Hibridação fluorescente in situ. Hibridização fluorescente in situ (FISH)

Em alguns casos, um estudo citogenético não é suficiente para uma conclusão sobre o cariótipo, nestes casos, são utilizados métodos de citogenética molecular, em particular, hibridização in situ por fluorescência (Inglês - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

O surgimento de novas tecnologias em citogenética molecular, baseadas principalmente na hibridização in situ de ácidos nucleicos, ampliou significativamente as possibilidades de diagnóstico cromossômico. O método de hibridização in situ foi desenvolvido para localizar sequências de DNA específicas diretamente em preparações citológicas. Houve uma transição na identificação de cromossomos e regiões cromossômicas da análise da organização citológica do cromossomo para a análise das sequências de DNA que os compõem. A comparação da eficácia dos métodos citológicos clássicos para detectar e analisar rearranjos cromossômicos, como a coloração diferencial de cromossomos, com as modernas tecnologias de citogenética molecular mostrou que, em distúrbios hematológicos, a análise citológica de cromossomos detecta e identifica corretamente apenas cerca de um terço dos rearranjos cromossômicos detectados usando cariotipagem espectral (SKY). Cerca de um terço dos rearranjos são identificados incorretamente por métodos citológicos e um terço permanece completamente despercebido. Os métodos clássicos de análise citogenética permitem detectar apenas cerca de 15% dos rearranjos cromossômicos identificados pelo SKY.

O método FISH usa moléculas fluorescentes para corar genes ou cromossomos in vivo. O método é usado para mapeamento de genes e identificação de aberrações cromossômicas.

A técnica começa com a preparação de sequências curtas de DNA, chamadas de sondas, que são complementares às sequências de DNA que representam o objeto de estudo. As sondas hibridizam (se ligam) a regiões complementares do DNA e, por serem marcadas com um marcador fluorescente, permitem ver a localização de genes de interesse no DNA ou cromossomos. Ao contrário de outros métodos de estudo de cromossomos que requerem divisão celular ativa, o FISH pode ser realizado em células que não se dividem, tornando o método flexível.

O FISH pode ser aplicado para vários fins usando três tipos diferentes de sondas:

* sondas específicas de locus que se ligam a certas partes dos cromossomos. Essas sondas são usadas para identificar a sequência curta disponível de DNA isolado, que é usada para preparar uma sonda marcada e sua subsequente hibridização com um conjunto de cromossomos;
* As sondas de repetição alfa ou centroméricas são sequências repetidas de regiões centroméricas de cromossomos. Com a ajuda deles, cada cromossomo pode ser pintado em uma cor diferente, o que permite determinar rapidamente o número de cromossomos e os desvios do número normal;
* As sondas para o cromossomo inteiro são um conjunto de pequenas sondas que são complementares a partes individuais do cromossomo, mas em geral cobrem todo o seu comprimento. Usando uma biblioteca de tais sondas, pode-se "colorir" todo o cromossomo e obter um cariótipo espectral diferencial de um indivíduo. Esse tipo de análise é usado para analisar aberrações cromossômicas, como translocações, quando um pedaço de um cromossomo é transferido para o braço de outro.

Hibridização in situ com marcação fluorescente (FISH)

O material para o estudo é sangue, medula óssea, biópsia tumoral, placenta, tecidos fetais ou líquido amniótico. As amostras para análise devem ser entregues frescas ao laboratório. As preparações (lâminas) são preparadas diretamente a partir de amostras de tecido ou após seu cultivo. Podem ser utilizadas preparações de células em metáfase e em interfase. Sondas de DNA específicas marcadas com marcadores fluorescentes hibridizam com DNA cromossômico, e várias sondas podem ser usadas simultaneamente em diferentes loci.

FISH é um método útil e sensível de análise citogenética na detecção de aberrações cromossômicas quantitativas e qualitativas, como deleções (incluindo microdeleções), translocações, duplicação e aneuploidia. FISH em cromossomos interfásicos é um método rápido para o diagnóstico pré-natal de trissomia 21, 18 ou 13 ou aberrações de cromossomos sexuais. Em oncologia, o FISH pode detectar uma série de translocações (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1) associadas a malignidades hematológicas. O método também pode ser usado para monitorar os efeitos residuais do câncer após quimioterapia e transplante de medula óssea e para detectar oncogenes aprimorados (c-myc/n-myc) associados a um prognóstico ruim para alguns tumores. O FISH também é usado para monitorar a sobrevivência de um aloenxerto de medula óssea obtido de um indivíduo do sexo oposto.

FISH é um método sensível para identificar aberrações cromossômicas e para análise rápida de grandes números de células (> 500) de uma só vez. O método é altamente preciso na identificação da natureza dos cromossomos e fragmentos desconhecidos de DNA cromossômico.

Citogenética tradicional ao estudar o cariótipo, sempre foi limitado pelo nível de resolução da banda. Mesmo com a coloração diferencial de cromossomos de alta resolução, encontramos apenas mais bandas por cromossomo, mas não tínhamos certeza de que estávamos chegando ao nível molecular de resolução. Os recentes avanços na tecnologia do DNA e na citogenética tornaram possível o uso de métodos FISH para analisar alterações no DNA cromossômico em nível molecular. A citogenética molecular proporcionou um avanço revolucionário na citogenética, permitindo:

Analisar a estrutura do DNA de cromossomos na faixa de 10-100 quilobases;
para diagnosticar células de interfase que não se dividem, o que teve um enorme impacto no diagnóstico pré-natal e no diagnóstico genético pré-implantação (PGD).

Tecnologia FISH usa uma sonda de DNA que liga ou renatura sequências de DNA específicas dentro de um cromossomo. A sonda desnaturada é incubada com DNA celular nativo, também desnaturado para um estado de fita simples. A sonda substitui o trifosfato de desoxiuridina de biotina ou trifosfato de uridina de digoxigenina por timidina. Após a renaturação do DNA nativo pela sonda, o complexo sonda-DNA pode ser detectado pela adição de avidina de ligação à biotina marcada com fluorocromo ou antidigoxigenina marcada com fluorocromo. A amplificação de sinal adicional pode ser obtida adicionando antiavidina e examinando o complexo resultante usando microscopia de fluorescência. Ao marcar diferentes sondas de DNA com vários fluorocromos diferentes, vários cromossomos ou segmentos de cromossomos dentro de uma única célula podem ser visualizados simultaneamente como sinais multicoloridos.

Capacidade de definir segmentos de genes específicos, presentes ou ausentes nos cromossomos, possibilitaram o diagnóstico de síndromes de sequências gênicas em nível de DNA, bem como translocações em núcleos interfásicos, muitas vezes em células individuais.

material para PEIXE tanto cromossomos metafásicos obtidos de células em divisão quanto núcleos interfásicos de células que não estão no estágio de divisão podem servir. As seções são pré-tratadas com RNase e proteinase para remover o RNA que pode hibridizar de forma cruzada com a sonda e a cromatina. Eles são então aquecidos em formamida para desnaturar o DNA e fixados com álcool gelado. A sonda é então preparada para hibridização por aquecimento. Depois disso, a sonda e a preparação do cromossomo são misturadas e seladas com uma lamela a 37 ° C para hibridização. Ao alterar a temperatura de incubação ou a composição salina da solução de hibridização, a especificidade de ligação pode ser aumentada e a marcação de fundo pode ser reduzida.

Aplicação de hibridização in situ fluorescente - tecnologia FISH

A eficácia da tecnologia FISH foi demonstrado pela primeira vez localizando genes para . Com a introdução do método de marcação fluorescente, a hibridização in situ tornou-se indispensável para o diagnóstico de anomalias cromossômicas que não são detectadas pelos métodos tradicionais de bandeamento. O FISH também desempenhou um papel fundamental em uma das descobertas mais extraordinárias da genética moderna, o imprinting genômico.

Sua tecnologia de desenvolvimento PEIXE recebido em três formas. As sondas centroméricas ou alfa-satélites são caracterizadas por relativa especificidade cromossômica; elas foram usadas com mais frequência na genética de células em interfase. Essas sondas geram sinais um tanto difusos de força adequada na região do centrômero, mas não hibridizam de forma cruzada com cromossomos com sequências centroméricas semelhantes. Atualmente, foram desenvolvidas sondas de cópia única que fornecem um sinal discreto de uma banda cromossômica específica e permitem evitar o fenômeno de hibridização cruzada. Essas sondas também podem ser usadas para determinar o número de cópias e regiões cromossômicas específicas suspeitas de estarem associadas a uma síndrome específica. Sondas de cópia única e centroméricas projetadas para os cromossomos 13, 18, 21, X e Y são usadas para diagnóstico pré-natal.

Também é possível "manchar" cromossomos inteiros com PEIXE. Graças à tecnologia de cariotipagem espectral, que usa uma mistura de diferentes fluorocromos, agora é possível criar um padrão fluorescente único para cada cromossomo individual com 24 cores individuais. Esta tecnologia permite determinar rearranjos cromossômicos complexos que não são visíveis usando técnicas tradicionais de citogenética.

Método PEIXE no diagnóstico pré-natal. Para as mulheres em idade reprodutiva mais avançada, a gravidez pode ser motivo não tanto de alegria, mas de preocupação. Com a idade de uma mulher, o risco de desenvolver anormalidades cromossômicas do feto está associado. A amniocentese, realizada na 16ª semana de gravidez, seguida da análise do cariótipo, leva de 10 a 14 dias. A utilização do FISH no pré-exame permite um diagnóstico mais rápido e tempos de espera reduzidos. A maioria dos geneticistas e laboratórios são da opinião de que o método FISH não deve ser usado isoladamente para tomar decisões sobre o manejo futuro de uma gravidez. O método FISH deve ser complementado pela análise cariotípica, e seus resultados devem, no mínimo, correlacionar-se com o quadro patológico da ultrassonografia (ultrassom) ou triagem bioquímica do sangue da mãe.

Síndromes de genes sequências também conhecidas como síndromes de microdeleção ou aneusomia segmentar. São deleções de fragmentos adjacentes de um cromossomo, geralmente envolvendo muitos genes. As síndromes de sequência gênica foram descritas pela primeira vez em 1986 usando técnicas citogenéticas clássicas. Agora, graças ao FISH, é possível identificar deleções submicroscópicas no nível do DNA, o que possibilitou identificar a menor região deletada associada ao desenvolvimento de uma determinada síndrome, chamada de região crítica. Uma vez identificada a região crítica para uma síndrome, muitas vezes é possível identificar genes específicos cuja ausência é considerada associada à síndrome. Um guia recente para síndromes de sequência de genes relata 18 síndromes de deleção e microdeleção associadas a 14 cromossomos. Algumas das síndromes de sequência gênica mais comuns e suas manifestações clínicas são mostradas na Tabela. 5-2.

Telômeros- formações que cobrem as extremidades dos braços longo e curto dos cromossomos. Eles consistem em repetir sequências de TTAGGG e impedir que as extremidades dos cromossomos se fundam. As sondas teloméricas desempenham um papel importante no reconhecimento de translocações complexas que não podem ser determinadas por métodos citogenéticos tradicionais. Além disso, uma das descobertas do Projeto Genoma Humano foi o fato de as regiões dos cromossomos adjacentes aos telômeros serem ricas em genes. Já foi demonstrado que deleções subteloméricas submicroscópicas são responsáveis pela ocorrência de muitas doenças geneticamente determinadas.

Hibridização in situ de ácidos nucleicos O método baseia-se na possibilidade de formar híbridos de fita dupla entre sondas marcadas criadas artificialmente com base em sequências de fita simples (ribo ou desoxirribo, oligo ou polinucleotídeo) e sequências complementares a elas em alvos - moléculas de DNA ou RNA analisadas. Para identificar os sítios de hibridização, uma sonda de DNA (sonda de DNA) é marcada com um grupo repórter: ü um isótopo radioativo, ü um fluorocromo, ü uma enzima que dá uma coloração ou um produto luminescente, ü um hapteno com o qual o corpo marcado se liga, etc.

Ao detectar um híbrido devido à presença de um grupo repórter na sonda, pode-se - estimar o número de genes que codificam um determinado tipo de RNA, - determinar a proporção de DNA não transcrito no genoma, - estabelecer a ligação de determinados genes entre si - e sua localização exata nos cromossomos. O método de hibridização molecular tem alta sensibilidade (é possível detectar uma pequena quantidade de uma sonda marcada (10 -15 e 10 -19 M) e, consequentemente, sua sequência complementar no alvo) e análise rápida, o que torna possível usar este método tanto para atividades de pesquisa quanto para o diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas em medicina, medicina veterinária e produção agrícola.

Citogenética interfásica: 1. Bandamento cromossômico multicolorido (MCB). 2. Hibridização fluorescente in situ (FISH). 3. Combinação de FISH com outros métodos: -citologia + FISH; -histologia + FISH; -imunofenotipagem + FISH (FICTION); Citogenética metafásica: 1. Coloração sólida dos cromossomas (pintura completa). 2. Hibridização genômica comparativa (CGH). 3. Cariotipagem de mudança de cor (CCK). 4. Cariotipagem multicolorida: Cariotipagem espectral (SKY); PEIXE multicolorido (M - PEIXE, M - BANDA).

FISH – hibridização in situ fluorescente – é um método citogenético utilizado para detecção e localização de sequências específicas de DNA em cromossomos, mRNA, etc. A técnica baseia-se na hibridização de uma sonda de DNA/RNA marcada por fluorescência com uma sequência complementar de DNA/RNA. O marcador é detectado usando um microscópio fluorescente. O método FISH foi introduzido há mais de 30 anos. Tornou-se difundido como um método de mapeamento físico de genes em cromossomos. Posteriormente, foi aplicado em outras áreas de pesquisa (nas áreas de genética clínica, medicina reprodutiva, toxicologia, biologia evolutiva, genômica comparativa e celular e biologia cromossômica). Atualmente, o FISH é usado principalmente para construir mapas físicos e genéticos de cromossomos, para detectar rearranjos estruturais, translocações, microdeleções, amplificações gênicas em cromossomos interfásicos e metafásicos. Como resultado dos avanços da ciência (melhor compreensão das propriedades químicas e físicas dos ácidos nucleicos e cromatina), bem como o desenvolvimento da microscopia de fluorescência e imagem digital, o método tem sido constantemente aprimorado (melhorias na sensibilidade, especificidade, resolução) e muitas variações deste método foram desenvolvidas.

1) As células são colocadas em uma lâmina de vidro fazendo com que os cromossomos se espalhem 4) Os cromossomos são contra-corados usando DAPI 2) A sonda marcada com fluorescência é colocada nos cromossomos e selada. 3) A sonda e os cromossomos são desnaturados, hibridizados e depois lavados 5) A lâmina é vista sob um microscópio fluorescente

A visão geral do protocolo de montagem do FISH pode ser representada da seguinte forma: 1. Preparação de uma preparação histológica ou citológica. A preparação de uma preparação histológica é realizada de acordo com o esquema padrão: corte, marcação, fiação, vazamento, microtomia, colocação do corte em lâmina de vidro e desparafinização. Ao preparar uma preparação citológica, são utilizadas soluções precipitantes especiais e centrifugação, o que permite obter uma suspensão celular concentrada. 2. Pré-tratamento (se necessário). A preparação é processada por proteases para eliminar a presença de proteínas que dificultam a hibridização. 3. Aplicação de uma sonda de DNA à preparação e posterior desnaturação. Para desnaturar a sonda e o DNA da amostra, eles são tratados com formamida e aquecidos a uma temperatura de cerca de 85-900 C.

4. Hibridação. Após a desnaturação, o fármaco é resfriado a uma determinada temperatura (370 C no caso de estudos clínicos) e incubado em câmara úmida por várias horas (a duração da incubação é indicada em cada protocolo específico). Atualmente, hibridizadores automáticos são usados para desnaturação e hibridização. 5. Lavagem. Quando a hibridização estiver concluída, as sondas não ligadas devem ser lavadas, o que, de outra forma, criaria um fundo que dificultaria a avaliação dos resultados FISH. Para a lavagem, geralmente é usada uma solução contendo citrato e cloreto de sódio (SSC). 6. Contra-coloração. Com a ajuda de corantes fluorescentes (DAPI - 4, 6-diamidin-2 fenilindol; iodeto de propídio), todo o DNA nuclear é corado. 7. Análise dos resultados usando um microscópio fluorescente As operações de rotina (desparafinização, pré-tratamento, lavagem) podem ser automatizadas.

Exame de regiões teloméricas usando um microscópio fluorescente. As imagens obtidas na fase de interfase (núcleo) e metáfase (cromossomos individuais) são combinadas. cor azul - DAPI.

Vantagens do método FISH: 1. Possibilidade de estudo de material genético em núcleos interfásicos; 2. A obtenção de resultados objetivos em uma base sim/não é um método quantitativo 3. Interpretação relativamente simples dos resultados, alta resolução Desvantagens do método FISH: 1. Os corantes fluorescentes "desaparecem" rapidamente; microscópio.

O método FISH baseia-se na reação de hibridização entre uma sonda de DNA criada com tecnologias especiais, que é uma sequência de nucleotídeos de tamanho limitado, e uma seção complementar do DNA nuclear da preparação citogenética em estudo. A sonda de DNA é o principal elemento para configurar o FISH e carrega um "rótulo", ou seja, contém nucleotídeos que estão diretamente ligados a um fluorocromo ou a um hapteno para posterior visualização por anticorpos portadores de um fluorocromo. O DNA marcado não ligado é lavado e, em seguida, a sonda de DNA hibridizada é detectada usando um microscópio fluorescente.

A marcação do DNA é dividida em direta e indireta. A marcação direta introduz elementos repórteres no DNA - fluorocromos (rodamina, dietilaminocumarina, vermelho do Texas, etc.). Método de marcação indireta - uma amostra de DNA é pré-conjugada com ligantes intermediários (biotina, dioxigenina, 2, 4-dinitrofenol), cuja presença em uma preparação citológica é então detectada usando fluorocromos. Nesse caso, a sensibilidade do método aumenta muito, pois o ligante pode conter vários sítios de interação com o fluorocromo. A hibridização in situ com uma sonda marcada com 32P foi descrita pela primeira vez em 1969. O desenvolvimento de sistemas não radioativos para marcação e detecção de sondas de DNA tornou o método de hibridização in situ seguro, fácil de realizar e menos trabalhoso no processamento dos resultados. Os corantes fluorescentes são macios e fáceis de usar, podem ser armazenados indefinidamente, fornecem alta resolução e permitem que várias sequências de DNA sejam examinadas simultaneamente.

Sondas: sondas primárias/secundárias de DNA/RNA de fita simples/dupla. As sondas são marcadas: 1) diretamente: inserindo nucleotídeos aos quais um fluorocromo está ligado (PCR ou nick translation) 2) através de uma molécula repórter (ex: digoxigenina, biotina) à qual estão ligados anticorpos marcados com fluorescência. Para melhorar o sinal, você pode usar anticorpos secundários, terciários, etc. marcados com um marcador fluorescente. DNase nicks DNA Nick Translation A DNA polimerase I adiciona novos nucleotídeos à 3' hidroxil DNA polimerase I remove as bases individuais da imagem cromossômica da extremidade 5': usando DAPI (2 mg/ml). 4', 6-diamidino-2-fenilindol; forte ligação a regiões de DNA ricas em A-T; excitação com luz UV; emissão 461 nm (azul).

Atualmente, existem várias abordagens principais que são amplamente utilizadas pela citogenética molecular moderna: Identificação do material de regiões cromossômicas estendidas e cromossomos inteiros. Detecção na região de interesse de uma sequência de DNA específica. Análise do desequilíbrio de regiões cromossômicas individuais. Para identificar o material de regiões cromossômicas estendidas e cromossomos inteiros, sondas de DNA específicas de cromossomos e regiões específicas (“sondas de pintura”) são amplamente utilizadas.

Características de diferentes tipos de sondas 1. Sondas específicas de locus (LSI - locus - identificadores específicos que se ligam a certas regiões dos cromossomos.) Essas sondas são usadas para identificar a sequência curta (não repetitiva) disponível de DNA isolado, que é usada preparar uma sonda marcada e sua posterior hibridização com conjunto de cromossomos. Eles são projetados para detectar aberrações cromossômicas significativas de diagnóstico e prognóstico em várias condições patológicas (monossomia e trissomia para cromossomos individuais). O uso mais difundido dessas amostras foi obtido no diagnóstico citogenético pré-natal, especialmente em estudos de células do tecido coriônico e núcleos interfásicos de amniócitos.

2. As sondas de DNA para as regiões teloméricas dos cromossomos (TEL telomericprobe) são projetadas para detectar deleções e rearranjos que afetam as regiões terminais dos braços cromossômicos. Tais sondas são específicas para os braços p ou q dos cromossomos e são complementares a uma região de cerca de 300 kb de comprimento. da extremidade do cromossomo. Como regra, as sondas de DNA para braços curtos e longos de cromossomos estão associadas a diferentes fluorocromos, o que torna possível detectar ambas as regiões teloméricas do cromossomo em uma preparação citogenética.

3. Sondas de repetição de centrômeros, numeradores alfa ou cromossômicos (CEP - centrômero. Enumeração. Sonda) são sondas de DNA cromossômicas específicas representadas por sequências de repetições satélites alfa e beta em tandem. Essas repetições estão localizadas predominantemente nas regiões de heterocromatina centromérica ou pericentromérica dos cromossomos. Com a ajuda deles, cada cromossomo pode ser pintado em uma cor diferente, o que permite determinar rapidamente o número de cromossomos e os desvios de seu número normal, complementares a seções individuais do cromossomo, mas como um todo cobrindo todo o seu comprimento. Usando uma biblioteca de tais sondas, pode-se "colorir" todo o cromossomo e obter um cariótipo espectral diferencial de um indivíduo. Esse tipo de análise é usado para analisar aberrações cromossômicas, como translocações, quando um pedaço de um cromossomo é transferido para o braço de outro.

Aplicações FISH é amplamente utilizado para resolver as seguintes tarefas de diagnóstico clínico: 1. Perimplantação pré-natal e diagnóstico de anomalias cromossômicas. Usado em clínicas de fertilização in vitro (FIV) e centros perinatais. Permite atempadamente (antes da implantação do embrião no caso de FIV ou nas fases iniciais do desenvolvimento fetal) identificar distúrbios genéticos no nascituro e tomar as medidas necessárias. 2. Oncohematologia. As doenças oncohematológicas surgem como resultado de várias aberrações cromossômicas, portanto, sondas CEP e LSI apropriadas são usadas para seu diagnóstico. 3. Diagnóstico de tumores sólidos. Atualmente, cada vez mais relações causais estão sendo estabelecidas entre o desenvolvimento de cânceres específicos e alterações específicas no genoma para eles. Portanto, ao usar sondas de DNA apropriadas, é possível realizar diagnósticos oncológicos de FISH.

Citogenética de interfase: Combinação de FISH com outros métodos: - Imunofenotipagem de FISH (FICTION); + FICÇÃO (Imunofenotipagem de Fluorescência e Citogenética de Interfase como Ferramenta para Investigação de Neoplasias) - para o estudo de células tumorais. Para esta análise, são utilizados esfregaços não corados de sangue, medula óssea ou preparações de outros tecidos. Etapa 1 - as preparações são incubadas com anticorpos monoclonais específicos, etapa 2 - é realizada a conjugação com fluoróforos para posterior visualização do complexo antígeno-anticorpo monoclonal. Etapa 3 - realizar a hibridização in situ com sondas de DNA. Fluoróforos que diferem em cores são usados para detectar anticorpos monoclonais e sondas de DNA. O estudo da preparação sob um microscópio fluorescente com o conjunto de filtros necessários permite a análise simultânea do imunofenótipo de hibridização e sinais em núcleos interfásicos.

Deleção cromossômica de TNFAIP 3 em c. HL detectado por citogenética interfásica. FICÇÃO análises de. representante c. Casos HL combinados. Expressão de CD 30 (vermelho) e sondas FISH para TNFAIP 3 e centrômero do cromossomo 6 (azul [b]). Nos ensaios de dupla cor em A–C e E e F, a sonda TNFAIP 3 é marcada em verde (g); no ensaio de cor tripla aplicado em D, a sonda TNFAIP 3 dá um sinal g/laranja colocalizado (co). Duas estratégias diferentes são usadas para exibir ensaios FISH de duas e três cores em combinação com imunofluorescência de CD 30; eu. e. , os ensaios de duas cores (A–C e E e F) são mostrados usando um display de três cores, enquanto um display multicolor falso obtido pelo software Isis é aplicado para o ensaio de três cores (D) para mostrar simultaneamente quatro cores ( ou seja, CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] e laranja, e centrômero do cromossomo 6 [b]).

A gravação digital de microimagens abriu a possibilidade de converter em pseudocores não apenas combinações de fluoróforos, mas também suas proporções, intensidades

Coloração multicolorida de cromossomos (Muli. Color Banding - MSV) Este método não se destina a uma análise completa de todos os cromossomos, mas a uma análise detalhada de um único cromossomo. As sondas de DNA específicas do locus são marcadas com diferentes fluoróforos ou combinações de fluoróforos para que o nível de sinal de cada uma das sondas de DNA varie em intensidade. Perfis de intensidade de sobreposição de sinais de sonda de DNA fornecem variações nas proporções de intensidades de fluorescência de diferentes fluoróforos ao longo do cromossomo. As razões de intensidade podem ser traduzidas em pseudocores, e assim, cada ponto da imagem e, consequentemente, cada um dos loci cromossômicos, terá sua própria pseudocor. Esta versão do método FISH multicolorido mostrou-se altamente eficaz na análise de rearranjos não apenas intercromossômicos, mas também intracromossômicos em doenças oncológicas. No entanto, para sua aplicação bem sucedida, é necessário primeiro determinar o cromossomo que será investigado. Este método de citogenética molecular é adequado para a análise de distúrbios do cariótipo associados a certos cromossomos.

Até o momento, foram criados conjuntos de sondas de DNA que fornecem MCV para todos os cromossomos humanos no cromossomo 5; bandas multicoloridas do cromossomo 5; idiograma do cromossomo 5; fluorocromos usados para MSV).

A citogenética metafásica, que historicamente surgiu antes da citogenética interfásica, permite determinar uma ampla gama de desordens cromossômicas, mas isso requer que as células em estudo estejam na fase metafásica da meiose.

Cariotipagem multicolorida A análise é realizada com sondas de DNA de coloração contínua para os braços ou cromossomos inteiros (sondas WCP - pintura de cromossomos inteiros). Tais sondas hibridizam com numerosas sequências curtas de DNA localizadas ao longo de todo o comprimento do cromossomo. Assim, quando visto sob um microscópio fluorescente, o cromossomo aparece uniformemente corado em uma determinada cor.

As sondas de DNA utilizadas para esta análise consistem em uma mistura de sondas de coloração sólida para o conjunto completo de cromossomos humanos, marcadas com uma combinação de vários fluorocromos, cuja proporção é selecionada individualmente para cada par de cromossomos. A utilização de métodos de registro apropriados e programas de computador para análise de imagens, que avaliam a intensidade da luminescência de todos os fluorocromos para cada ponto da imagem, possibilita a realização da cariotipagem, na qual cada par de cromossomos possui sua própria "pseudocolor ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor ou multiplex. FISH) é o nome genérico para FISH multicolorido tradicional usando conjuntos de filtros específicos de fluorocromo. O princípio M-FISH consiste na gravação digital separada do sinal de todos os fluorocromos utilizados, o que é conseguido através da mudança sequencial dos conjuntos de filtros. Todas as imagens são gravadas em arquivos separados, o que permite realizar seu processamento eficiente associado à separação de sinal e fundo, bem como a quantificação do sinal. O processamento de todas as informações gravadas com a ajuda de um software especial traduz as informações sobre o nível de sinais de fluorocromo em cada ponto da imagem em pseudocores. Uma das principais limitações do número de sondas de DNA utilizadas é o número de fluorocromos disponíveis, com espectros de excitação e emissão não sobrepostos, e a disponibilidade de conjuntos de filtros apropriados.

FISH de 24 cores O M-FISH mais utilizado é o FISH de 24 cores para a identificação simultânea de material de todos os cromossomos humanos. É altamente eficiente na detecção de translocações cromossômicas, mas não foi projetado para detectar deleções e inversões. No entanto, esse problema pode ser parcialmente resolvido pela coloração simultânea de cromossomos com DAPI, o que possibilita analisar o estriamento diferencial de cromossomos cujo material cromossômico já foi identificado. Infelizmente, deve-se notar que a qualidade da bandagem DAPI cromossômica após M-FISH é significativamente inferior à coloração diferencial GTG e até mesmo bandagem DAPI após hibridização in situ convencional.

Rx. FISH O princípio M-FISH tem sido usado para gerar um código de barras multicolorido para cromossomos humanos e um método de bandamento cromossômico multicolorido baseado na hibridização in situ interespécies. Ao contrário do FISH de 24 cores, este método permite detectar diretamente parte dos rearranjos intracromossômicos. Sondas de DNA usadas em Rx. FISH rotulado com uma combinação de 3 fluorocromos, que fornece 7 pseudo cores. Eles mancham especificamente regiões individuais dos cromossomos, criando suas estrias de cor. Este recurso de amostras de DNA para Rx. O PEIXE é determinado pela forma como é obtido. São bibliotecas de DNA cromossômico específico de duas espécies de gibões: Hylobates concolor e Hylobates syndactylus.

Como resultado dos intensos rearranjos cromossômicos que ocorreram durante a formação das espécies modernas de gibões, o material de seus cromossomos acabou sendo altamente embaralhado em comparação com a organização dos cromossomos em humanos, cujos cromossomos são conhecidos por seu conservadorismo. A proporção de cromossomo humano 1 para cromossomos de gibão é mostrada na Figura 1,

A Figura 2 mostra uma visão geral dos cromossomos humanos obtidos como resultado de Rx. PEIXE. a) Placa metafásica b) Arranjo dos cromossomos.

No entanto, RXFISH tem sérias limitações - rearranjos cromossômicos que ocorreram dentro de uma banda RX de cor não podem ser detectados usando este método, a menos que levem a mudanças significativas e facilmente visíveis no tamanho dessa banda. - as sondas coram várias regiões cromossômicas de diferentes cromossomos em uma pseudocor. No entanto, à medida que o número de fluorocromos usados aumenta, o método RXFISH será, sem dúvida, mais informativo do que o FISH de 24 cores de rotina.

As vantagens do RXFISH atualmente incluem os seguintes pontos: O método permite a análise de todo o genoma humano em um único experimento FISH multicolorido. Estão disponíveis conjuntos comercialmente disponíveis de sondas de DNA marcadas e os sistemas de detecção necessários. O método permite a rápida identificação de parte significativa dos rearranjos intra e intercromossômicos. A identificação automática de cromossomos metafásicos de “faixas de cores” é possível. Cada cromossomo humano tem um código de barras de cores exclusivo. O RXFISH está integrado na estação de trabalho Cyto. Sistemas de microscopia de visão e fluorescência padrão.

Cariotipagem espectral (SKY-spectralkaryotyping) Os princípios básicos da análise de imagens microscópicas na cariotipagem espectral são praticamente os mesmos usados no M-FISH. As diferenças estão relacionadas à forma como a imagem é registrada. A tecnologia SKY permite obter curvas espectrais para todos os pontos da imagem durante uma medição, independentemente de estar associada à epifluorescência ou à microscopia de luz tradicional. Para cariotipagem espectral de todos os cromossomos humanos, cinco fluorocromos são usados, um no espectro verde, dois no vermelho e dois no infravermelho. A excitação e emissão de todos os fluorocromos usados na marcação de sondas de DNA ocorre com um conjunto de filtros, o que permite evitar sua mudança sequencial, foco intermediário e, consequentemente, problemas relacionados, como deslocamento espacial da imagem, determinação de valores de limiar e máscaras de segmentação. Com base na análise das curvas espectrais, determina-se a presença ou ausência de fluorocromos específicos em um determinado ponto.

O próximo passo é o procedimento de classificação, que permite determinar de forma direta e inequívoca a afiliação cromossômica do material analisado. Isso garante a identificação confiável (até um cromossomo) do material cromossômico marcador, bem como dos derivados cromossômicos resultantes de vários rearranjos. A grande vantagem do SKY é que a coloração DAPI é registrada paralelamente à imagem espectral. A melhoria do software de bandagem DAPI permite obter estriamento diferencial em qualidade próximo ao bandamento GTG. A possibilidade de análise paralela da imagem espectral e coloração diferencial qualitativa dos cromossomos simplifica muito a interpretação dos resultados do SKY e permite uma determinação mais precisa dos pontos de quebras cromossômicas. As vantagens indiscutíveis do SKY incluem a possibilidade de usar fluorocromos com sobreposição de espectros de excitação e emissão, o que expande significativamente a lista de fluorocromos utilizáveis e também aumenta o número de fluorocromos que podem ser usados simultaneamente. A listagem de um novo fluorocromo não requer a compra de um novo conjunto de filtros, pois uma unidade de filtro para FISH espectral e uma unidade de filtro para DAPI são suficientes para SKY.

As desvantagens do SKY incluem: - longo tempo de exposição, necessário para gravar imagens microscópicas. - SKY é um pouco menos eficiente que M-FISH quando se trata de pesquisa com sondas de DNA relativamente pequenas.

Cariotipagem com mudança de cor (CCKs Cariotipagem com mudança de cor) Este método baseia-se na análise da diferença no comprimento do sinal entre amostras de DNA hibridizadas com sondas de DNA associadas a fluorocromos e sondas de DNA portadoras de anticorpos. O método é viável com apenas 3 filtros e não requer câmeras e softwares especiais. Para identificar os cromossomos, uma hibridização é realizada e duas imagens são obtidas. O método baseia-se na diferença no comprimento do sinal fluorescente, uma vez que o tempo de exposição das amostras de DNA associadas aos anticorpos é 80 a 90% menor que o das amostras associadas aos fluorocromos. Após a reação de hibridização, os swabs são expostos aos anticorpos primários apropriados e então visualizados para obter a primeira imagem. As lâminas são então expostas a anticorpos secundários e avidina ligada aos mesmos fluorocromos. Os traços podem ser contrastados usando DAPI.

No futuro, as imagens das preparações são novamente obtidas usando 3 filtros por vez. Essas imagens são comparadas usando um software especial e uma segunda imagem é obtida, na qual apenas os cromossomos associados a determinados anticorpos serão visíveis. Assim, alguns cromossomos só irão fluorescer na primeira ou segunda varredura, enquanto outros mudarão de cor em diferentes varreduras.

Hibridização genômica comparativa (CGH) O método foi criado para identificar distúrbios quantitativos no genoma. Baseia-se na realização de uma reação de hibridização in situ usando todo o genoma como uma sonda de DNA. O DNA doador isolado e normal é marcado com fluorocromos de cores diferentes, transformando-os em sondas de DNA. Quantidades equivalentes dessas sondas são misturadas e usadas na hibridização com uma preparação citogenética de controle. Após FISH, as metáfases são analisadas em um microscópio fluorescente, usando um programa especializado de análise de imagem de computador para determinar a intensidade de fluorescência de dois fluorocromos ao longo de todo o comprimento de cada cromossomo.

Na ausência de alterações quantitativas no cariótipo da amostra de teste, será observada uma certa proporção da intensidade de luminescência dos dois fluorocromos. No caso de amplificação do gene, a intensidade do sinal do fluorocromo correspondente aumentará e, no caso de perda de parte do material genético, pelo contrário, enfraquecerá. Assim, o CGH permite detectar desequilíbrio genômico, mas este método não pode ser usado para detectar translocações e inversões balanceadas, e trissomias e deleções podem ser detectadas apenas se o tamanho da região desbalanceada for de pelo menos 10 milhões de pares de bases.

O desequilíbrio cromossômico na amostra de teste é estimado a partir da diferença na intensidade de fluorescência de dois fluorocromos diferentes, calculando a razão de fluorescência (FR).

O método CGH tem uma série de vantagens sobre outros métodos de análise de alterações do genoma: Primeiro, ele não depende da fonte do material de teste e pode ser realizado com sucesso com uma pequena quantidade de DNA testado, incluindo material de arquivo. Em segundo lugar, permite obter informações detalhadas sobre a perda ou aumento do número de cópias de material genético ao longo do genoma em um único experimento. Em terceiro lugar, o método CGH não requer a preparação de preparações cromossômicas metafásicas a partir do tecido em estudo, ou seja, não depende do processo de cultivo celular e artefatos relacionados.

A hibridização genômica situ (genomicin situ hybridization in, GISH) é uma variante do método de hibridização situ, que consiste no fato de que para a hibridização com amostras fixas, o DNA genômico total de uma espécie de organismo é utilizado como sonda marcada por fluorescência, com qual o DNA genômico total de outra espécie de organismo compete; usado para determinar diferenças interespécies e intraespécies em genomas, rearranjos cromossômicos, deleções e substituições.

Variações de FISH 1) Q-FISH – FISH quantitativo: Desenvolvido por Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward e P. M. Lansdorp. 1998. Telômeros curtos no cromossomo humano 17 p. Nat. Genet. 18:76-80. método quantitativo. Projetado para trabalhar com citometria de fluxo. Originalmente usado para medir o comprimento do cromossomo (resolução: 200 bp) contando o número de repetições teloméricas. Sondas conjugadas com PNA são usadas. Inicialmente, os cromossomos metafásicos foram estudados (QFISH propriamente dito), agora este método também é aplicável aos cromossomos interfásicos (IQ-FISH). Q-FISH é realizado em cultura de células, cortes de tecidos (ambos em vidros). Atualmente, o Q-FISH é uma ferramenta importante no estudo do papel dos telômeros nos processos de envelhecimento e formação de câncer.

PNA-FISH - Ácidos nucléicos peptídicos PEIXES: Os ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) são análogos sintéticos do DNA em que o esqueleto de açúcar do fosfato de desoxirribose, que sustenta a base nitrogenada, é substituído por um esqueleto peptídico não carregado. Como resultado desta estrutura: quando a sonda PNA-oligomérica hibridiza com DNA/RNA complementar, não ocorre repulsão eletrostática. Os duplexes de PNA-DNA (PNA-RNA) são muito mais estáveis do que os homo/heteroduplexes naturais. Alta especificidade de ligação PNA-DNA: A hibridização PNA-DNA é muito mais sensível à incompatibilidade de pares de bases do que a hibridização DNA-DNA. Assim, usando uma sonda de PNA, duas repetições centroméricas podem ser distinguidas, diferindo em apenas um par de bases. O PNA tem uma hidrofobicidade relativa (em comparação com o DNA), pelo que o PNA se difunde melhor através das paredes celulares => ampla aplicação em microbiologia. Com base na alta especificidade de ligação: Acredita-se que a tecnologia PNA em breve se tornará a base para a criação de sondas específicas de alelos para hibridização in situ. É usado em genética, citogenética, epigenética, microbiologia, etc.

3) Flow-FISH - FISH para citometria de fluxo: Proposto em 1998 por: Rufer, N. , Dragowska, W. , Thornbury, G. , Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Dinâmica do comprimento dos telômeros em subpopulações de linfócitos humanos medidos por citometria de fluxo . biotecnologia da natureza. 16, 743-747 (1998). Uma combinação de Q-FISH e citometria de fluxo que permite análise de sinal (medição) e classificação. Para flow-FISH, uma suspensão de células é usada (para medir o comprimento dos telômeros cromossômicos), espalhamentos cromossômicos e cromossomos isolados (para mapeamento adicional). Como no Q-FISH, são usadas sondas teloméricas marcadas com PNA (por exemplo, para visualizar e medir o comprimento de repetições teloméricas) A principal vantagem é um método mais rápido (análise/classificação de um grande número de células/cromossomos). É amplamente utilizado para estudar vários problemas: envelhecimento, preservação de telômeros, estudo de suspensões de células-tronco hematopoiéticas ex vivo, estudo de bactérias.

A análise multiparamétrica permite a diferenciação de tipos de células dentro de uma amostra, permitindo o controle interno e a análise de subtipos de leucócitos.

Benefícios do flow-FISH: Resultados facilmente reproduzíveis Capacidade de analisar subgrupos de células em uma população usando imunofluorescência física e marcadores Melhor desempenho do que Q-FISH Capacidade de quantificar a fluorescência de milhares de células.

INVESTIGAÇÃO DE CROMOSSOMOS ISOLADOS POR CITOMETRIA DE FLUXO 1. Separação de cromossomos por citometria de fluxo - A cariotipagem por citometria de fluxo é usada para mapear genes e construir bibliotecas de cromossomos. - A identificação e localização de genes em cromossomos classificados é realizada com o uso posterior de métodos FISH / método PRINS (marcação in situ com primer) ou suas variações e PCR cromossomo-específico. - Em 2011, apenas os cromossomos de 17 espécies de plantas cultivadas foram selecionados com sucesso até agora. - Triagem de cromossomos metafásicos ou paquitênicos com alto índice de divisão.

Etiqueta fluorescente: - Os cromossomos são marcados com fluorocromos específicos de ácido nucleico. - Os fluorocromos são selecionados de acordo com 1) especificidade para bases nitrogenadas, 2) condições experimentais (incluindo levando em consideração os comprimentos de onda dos lasers disponíveis). 1. Para análise monovariante, use corantes que não são específicos para pares A-T ou G-C: iodeto de propídio (pico de excitação: 535 nm, emissões: 617 nm, laser necessário: laser de argônio de 488 nm ou lâmpada + filtro de passagem longa) brometo de etídio (excitação picos: : 300 e 520 nm, emissões: 600 nm, laser necessário: 488 nm laser de argônio ou lâmpada + filtro de passagem longa) Esses marcadores coram o DNA independentemente do conteúdo de A, G, T ou bases nitrogenadas. 2. Para análise bivariada utilizar: cromomicina (específica para pares de bases G-C), excitação do pico A3: 458 nm, emissão 580 nm. Laser: , 458 nm mínimo 400 M. Potência V. Hoechst 33258 (específico para A-T bp), excitação: 351-364 nm, emissão: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (poderoso). Os lasers devem ser separados no tempo e no espaço devido à sobreposição parcial dos espectros de fluorocromo.

2. Estudo de sequências cromossômicas/nucleotídicas após triagem (para construção de mapas físicos e genéticos, etc.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Estudo de genomas grandes com cromossomos longos. Mapeamento de sequências com grande número de repetições (ex: regiões teloméricas e centroméricas). Uso de sondas curtas. Devido ao grande número de repetições, o sinal é forte. Tamanho padrão da sonda: 15 - 30 nucleotídeos. PEIXE

Problemas de FISH: É difícil localizar sequências de DNA de locus único (ou seja, sequências de DNA únicas não repetidas) porque o sinal será muito fraco ao usar sondas curtas padrão. Aumentar o comprimento da sonda para vários kilobases para aumentar o sinal resultará em sensibilidade diminuída e => ligação não específica. Solução: BAC-FISH -BAC-FISH é uma combinação do método FISH e o uso de clones de DNA genômico integrados em cromossomos artificiais bacterianos (BACs), permitindo a inserção de grandes sequências de DNA. - Um método eficiente para identificar e mapear cromossomos individuais de organismos com genomas pequenos. Sondas BAC, overgos (oligonucleotídeos sobrepostos) são usadas como sonda.

Alternativa para FISH: PRINS PRINS (marcação iniciada in situ) é um método de marcação de cromossomos pelo anelamento de um primer de DNA oligonucleotídico com uma sequência homóloga de DNA cromossômico desnaturado e subsequente extensão enzimática do primer in situ com nucleotídeos marcados. Descrita pela primeira vez por Koch et al. em 1989 (Koch, J.E., Kølvraa, S., Petersen, K.B., Gregersen, N., e Bolund, I. (1989) Oligonucleotídeo-priming methods for the cromossomo-specific labeling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259 -265). PRINS é uma alternativa ao FISH. É usado para localização de sequências de nucleotídeos, reconhecimento e contagem de cromossomos metafásicos ou interfásicos ou pares de cromossomos (incluindo aneuploidia cromossômica). hibridização do primer não marcado (primer-primer) com o DNA de interesse; alongamento do primer com a ajuda de uma polimerase de DNA termoestável e nucleotídeos marcados; término da reação (ligação de uma molécula bloqueadora à extremidade 3') Primer : fragmento de restrição de PCR - indireto (biotina/dig avidina conjugada com fluorocromo/ anti-dig) - Apenas um par de cromossomos homólogos (um cromossomo) pode ser identificado nos resultados de cada reação PRINS. A próxima reação PRINS no mesmo slide só pode ser realizada após o bloqueio da anterior. - Usado para sequências de DNA com um grande número de repetições.

Vantagens de PRINS: 1. Requer informação de sequência mínima necessária para a síntese de um oligonucleotídeo iniciador. 2. O método mais rápido e simples para detectar uma sequência de interesse em um cromossomo (comparado ao uso de sondas FISH pesadas que hibridizam por um período de tempo muito longo). 3. Exclusão da etapa de marcação da sonda. 4. A capacidade de alongar o primer com nucleotídeos marcados para aumentar o sinal de c-PRINS ao detectar sequências únicas curtas. Para identificar repetições de baixa cópia ou sequências únicas curtas, é usado um método mais sensível - PRINS de ciclagem (c-PRINS). C-PRINS foi proposto por Gosden et al. em 1991, um protocolo melhorado amplamente utilizado por Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localização de sequências de DNA em cromossomos de plantas usando PRINS e C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS inclui uma série de ciclos térmicos semelhantes ao PCR.

Fluido de bainha para FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Citometria de fluxo e FISH para medir o comprimento médio dos telômeros (fluxo FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Separação de fluxo de cromossomos mitóticos em trigo mole (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . Tampão So 4 sem ditiotreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Cromossomos classificados por fluxo: um material fino para mapeamento físico de genes de plantas. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99-103 ) -autoclavado 0,1% (p/vol) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Classificação de cromossomos em trigo tetraplóide e seu potencial para análise de genoma. Genética. 2005, 170 (2): 823-829) -Tampão de poliamina estabilizadora de cromossomos (fluido de bainha contendo proteína) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2ª Ed. Parte B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Hibridização in situ de fluorescência

Hibridação fluorescente no local , ou o método FISH (eng. Fluorescência no local hibridização - FISH ) - um método citogenético que é usado para detectar e determinar a posição de uma sequência de DNA específica em cromossomos metafásicos ou em núcleos interfásicos no local. Além disso, o FISH é usado para detectar mRNAs específicos em uma amostra de tecido. Neste último caso, o método FISH permite estabelecer características espaço-temporais da expressão gênica em células e tecidos.

Sondas

Com hibridização fluorescente no local use sondas de DNA (sondas de DNA) que se ligam a alvos complementares na amostra. As sondas de DNA contêm nucleosídeos marcados com fluoróforos (marcação direta) ou conjugados como biotina ou digoxigenina (marcação indireta). Com marcação direta, a sonda de DNA ligada ao alvo pode ser observada usando um microscópio fluorescente imediatamente após a conclusão da hibridização. No caso de marcação indireta, é necessário um procedimento de coloração adicional, durante o qual a biotina é detectada usando avidina ou stepavidina marcada com fluorescência e digoxigenina usando anticorpos marcados com fluorescência. Embora a versão indireta de marcação de amostras de DNA exija reagentes e tempo adicionais, esse método geralmente atinge um nível de sinal mais alto devido à presença de 3-4 moléculas de fluorocromo em um anticorpo ou molécula de avidina. Além disso, no caso de marcação indireta, é possível a amplificação em cascata do sinal.

Para criar amostras de DNA, são usadas sequências de DNA clonadas, DNA genômico, produtos de reação de PCR, oligonucleotídeos marcados e DNA obtido por microdissecção.

A marcação da sonda pode ser realizada de várias maneiras, por exemplo, por nick-translation ou por PCR com nucleotídeos marcados.

Procedimento de hibridização

Esquema do experimento sobre hibridização fluorescente no local localizar a posição do gene no núcleo

O primeiro passo é o projeto das sondas. O tamanho da sonda deve ser grande o suficiente para que a hibridização ocorra em um local específico, mas não muito grande (não mais de 1 kb) para não interferir no processo de hibridização. Ao identificar loci específicos ou ao colorir cromossomos inteiros, é necessário bloquear a hibridização de sondas de DNA com sequências de DNA repetitivas não únicas adicionando repetições de DNA não marcadas (por exemplo, DNA Cot-1) à mistura de hibridização. Se a sonda de DNA for DNA de fita dupla, ela deve ser desnaturada antes da hibridização.

Na próxima etapa, preparações de núcleos interfásicos ou cromossomos metafásicos são preparados. As células são fixadas em um substrato, geralmente em uma lâmina de vidro, seguida de desnaturação do DNA. Para preservar a morfologia dos cromossomos ou núcleos, a desnaturação é realizada na presença de formamida, o que permite reduzir a temperatura de desnaturação para 70°.

A visualização de sondas de DNA ligadas é realizada usando um microscópio fluorescente. A intensidade do sinal fluorescente depende de muitos fatores - a eficiência de marcação da sonda, o tipo de sonda e o tipo de corante fluorescente.

Literatura

Rubtsov N.B. Métodos de trabalho com cromossomos de mamíferos: Proc. subsídio / Novosib. Estado un-t. Novosibirsk, 2006. 152 p.

Rubtsov N.B. Hibridação de ácidos nucleicos no local na análise de anomalias cromossômicas. Capítulo no livro "Introdução ao diagnóstico molecular" Vol. 2. "Métodos genéticos moleculares no diagnóstico de doenças hereditárias e oncológicas" / Ed. M.A. Paltseva, D. V. Zaletaev. Literatura educacional para estudantes de universidades médicas. M.: Medicina, 2011. T. 2. S. 100–136.

Notas

Fundação Wikimedia. 2010.

Veja o que é "hibridização in situ fluorescente" em outros dicionários:

Este termo tem outros significados, veja hibridização. Hibridização de DNA, hibridização de ácidos nucleicos in vitro combinação de ácidos nucleicos de fita simples complementares em uma molécula. Com completa complementaridade ... ... Wikipedia

Método de determinação hibridização fluorescente in situ.

Material em estudo Veja na descrição

Visita domiciliar disponível

O estudo é usado para selecionar quimioterapia adjuvante individual para câncer de mama ou câncer gástrico.

O câncer de mama (CM) ocupa o primeiro lugar entre as doenças oncológicas em mulheres. As células tumorais da mama podem conter vários tipos de receptores que são sensíveis a certas substâncias (hormônios ou outras moléculas biologicamente ativas). Dependendo da presença de receptores hormonais (estrogênio e progesterona) ou receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano, HER2) em células tumorais, o câncer de mama hormônio-receptor positivo, HER2-positivo e triplo negativo são isolados . Isso é importante levar em consideração na seleção individual da terapia e para prever o sucesso do tratamento.

O HER2 é um receptor que está presente nos tecidos e normalmente, participando da regulação da divisão e diferenciação celular. Seu excesso na superfície das células tumorais (hiperexpressão) determina o rápido crescimento descontrolado da neoplasia, o alto risco de metástase e a baixa eficácia de alguns tipos de tratamento. A hiperexpressão de HER2 em alguns subtipos de câncer de mama leva ao aumento da proliferação e angiogênese, bem como à desregulação da apoptose (autodestruição de células geneticamente programada). Atualmente, existem medicamentos que têm como alvo o receptor HER2. Este, em particular, é o Herceptin (trastuzumab), que é um anticorpo monoclonal contra os receptores HER2/neu.

A amplificação e a superexpressão do oncogene HER2 (ErbB-2) são eventos relativamente específicos para o carcinoma de mama e praticamente não ocorrem em tumores de outras localizações. O câncer gástrico (CG) é uma das poucas exceções: a ativação de HER2 é observada em aproximadamente 10-15% dos casos de neoplasias malignas desse órgão e se correlaciona com o curso agressivo da doença. No câncer de mama HER2-positivo, um excesso de receptores HER2 pode estar presente na superfície das células tumorais (referido como HER2 positivo ou Hercept positivo). Este fenômeno é observado em 15-20% das mulheres que sofrem de câncer de mama. A avaliação do status HER2 é importante para determinar as táticas de tratamento.

Os principais métodos padronizados para detectar a superexpressão de HER2/neu e/ou amplificação do gene HER2/neu são o método imuno-histoquímico (IHC) e a hibridização in situ por fluorescência (FISH). Ambos os estudos são realizados em preparações histológicas (seções do material tumoral embebidas em parafina) usando anticorpos policlonais (IHC), sondas fluorescentes (FISH) e vários sistemas de imagem.

Ao avaliar os resultados da reação de IHQ, a expressão é levada em consideração apenas no componente invasivo do tumor. Os resultados da reação são avaliados usando uma escala de pontuação: 0, 1+, 2+, 3+, desenvolvida pelo fabricante do teste e aprovada por especialistas. O status de Hercept, classificado como 0 e 1+, deve ser considerado negativo - não há superexpressão da proteína, o que se correlaciona com a ausência de amplificação de seu gene. O status de Hercept, classificado como 3+, é positivo, ou seja, a superexpressão da proteína está presente, o que se correlaciona com a presença de amplificação do gene. Hercept status 2+ é considerado indeterminado, ou seja, a expressão da proteína determinada com base em uma reação imuno-histoquímica não pode ser julgada com segurança na amplificação do gene, portanto, é necessário um estudo que revele diretamente a presença ou ausência de amplificação. O método FISH é utilizado em cortes da mesma amostra (bloco) em que foi realizado o estudo imuno-histoquímico. Na hibridização FISH, a presença de amplificação do gene HER2 é avaliada contando a proporção de sinais fluorescentes vermelhos (correspondentes aos genes HER2 marcados) e verdes fluorescentes que marcam a região centromérica do 17º cromossomo. Uma razão maior que 2 indica a presença de amplificação de HER2. O método FISH é mais sensível que o IHQ, pois permite uma avaliação direta da presença ou ausência de amplificação.

Material para pesquisa: bloco de parafina com biópsia tumoral.

Atenção! NECESSARIAMENTE:

lâmina de vidro com coloração IHC com anticorpos para HER2/neu
um encaminhamento de um médico ou um extrato com os resultados de um estudo histológico e IHQ com anticorpos para Her-2/neu

Literatura

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