडिंग से काफी कम है।

आरएक्स. मछली एम-फिश सिद्धांत का उपयोग मानव गुणसूत्रों के लिए एक बहुरंगा बार कोड और सीटू संकरण में अंतर-प्रजाति के आधार पर एक बहुरंगा गुणसूत्र बैंडिंग विधि उत्पन्न करने के लिए किया गया है। 24 रंगीन मछलियों के विपरीत, यह विधि इंट्राक्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था के हिस्से का सीधे पता लगाना संभव बनाती है। आरएक्स में प्रयुक्त डीएनए जांच। मछली को 3 फ्लोरोक्रोम के संयोजन के साथ लेबल किया गया है, जो 7 छद्म रंग प्रदान करता है। वे विशेष रूप से गुणसूत्रों के अलग-अलग क्षेत्रों को दाग देते हैं, जिससे उनमें रंग की धारियां बन जाती हैं। आरएक्स के लिए डीएनए नमूनों की यह सुविधा। मछली का निर्धारण उनके प्राप्त करने के तरीके से होता है। वे दो गिब्बन प्रजातियों के गुणसूत्र-विशिष्ट डीएनए पुस्तकालय हैं: हाइलोबेट्स कॉनकोलर और हाइलोबेट्स सिंडैक्टाइलस।

गिब्बन की आधुनिक प्रजातियों के निर्माण के दौरान हुई तीव्र गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था के परिणामस्वरूप, उनके गुणसूत्रों की सामग्री मनुष्यों में गुणसूत्रों के संगठन की तुलना में अत्यधिक फेरबदल वाली निकली, जिनके गुणसूत्र उनकी रूढ़िवादिता के लिए जाने जाते हैं। मानव गुणसूत्र 1 से गिब्बन गुणसूत्र का अनुपात चित्र 1 में दिखाया गया है,

चित्र 2 आरएक्स के परिणामस्वरूप प्राप्त मानव गुणसूत्रों का एक सामान्य दृश्य दिखाता है। मछली। ए) मेटाफ़ेज़ प्लेट बी) गुणसूत्रों की व्यवस्था।

हालाँकि, RXFISH की गंभीर सीमाएँ हैं - एक रंग RX बैंड के भीतर होने वाले गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था का इस पद्धति का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है जब तक कि वे इस बैंड के आकार में महत्वपूर्ण और आसानी से दिखाई देने वाले परिवर्तन न करें। - जांच एक छद्म रंग में विभिन्न गुणसूत्रों के कई गुणसूत्र क्षेत्रों को दाग देती है। हालाँकि, जैसे-जैसे उपयोग किए जाने वाले फ़्लोरोक्रोम की संख्या बढ़ती है, RXFISH विधि निस्संदेह नियमित 24-रंग वाली मछली की तुलना में अधिक जानकारीपूर्ण होगी।

वर्तमान में RXFISH के फायदों में निम्नलिखित बिंदु शामिल हैं: यह विधि एक एकल बहुरंगा मछली प्रयोग में संपूर्ण मानव जीनोम के विश्लेषण की अनुमति देती है। लेबल किए गए डीएनए जांच के सेट और आवश्यक पहचान प्रणालियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यह विधि इंट्रा- और इंटरक्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था के एक महत्वपूर्ण हिस्से की तेजी से पहचान करने की अनुमति देती है। "रंग बैंडिंग" के मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों की स्वचालित पहचान संभव है। प्रत्येक मानव गुणसूत्र में एक अद्वितीय रंग बार कोड होता है। RXFISH को साइटो वर्कस्टेशन में एकीकृत किया गया है। दृष्टि और मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सिस्टम।

स्पेक्ट्रल कैरियोटाइपिंग (SKY-स्पेक्ट्रल कैरियोटाइपिंग) वर्णक्रमीय कैरियोटाइपिंग में सूक्ष्म छवि विश्लेषण के मूल सिद्धांत व्यावहारिक रूप से एम-फिश में उपयोग किए जाने वाले समान हैं। अंतर छवि को पंजीकृत करने के तरीके से संबंधित हैं। SKY तकनीक एक माप के दौरान छवि के सभी बिंदुओं के लिए वर्णक्रमीय वक्र प्राप्त करना संभव बनाती है, भले ही यह एपिफ्लोरेसेंस से जुड़ा हो या पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से। सभी मानव गुणसूत्रों के वर्णक्रमीय कैरियोटाइपिंग के लिए, पांच फ्लोरोक्रोम का उपयोग किया जाता है, एक हरे स्पेक्ट्रम में, दो लाल में और दो अवरक्त में। डीएनए जांच को लेबल करने में उपयोग किए जाने वाले सभी फ्लोरोक्रोम का उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के एक सेट के साथ होता है, जिससे उनके अनुक्रमिक परिवर्तन, मध्यवर्ती फोकसिंग और, परिणामस्वरूप, संबंधित समस्याओं, जैसे छवि स्थानिक बदलाव, थ्रेशोल्ड मानों का निर्धारण से बचना संभव हो जाता है। ​और विभाजन मुखौटे। वर्णक्रमीय वक्रों के विश्लेषण के आधार पर, किसी दिए गए बिंदु पर विशिष्ट फ्लोरोक्रोम की उपस्थिति या अनुपस्थिति निर्धारित की जाती है।

अगला चरण वर्गीकरण प्रक्रिया है, जो आपको विश्लेषण की गई सामग्री की गुणसूत्र संबद्धता को सीधे और स्पष्ट रूप से निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह मार्कर गुणसूत्र सामग्री की विश्वसनीय पहचान (एक गुणसूत्र तक) सुनिश्चित करता है, साथ ही विभिन्न पुनर्व्यवस्थाओं से उत्पन्न गुणसूत्र व्युत्पन्न भी सुनिश्चित करता है। SKY का बड़ा लाभ यह है कि DAPI रंग वर्णक्रमीय छवि के समानांतर पंजीकृत होता है। डीएपीआई बैंडिंग का सॉफ्टवेयर सुधार जीटीजी बैंडिंग के करीब गुणवत्ता में अंतर प्राप्त करने की अनुमति देता है। वर्णक्रमीय छवि के समानांतर विश्लेषण और गुणसूत्रों के गुणात्मक विभेदक धुंधलापन की संभावना SKY परिणामों की व्याख्या को बहुत सरल बनाती है और गुणसूत्र टूटने के बिंदुओं के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देती है। SKY के निस्संदेह लाभों में ओवरलैपिंग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोक्रोम का उपयोग करने की संभावना शामिल है, जो प्रयोग करने योग्य फ्लोरोक्रोम की सूची को महत्वपूर्ण रूप से विस्तारित करता है, और एक साथ उपयोग किए जा सकने वाले फ्लोरोक्रोम की संख्या भी बढ़ाता है। नए फ्लोरोक्रोम की लिस्टिंग के लिए फिल्टर के नए सेट की खरीद की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि स्पेक्ट्रल फिश के लिए एक फिल्टर यूनिट और डीएपीआई के लिए एक फिल्टर यूनिट स्काई के लिए पर्याप्त है।

SKY के नुकसानों में शामिल हैं: - लंबा एक्सपोज़र समय, सूक्ष्म छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक। - जब अपेक्षाकृत छोटे डीएनए जांच के साथ अनुसंधान की बात आती है तो SKY एम-फिश की तुलना में थोड़ा कम कुशल है।

रंग बदलने वाला कैरियोटाइपिंग (CCKs रंग बदलने वाला कैरियोटाइपिंग) यह विधि फ्लोरोक्रोम से जुड़े डीएनए जांच और एंटीबॉडी ले जाने वाले डीएनए जांच के साथ संकरणित डीएनए नमूनों के बीच सिग्नल की लंबाई में अंतर के विश्लेषण पर आधारित है। यह विधि केवल 3 फिल्टर के साथ संभव है और इसके लिए विशेष कैमरे और सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है। गुणसूत्रों की पहचान करने के लिए, एक संकरण किया जाता है और दो छवियां प्राप्त की जाती हैं। यह विधि फ्लोरोसेंट सिग्नल की लंबाई में अंतर पर आधारित है, क्योंकि एंटीबॉडी से जुड़े डीएनए नमूनों का एक्सपोज़र समय फ्लोरोक्रोम से जुड़े नमूनों की तुलना में 80 - 90% कम है। संकरण प्रतिक्रिया के बाद, स्वैब को उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के संपर्क में लाया जाता है और फिर पहली छवि प्राप्त करने के लिए कल्पना की जाती है। फिर स्लाइडों को उसी फ़्लोरोक्रोम से बंधे द्वितीयक एंटीबॉडी और एविडिन के संपर्क में लाया जाता है। डीएपीआई का उपयोग करके स्ट्रोक को रोका जा सकता है।

भविष्य में, बारी-बारी से 3 फ़िल्टर का उपयोग करके तैयारियों की छवियां फिर से प्राप्त की जाती हैं। विशेष सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इन छवियों की तुलना की जाती है और एक दूसरी छवि प्राप्त की जाती है, जिसमें केवल कुछ एंटीबॉडी से जुड़े गुणसूत्र दिखाई देंगे। इस प्रकार, कुछ गुणसूत्र केवल पहले या दूसरे स्कैन पर प्रतिदीप्त होंगे, जबकि अन्य अलग-अलग स्कैन पर रंग बदल देंगे।

तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सीजीएच) विधि जीनोम में मात्रात्मक विकारों की पहचान करने के लिए बनाई गई थी। यह डीएनए जांच के रूप में संपूर्ण जीनोम का उपयोग करके स्वस्थानी संकरण प्रतिक्रिया करने पर आधारित है। पृथक और सामान्य दाता डीएनए को विभिन्न रंगों के फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किया जाता है, इस प्रकार उन्हें डीएनए जांच में बदल दिया जाता है। इन जांचों की समतुल्य मात्रा को मिश्रित किया जाता है और नियंत्रण साइटोजेनेटिक तैयारी के साथ संकरण में उपयोग किया जाता है। फिश के बाद, प्रत्येक गुणसूत्र की पूरी लंबाई के साथ दो फ्लोरोक्रोम की प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए एक विशेष कंप्यूटर छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर मेटाफ़ेज़ का विश्लेषण किया जाता है।

परीक्षण नमूने के कैरियोटाइप में मात्रात्मक परिवर्तनों की अनुपस्थिति में, दो फ्लोरोक्रोम की ल्यूमिनसेंस तीव्रता का एक निश्चित अनुपात देखा जाएगा। जीन प्रवर्धन के मामले में, संबंधित फ्लोरोक्रोम के संकेत की तीव्रता बढ़ जाएगी, और आनुवंशिक सामग्री के हिस्से के नुकसान के मामले में, इसके विपरीत, यह कमजोर हो जाएगा। इस प्रकार, सीजीएच जीनोमिक असंतुलन का पता लगाना संभव बनाता है, लेकिन इस विधि का उपयोग संतुलित अनुवाद और व्युत्क्रम का पता लगाने के लिए नहीं किया जा सकता है, और ट्राइसॉमी और विलोपन का पता केवल तभी लगाया जा सकता है जब असंतुलित क्षेत्र का आकार कम से कम 10 मिलियन बेस जोड़े हो।

परीक्षण नमूने में क्रोमोसोमल असंतुलन का अनुमान फ्लोरोसेंट अनुपात (आरएफ) की गणना करके दो अलग-अलग फ्लोरोक्रोम की फ्लोरोसेंस तीव्रता में अंतर से लगाया जाता है।

जीनोम परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए सीजीएच विधि के अन्य तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं: सबसे पहले, यह परीक्षण सामग्री के स्रोत पर निर्भर नहीं करता है, और अभिलेखीय सामग्री सहित थोड़ी मात्रा में डीएनए परीक्षण के साथ सफलतापूर्वक किया जा सकता है। दूसरे, यह एक ही प्रयोग में पूरे जीनोम में आनुवंशिक सामग्री की प्रतियों की संख्या में हानि या वृद्धि के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। तीसरा, सीजीएच पद्धति में अध्ययन के तहत ऊतक से मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र तैयारी की आवश्यकता नहीं होती है, अर्थात यह कोशिका संस्कृति प्रक्रिया और संबंधित कलाकृतियों पर निर्भर नहीं होती है।

जीनोमिक सीटू हाइब्रिडाइजेशन (जीनोमिक सीटू हाइब्रिडाइजेशन इन, जीआईएसएच) सीटू हाइब्रिडाइजेशन विधि का एक प्रकार है, जिसमें यह तथ्य शामिल है कि निश्चित नमूनों के साथ हाइब्रिडाइजेशन के लिए, जीव की एक प्रजाति के कुल जीनोमिक डीएनए का उपयोग फ्लोरोसेंटली लेबल जांच के रूप में किया जाता है। जिससे जीव की अन्य प्रजाति का कुल जीनोमिक डीएनए प्रतिस्पर्धा करता है; जीनोम, क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था, विलोपन और प्रतिस्थापन में अंतरप्रजाति और अंतःप्रजाति अंतर निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

मछली विविधताएं 1) क्यू-फिश - मात्रात्मक मछली: लैंसडॉर्प एट अल द्वारा विकसित: यू.एम. मार्टेंस, जे.एम. ज़िजलमैन्स, एस.एस. पून, डब्ल्यू. ड्रैगोव्स्का, जे. यूई, ई.ए. चावेज़, आर.के. वार्ड, और पी.एम. लैंसडॉर्प। 1998. मानव गुणसूत्र 17 पी पर लघु टेलोमेर। नेट. जेनेट। 18:76-80. मात्रात्मक पद्धति। फ्लो साइटोमेट्री के साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया। मूल रूप से टेलोमेरिक रिपीट की संख्या की गणना करके गुणसूत्र की लंबाई (रिज़ॉल्यूशन: 200 बीपी) मापने के लिए उपयोग किया जाता है। पीएनए-संयुग्मित जांच का उपयोग किया जाता है। प्रारंभ में, मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों का अध्ययन किया गया (QFISH उचित), अब यह विधि इंटरफ़ेज़ गुणसूत्रों (IQ-FISH) पर भी लागू होती है। क्यू-फिश सेल कल्चर, टिशू सेक्शन (दोनों चश्मे पर) पर किया जाता है। फिलहाल, क्यू-फिश उम्र बढ़ने और कैंसर के गठन की प्रक्रियाओं में टेलोमेर की भूमिका के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

पीएनए-मछली - पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड मछली: पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (पीएनए) डीएनए के सिंथेटिक एनालॉग हैं जिसमें डीऑक्सीराइबोज फॉस्फेट की चीनी रीढ़, जो नाइट्रोजन बेस का समर्थन करती है, को एक अपरिवर्तित पेप्टाइड रीढ़ द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। इस संरचना के परिणामस्वरूप: जब पीएनए-ओलिगोमेरिक जांच पूरक डीएनए/आरएनए के साथ संकरण करती है, तो कोई इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण नहीं होता है। पीएनए-डीएनए (पीएनए-आरएनए) डुप्लेक्स प्राकृतिक होमो/हेटेरोडुप्लेक्स की तुलना में बहुत अधिक स्थिर होते हैं। पीएनए-डीएनए बाइंडिंग की उच्च विशिष्टता: डीएनए-डीएनए संकरण की तुलना में पीएनए-डीएनए संकरण बेस जोड़ी बेमेल के प्रति अधिक संवेदनशील है। इस प्रकार, पीएनए जांच का उपयोग करके, दो सेंट्रोमेरिक रिपीट को प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जो केवल एक बेस जोड़ी में भिन्न होते हैं। पीएनए में सापेक्ष हाइड्रोफोबिसिटी (डीएनए की तुलना में) होती है, जिसके परिणामस्वरूप पीएनए कोशिका दीवारों के माध्यम से बेहतर ढंग से फैलता है => सूक्ष्म जीव विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोग। उच्च बाइंडिंग विशिष्टता के आधार पर: ऐसा माना जाता है कि पीएनए तकनीक जल्द ही स्वस्थानी संकरण के लिए एलील-विशिष्ट जांच के निर्माण का आधार बन जाएगी। इसका उपयोग आनुवंशिकी, साइटोजेनेटिक्स, एपिजेनेटिक्स, माइक्रोबायोलॉजी आदि में किया जाता है।

3) फ्लो-फिश - फ्लो साइटोमेट्री के लिए मछली: 1998 में प्रस्तावित: रूफर, एन., ड्रैगोव्स्का, डब्ल्यू., थॉर्नबरी, जी., रूसनेक, ई. और लैंसडॉर्प, पी. एम. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापी गई मानव लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या में टेलोमेयर लंबाई की गतिशीलता . प्रकृति जैव प्रौद्योगिकी. 16, 743-747 (1998)। क्यू-फिश और फ्लो साइटोमेट्री का एक संयोजन जो सिग्नल विश्लेषण (माप) और सॉर्टिंग की अनुमति देता है। फ्लो-फिश के लिए, एक सेल सस्पेंशन का उपयोग किया जाता है (क्रोमोसोम टेलोमेरेस की लंबाई मापने के लिए), क्रोमोसोम स्प्रेड और पृथक क्रोमोसोम (आगे की मैपिंग के लिए)। क्यू-फिश की तरह, पीएनए-टैग टेलोमेरिक जांच का उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, टेलोमेरिक दोहराव की लंबाई को देखने और मापने के लिए)। मुख्य लाभ एक तेज़ विधि (बड़ी संख्या में कोशिकाओं/गुणसूत्रों का विश्लेषण/छंटाई) है। इसका व्यापक रूप से विभिन्न समस्याओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है: उम्र बढ़ने, टेलोमेयर संरक्षण, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल सस्पेंशन का अध्ययन पूर्व विवो, बैक्टीरिया का अध्ययन।

मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण एक नमूने के भीतर सेल प्रकारों के भेदभाव की अनुमति देता है, आंतरिक नियंत्रण की अनुमति देता है, और ल्यूकोसाइट उपप्रकारों का विश्लेषण करता है।

फ्लो-फिश के लाभ: आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम भौतिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और मार्करों का उपयोग करके आबादी में कोशिकाओं के उपसमूहों का विश्लेषण करने की क्षमता, क्यू-फिश की तुलना में बेहतर प्रदर्शन, हजारों कोशिकाओं की फ्लोरोसेंस की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पृथक क्रोमोसोम की जांच 1. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा क्रोमोसोम सॉर्टिंग - फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कैरियोटाइपिंग का उपयोग जीन को आगे बढ़ाने और क्रोमोसोम लाइब्रेरी बनाने के लिए किया जाता है। - क्रमबद्ध गुणसूत्रों पर जीन की पहचान और स्थानीयकरण FISH विधियों / PRINS विधि (प्राइमेड इन सीटू लेबलिंग) या इसकी विविधताओं और गुणसूत्र-विशिष्ट पीसीआर के बाद के उपयोग के साथ किया जाता है। - 2011 तक, अब तक खेती वाले पौधों की केवल 17 प्रजातियों के गुणसूत्रों को सफलतापूर्वक क्रमबद्ध किया गया है। - उच्च विभाजन सूचकांक के साथ मेटाफ़ेज़ या पचीटेनिक गुणसूत्रों की छँटाई।

फ्लोरोसेंट लेबल: - क्रोमोसोम को न्यूक्लिक एसिड विशिष्ट फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किया जाता है। - फ्लोरोक्रोम का चयन 1) नाइट्रोजनस आधारों की विशिष्टता, 2) प्रायोगिक स्थितियों (उपलब्ध लेजर की तरंग दैर्ध्य को ध्यान में रखते हुए) के अनुसार किया जाता है। 1. मोनोवेरिएंट विश्लेषण के लिए, ऐसे रंगों का उपयोग करें जो ए-टी या जी-सी जोड़े के लिए विशिष्ट नहीं हैं: प्रोपीडियम आयोडाइड (उत्तेजना शिखर: 535 एनएम, उत्सर्जन: 617 एनएम, लेजर आवश्यक: 488 एनएम आर्गन लेजर या लैंप + लॉन्ग-पास फिल्टर) एथिडियम ब्रोमाइड ( उत्तेजना शिखर: : 300 और 520 एनएम, उत्सर्जन: 600 एनएम, आवश्यक लेजर: 488 एनएम आर्गन लेजर या लैंप + लॉन्ग-पास फिल्टर) ये लेबल ए, जी, टी या नाइट्रोजनस बेस की सामग्री की परवाह किए बिना डीएनए को दाग देते हैं। 2. द्विचर विश्लेषण के लिए उपयोग करें: क्रोमोमाइसिन (जी-सी बेस जोड़े के लिए विशिष्ट), शिखर ए 3 उत्तेजना: 458 एनएम, उत्सर्जन 580 एनएम। लेज़र: , 458 एनएम न्यूनतम 400 मीटर वी शक्ति। होचस्ट 33258 (ए-टी बीपी के लिए विशिष्ट), उत्तेजना: 351-364 एनएम, उत्सर्जन: 470 एनएम। लेज़र: 351 -364 एनएम (शक्तिशाली)। फ़्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रा के आंशिक ओवरलैप के कारण लेज़रों को समय और स्थान में अलग किया जाना चाहिए।

2. छँटाई के बाद गुणसूत्रों/न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का अध्ययन (भौतिक और आनुवंशिक मानचित्र आदि के निर्माण के लिए) फिश बेक-फिश प्रिन्स सी-प्रिन्स लंबे गुणसूत्रों वाले बड़े जीनोम का अध्ययन। बड़ी संख्या में दोहराव वाले अनुक्रमों का मानचित्रण (उदा: टेलोमेरिक और सेंट्रोमेरिक क्षेत्र)। लघु जांच का उपयोग. बड़ी संख्या में दोहराव के कारण सिग्नल मजबूत होता है। मानक जांच आकार: 15 - 30 न्यूक्लियोटाइड। मछली

मछली की समस्याएं: एकल-लोकस डीएनए अनुक्रमों (यानी, गैर-दोहराए गए अद्वितीय डीएनए अनुक्रम) को स्थानीयकृत करना मुश्किल है क्योंकि मानक लघु जांच का उपयोग करते समय संकेत बहुत कमजोर होगा। सिग्नल को बढ़ाने के लिए जांच की लंबाई को कई किलोबेस तक बढ़ाने से संवेदनशीलता में कमी आएगी और => गैर-विशिष्ट बाइंडिंग होगी। समाधान: बीएसी-फिश -बीएसी-फिश फिश विधि और जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) में एकीकृत जीनोमिक डीएनए क्लोन का उपयोग का एक संयोजन है, जो बड़े डीएनए अनुक्रमों को सम्मिलित करने की अनुमति देता है। - छोटे जीनोम वाले जीवों के व्यक्तिगत गुणसूत्रों की पहचान और मानचित्रण के लिए एक कुशल विधि। बीएसी जांच, ओवरगोस (ओवरलैपिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स) का उपयोग जांच के रूप में किया जाता है।

मछली का विकल्प: प्रिन्स प्रिन्स (प्राइमेड इन सीटू लेबलिंग) एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड डीएनए प्राइमर को विकृत क्रोमोसोमल डीएनए के एक समरूप अनुक्रम के साथ और बाद में लेबल किए गए न्यूक्लियोटाइड्स के साथ सीटू में प्राइमर के एंजाइमैटिक विस्तार के साथ क्रोमोसोम को लेबल करने की एक विधि है। सबसे पहले कोच एट अल द्वारा वर्णित। 1989 में (कोच, जे.ई., कोल्वारा, एस., पीटरसन, के.बी., ग्रेगर्सन, एन., और बोलुंड, आई. (1989) स्वस्थानी में अल्फा उपग्रह डीएनए के गुणसूत्र-विशिष्ट लेबलिंग के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-प्राइमिंग विधियां। क्रोमोसोमा 98, 259 -265). PRINS मछली का एक विकल्प है। इसका उपयोग न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के स्थानीयकरण, मेटाफ़ेज़ या इंटरफ़ेज़ क्रोमोसोम या क्रोमोसोम जोड़े (क्रोमोसोमल एन्यूप्लोइडी सहित) की पहचान और गिनती के लिए किया जाता है। अध्ययन के तहत डीएनए के साथ बिना लेबल वाले प्राइमर (प्राइमर-प्राइमर) को एनीलिंग करना; थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ और लेबल किए गए न्यूक्लियोटाइड्स की मदद से प्राइमर को बढ़ाना; प्रतिक्रिया की समाप्ति (3'-अंत पर एक अवरुद्ध अणु को जोड़ना) प्राइमर : पीसीआर प्रतिबंध टुकड़ा; - अप्रत्यक्ष (बायोटिन / डिग फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एविडिन / एंटी-डिग) - प्रत्येक PRINS प्रतिक्रिया के परिणामों में केवल एक जोड़ी समरूप गुणसूत्र (एक गुणसूत्र) की पहचान की जा सकती है। उसी स्लाइड पर अगली PRINS प्रतिक्रिया पिछली स्लाइड को ब्लॉक करने के बाद ही की जा सकती है। - बड़ी संख्या में दोहराव वाले डीएनए अनुक्रमों के लिए उपयोग किया जाता है।

PRINS के लाभ: 1. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर के संश्लेषण के लिए आवश्यक न्यूनतम अनुक्रम जानकारी की आवश्यकता होती है। 2. किसी गुणसूत्र पर रुचि के अनुक्रम का पता लगाने के लिए सबसे तेज़ और आसान तरीका (भारी मछली जांच का उपयोग करने की तुलना में जो बहुत लंबी अवधि में संकरण करता है)। 3. जांच लेबलिंग चरण का बहिष्करण। 4. लघु अद्वितीय अनुक्रमों का पता लगाने पर सी-प्रिंस सिग्नल को बढ़ाने के लिए लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड के साथ प्राइमर को लंबा करने की क्षमता। कम-कॉपी दोहराव या छोटे अद्वितीय अनुक्रमों की पहचान करने के लिए, एक अधिक संवेदनशील विधि का उपयोग किया जाता है - साइक्लिंग PRINS (c-PRINS)। सी-प्रिन्स का प्रस्ताव गोस्डेन एट अल द्वारा किया गया था। 1991 में, कुबालाकोवा एट अल द्वारा एक बेहतर व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला प्रोटोकॉल। , 2001 (कुबालाकोवा एम, व्राना जे, सिहालिकोवा जे, लिसाक एमए, डोल जे (2001)। PRINS और C-PRINS का उपयोग करके पौधों के गुणसूत्रों पर डीएनए अनुक्रमों का स्थानीयकरण। कोशिका विज्ञान में विधियाँ 23: 71-82)। सी-प्रिंस में पीसीआर के समान थर्मल चक्रों की एक श्रृंखला शामिल है।

मछली के लिए शीथ द्रव: -बीडी बायोसाइंस स्टैंडर्ड (जीएम बेयरलोचर, आई वल्टो, जी डी जोंग, पीएम लैंसडॉर्प। टेलोमेरेस (फ्लो फिश) की औसत लंबाई मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री और फिश। 2006। नेचर प्रोटोकॉल 1, - 2365 - 2376) -40 मी. एम केसीएल + 10 मीटर। म ना. सीएल (व्राना जे, कुबालाकोवा एम, सिमकोवा एच, सिहालिकोवा जे, लिसाक एमए, डोलेज़ेल जे। सामान्य गेहूं में माइटोटिक गुणसूत्रों की प्रवाह छंटाई (ट्रिटिकम एस्टिवम एल।)। जेनेटिक्स। 2000; 156(4): 2033-41) -एमजी . तो डाइथियोथ्रेइटॉल के बिना 4 बफर (एलजे. ली, एल. मा, के. अरुमुगनाथन, वाई.सी. सॉन्ग। फ्लो-सॉर्टेड क्रोमोसोम: प्लांट जीन फिजिकल मैपिंग के लिए एक बढ़िया सामग्री। कैरीलोगिया। 2006, वॉल्यूम। 59, नंबर 2: 99-103 ) -आटोक्लेव्ड 0.1% (wt/vol) Na। सीएल-50एम. म ना. सीएल (एम कुबालाकोवा, पी कोवारोवा, पी सुचानकोवा, जे सिहालिकोवा, जे बार्टोस, एस ल्यूक्रेटी, एन वतनबे, एसएफ कियानियन, जे डोलेज़ेल। टेट्राप्लोइड गेहूं में क्रोमोसोम सॉर्टिंग और जीनोम विश्लेषण के लिए इसकी क्षमता। जेनेटिक्स। 2005, 170(2): 823-829) - क्रोमोसोम-स्थिरीकरण पॉलीमाइन बफर (प्रोटीन युक्त शीथ द्रव) (डारज़िनकीविक्स जेड, रॉबिन्सन जेपी, क्रिसमैन एच। फ्लो साइटोमेट्री, दूसरा संस्करण। भाग बी। सैन डिएगो, सीए। अकादमिक प्रेस, इंक। 1994)

स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति

फ्लोरोसेंट संकरण बगल में , या मछली विधि (इंग्लैंड। रोशनी बगल में संकरण - मछली ) - एक साइटोजेनेटिक विधि जिसका उपयोग मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों पर या इंटरफ़ेज़ नाभिक में एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की स्थिति का पता लगाने और निर्धारित करने के लिए किया जाता है बगल में. इसके अलावा, ऊतक के नमूने में विशिष्ट एमआरएनए का पता लगाने के लिए फिश का उपयोग किया जाता है। बाद के मामले में, फिश विधि कोशिकाओं और ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की स्पेटियोटेम्पोरल विशेषताओं को स्थापित करना संभव बनाती है।

जांच

फ्लोरोसेंट संकरण के साथ बगल मेंडीएनए जांच (डीएनए जांच) का उपयोग करें जो नमूने में पूरक लक्ष्यों से जुड़ती है। डीएनए जांच में फ़्लोरोफ़ोर्स (प्रत्यक्ष लेबलिंग) या बायोटिन या डिगॉक्सिजेनिन (अप्रत्यक्ष लेबलिंग) जैसे संयुग्मों के साथ लेबल किए गए न्यूक्लियोसाइड होते हैं। प्रत्यक्ष लेबलिंग के साथ, लक्ष्य से जुड़ी डीएनए जांच को संकरण पूरा होने के तुरंत बाद एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा जा सकता है। अप्रत्यक्ष लेबलिंग के मामले में, एक अतिरिक्त धुंधला प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जिसके दौरान फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एविडिन या स्टेपविडिन का उपयोग करके बायोटिन का पता लगाया जाता है, और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके डिगॉक्सिजेनिन का पता लगाया जाता है। यद्यपि डीएनए नमूनों को लेबल करने के अप्रत्यक्ष संस्करण में अतिरिक्त अभिकर्मकों और समय की आवश्यकता होती है, यह विधि आमतौर पर एंटीबॉडी या एविडिन अणु पर 3-4 फ्लोरोक्रोम अणुओं की उपस्थिति के कारण उच्च सिग्नल स्तर प्राप्त करती है। इसके अलावा, अप्रत्यक्ष लेबलिंग के मामले में, सिग्नल का कैस्केड प्रवर्धन संभव है।

डीएनए नमूने बनाने के लिए, क्लोन किए गए डीएनए अनुक्रम, जीनोमिक डीएनए, पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पाद, लेबल किए गए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और माइक्रोडिसेक्शन द्वारा प्राप्त डीएनए का उपयोग किया जाता है।

जांच की लेबलिंग विभिन्न तरीकों से की जा सकती है, उदाहरण के लिए, निक-ट्रांसलेशन द्वारा या लेबल किए गए न्यूक्लियोटाइड के साथ पीसीआर द्वारा।

संकरण प्रक्रिया

फ्लोरोसेंट संकरण पर प्रयोग की योजना बगल मेंनाभिक में जीन की स्थिति का पता लगाना

पहला चरण जांच का डिज़ाइन है। किसी विशिष्ट स्थल पर संकरण करने के लिए जांच का आकार इतना बड़ा होना चाहिए, लेकिन बहुत बड़ा नहीं (1 केबी से अधिक नहीं) ताकि संकरण प्रक्रिया में हस्तक्षेप न हो। विशिष्ट लोकी की पहचान करते समय या पूरे गुणसूत्रों को धुंधला करते समय, संकरण मिश्रण में बिना लेबल वाले डीएनए दोहराव (उदाहरण के लिए, सीओटी -1 डीएनए) जोड़कर गैर-अद्वितीय दोहराव वाले डीएनए अनुक्रमों के साथ डीएनए जांच के संकरण को अवरुद्ध करना आवश्यक है। यदि डीएनए जांच डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए है, तो संकरण से पहले इसे विकृत किया जाना चाहिए।

अगले चरण में, इंटरफ़ेज़ नाभिक या मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों की तैयारी तैयार की जाती है। कोशिकाएं एक सब्सट्रेट पर, आमतौर पर कांच की स्लाइड पर स्थिर होती हैं, जिसके बाद डीएनए विकृतीकरण होता है। गुणसूत्रों या नाभिकों की आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए, फॉर्मामाइड की उपस्थिति में विकृतीकरण किया जाता है, जिससे विकृतीकरण तापमान को 70° तक कम करना संभव हो जाता है।

बाध्य डीएनए जांच का दृश्य एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता कई कारकों पर निर्भर करती है - जांच की लेबलिंग दक्षता, जांच का प्रकार और फ्लोरोसेंट डाई का प्रकार।

साहित्य

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टिप्पणियाँ

विकिमीडिया फ़ाउंडेशन. 2010 .

देखें अन्य शब्दकोशों में "फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन" क्या है:

इस शब्द के अन्य अर्थ हैं, संकरण देखें। डीएनए संकरण, एक अणु में पूरक एकल-फंसे न्यूक्लिक एसिड के इन विट्रो संयोजन में न्यूक्लिक एसिड का संकरण। पूर्ण संपूरकता के साथ ... ...विकिपीडिया

निर्धारण की विधि सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट।

अध्ययनाधीन सामग्री विवरण में देखें

घर का दौरा उपलब्ध है

अध्ययन का उपयोग स्तन कैंसर या गैस्ट्रिक कैंसर के लिए व्यक्तिगत सहायक कीमोथेरेपी का चयन करने के लिए किया जाता है।

महिलाओं में होने वाली ऑन्कोलॉजिकल बीमारियों में स्तन कैंसर (बीसी) पहले स्थान पर है। स्तन ट्यूमर कोशिकाओं में विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स हो सकते हैं जो कुछ पदार्थों (हार्मोन या अन्य जैविक रूप से सक्रिय अणुओं) के प्रति संवेदनशील होते हैं। ट्यूमर कोशिकाओं में हार्मोन रिसेप्टर्स (एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन) या मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर टाइप 2 (ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2, एचईआर 2) की उपस्थिति के आधार पर, हार्मोन-रिसेप्टर-पॉजिटिव, एचईआर 2-पॉजिटिव और ट्रिपल नेगेटिव स्तन कैंसर को अलग किया जाता है। . चिकित्सा के व्यक्तिगत चयन और उपचार की सफलता की भविष्यवाणी करते समय इसे ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है।

HER2 एक रिसेप्टर है जो ऊतकों में मौजूद होता है और सामान्य रूप से कोशिका विभाजन और विभेदन के नियमन में शामिल होता है। ट्यूमर कोशिकाओं की सतह पर इसकी अधिकता (हाइपरएक्सप्रेशन) नियोप्लाज्म की तेजी से अनियंत्रित वृद्धि, मेटास्टेसिस का एक उच्च जोखिम और कुछ प्रकार के उपचार की कम प्रभावशीलता को निर्धारित करती है। स्तन कैंसर के कुछ उपप्रकारों में एचईआर2 की अतिअभिव्यक्ति से प्रसार और एंजियोजेनेसिस में वृद्धि होती है, साथ ही एपोप्टोसिस (कोशिकाओं का आनुवंशिक रूप से क्रमादेशित आत्म-विनाश) का विनियमन भी होता है। वर्तमान में, ऐसी दवाएं हैं जो HER2 रिसेप्टर को लक्षित करती हैं। यह, विशेष रूप से, हर्सेप्टिन (ट्रैस्टुजुमैब) है, जो एचईआर2/न्यू रिसेप्टर्स के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है।

HER2 (ErbB-2) ऑन्कोजीन का प्रवर्धन और अतिअभिव्यक्ति स्तन कार्सिनोमा के लिए अपेक्षाकृत विशिष्ट घटनाएं हैं और व्यावहारिक रूप से अन्य स्थानीयकरण के ट्यूमर में नहीं होती हैं। गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कुछ अपवादों में से एक है: एचईआर2 सक्रियण इस अंग के घातक नवोप्लाज्म के लगभग 10-15% मामलों में नोट किया जाता है और रोग के आक्रामक पाठ्यक्रम से संबंधित होता है। एचईआर2 पॉजिटिव स्तन कैंसर में, ट्यूमर कोशिकाओं की सतह पर एचईआर2 रिसेप्टर्स की अधिकता मौजूद हो सकती है (जिन्हें एचईआर2 पॉजिटिव या हर्सेप्ट पॉजिटिव कहा जाता है)। यह घटना स्तन कैंसर से पीड़ित 15-20% महिलाओं में देखी जाती है। उपचार की रणनीति निर्धारित करने के लिए HER2 स्थिति का आकलन महत्वपूर्ण है।

HER2/neu अतिअभिव्यक्ति और/या HER2/neu जीन के प्रवर्धन का पता लगाने के लिए मुख्य मानकीकृत तरीके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (IHC) विधि और स्वस्थानी संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति हैं। दोनों अध्ययन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (आईएचसी), फ्लोरोसेंट जांच (फिश) और विभिन्न इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल तैयारी (पैराफिन में एम्बेडेड ट्यूमर सामग्री के अनुभाग) पर किए जाते हैं।

आईएचसी प्रतिक्रिया के परिणामों का मूल्यांकन करते समय, अभिव्यक्ति को केवल ट्यूमर के आक्रामक घटक में ध्यान में रखा जाता है। प्रतिक्रिया परिणामों का मूल्यांकन स्कोरिंग स्केल का उपयोग करके किया जाता है: 0, 1+, 2+, 3+, परीक्षण निर्माता द्वारा विकसित और विशेषज्ञों द्वारा अनुमोदित। हर्सेप्ट स्थिति, जिसे 0 और 1+ के रूप में मूल्यांकित किया गया है, को नकारात्मक माना जाना चाहिए - प्रोटीन की कोई अतिअभिव्यक्ति नहीं है, जो इसके जीन के प्रवर्धन की अनुपस्थिति से संबंधित है। हर्सेप्ट स्थिति, जिसे 3+ के रूप में मूल्यांकित किया गया है, सकारात्मक है, यानी प्रोटीन ओवरएक्प्रेशन मौजूद है, जो जीन प्रवर्धन की उपस्थिति से संबंधित है। हर्सेप्ट स्थिति 2+ को अनिश्चित माना जाता है, यानी, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया के आधार पर निर्धारित प्रोटीन अभिव्यक्ति को जीन प्रवर्धन पर आत्मविश्वास से नहीं आंका जा सकता है, इसलिए, एक अध्ययन की आवश्यकता है जो सीधे प्रवर्धन की उपस्थिति या अनुपस्थिति को प्रकट करता है। फिश विधि का उपयोग उसी नमूने (ब्लॉक) के अनुभागों पर किया जाता है जिस पर इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन किया गया था। मछली संकरण में, HER2 जीन प्रवर्धन की उपस्थिति का आकलन लाल फ्लोरोसेंट (लेबल HER2 जीन के अनुरूप) और हरे फ्लोरोसेंट संकेतों के अनुपात की गणना करके किया जाता है जो 17वें गुणसूत्र के सेंट्रोमेरिक क्षेत्र को लेबल करते हैं। 2 से अधिक अनुपात HER2 प्रवर्धन की उपस्थिति को इंगित करता है। फिश विधि आईएचसी की तुलना में अधिक संवेदनशील है, क्योंकि यह प्रवर्धन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का प्रत्यक्ष मूल्यांकन करने की अनुमति देती है।

अनुसंधान के लिए सामग्री: ट्यूमर बायोप्सी के साथ पैराफिन ब्लॉक।

ध्यान! अनिवार्य रूप से:

• HER2/neu के प्रति एंटीबॉडी के साथ IHC-स्टेनिंग के साथ ग्लास स्लाइड
• किसी डॉक्टर से रेफरल या हर-2/न्यू के प्रति एंटीबॉडी के साथ हिस्टोलॉजिकल और आईएचसी अध्ययन के परिणामों के साथ एक अर्क

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