Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (ryby)

W niektórych przypadkach badania cytogenetyczne nie wystarczy, aby wydać zawarcie na temat Karyotypu, w takich przypadkach stosować metody cząsteczkowo-cytogenetyczne w szczególności hybrydyzacji fluorescencji in situ (angielski - fluorescencja in situ hybrydyzacji - ryby).

Pojawienie się nowych technologii cytogetyki molekularnej, w oparciu głównie na hybrydyzacji in situ kwasów nukleinowych, znacznie rozszerzył możliwości diagnostyki chromosomowej. Metoda hybrydyzacji in situ została zaprojektowana, aby zlokalizować określone sekwencje DNA bezpośrednio na preparatach cytologicznych. Nastąpił przejście do identyfikacji chromosomów i obszarów chromosomalnych z analizy organizacji cytologicznej chromosomu na analizę sekwencji DNA zawartych w ich kompozycji. Porównanie skuteczności klasycznych metod cytologicznych do wykrywania i analizowania przestawności chromosomalnych, takich jak chromosomy różnicowe, z nowoczesnymi technologiami molekularno-cytogenetycznymi wykrył, że z zaburzeniami hematologicznymi, analiza cytologiczna chromosomów wykrywa i prawidłowo identyfikuje tylko około jednej trzeciej wykrytych przegrupowania chromosomów Spectral Karyotyping (niebo). Kolejna trzecia przegrupowania są nieprawidłowo identyfikowane metody cytologiczne, a trzecia pozostaje całkowicie niezauważona. Klasyczne metody analizy cytogenetycznej umożliwiają identyfikację tylko około 15% przestawności chromosomowych zidentyfikowanych przez niebo.

W metodzie ryb, cząsteczki fluorescencyjne są wykorzystywane do obciążania kolorów genów lub chromosomów. Metoda jest stosowana do odwzorowania genesów i identyfikacji aberracji chromosomowych.

Technika rozpoczyna się od przygotowania krótkich sekwencji DNA, zwanych sondami, które są komplementarne w odniesieniu do sekwencji DNA reprezentujących obiekt badawczy. Sonda hybrydyzuje (wiązania) z komplementarnymi sekcjami DNA i ze względu na fakt, że są one oznaczone etykietą fluorescencyjną, umożliwiają lokalizację genów zainteresowanych w DNA lub chromosomach. W przeciwieństwie do innych metod badania chromosomów wymagających aktywnego podziału komórek, ryby mogą być wykonywane w komórkach bez deklaracji, co osiąga elastyczność metody.

Ryby mogą być używane do różnych celów przy użyciu sond z trzech różnych typów:

* Sondy specyficzne dla lokalizacji wiążące się z pewnymi obszarami chromosomów. Sondy te służą do identyfikacji istniejącej krótkiej sekwencji dedykowanego DNA, który stosuje się do przygotowania oznaczonej sondy i jej późniejszej hybrydyzacji z zestawem chromosomów;
* Powtórzenia sond alfaid lub centromeric są powtarzane sekwencje chromosomów domów centromedicznych. Z ich pomocy każdy chromosom może być pomalowany w innym kolorze, co pozwala szybko określić liczbę chromosomów i odchyleń od normalnego numeru;
* Sonda na całym chromosomie są zestawem małych sond uzupełniających indywidualne sekcje chromosomu, ale ogólnie obejmujące całą całą długość. Korzystając z biblioteki takich sond, możesz "kolorowy" wszystkie chromosom i uzyskać różnorodny spektralny karotyp jednostki. Ten rodzaj analizy stosuje się do analizy aberracji chromosomowych, takich jak translokacje, gdy kawałek jednego chromosomu jest przenoszony do ramienia innego.

Hybrydyzacja in situ z etykietą fluorescencyjną (ryb)

Materiał do badania jest krew, szpik kostny, biopsja nowotworowa, łożyska, tkanka zarodkowa lub płyn amniotykowy. Próbki badań powinny być dostarczone do laboratorium w najnowszym formularzu. Preparaty (slajdy) są przygotowywane bezpośrednio z próbek tkanin lub po ich uprawie. Można stosować komórki komórek metozny i interfazu. Fluorescencyjne oznaczone etykietami Sondy DNA hybrydyzacyjne z dNA chromosomalnym i można jednocześnie korzystać z wielu sond do różnych lokalizacji.

Ryba jest przydatną i wrażliwą metodą analizy cytogenetycznej przy identyfikacji ilościowych i wysokiej jakości aberracji chromosomalnych, takich jak delecje (w tym mikrodelitsa), translokacji, podwojenia i anioidididu. Ryby na chromosomy interfazowe służy jako szybka metoda prenatalnej diagnozy trisomii 21, 18 lub 13 chromosomów lub aberracji chromosomów płciowych. W Onkologii, używając ryb, możliwe jest zidentyfikowanie translokacji (BCR / ABL, MLL, PML / Rara, Tel / AML1) związane z hematologicznym nowotworami złośliwymi. Metoda może być również stosowana do monitorowania pozostałych zjawisk raka po chemioterapii i przeszczepach szpiku kostnego oraz wykrywanie zwiększonych onkogenych (C-MYC / N-MYC) związane z niekorzystną prognozą dla niektórych guzów. Ryby są również używane do sterowania obserwatorami alotrajlanów szpiku kostnego uzyskanego z przeciwnej osoby.

Ryba jest wrażliwą metodą identyfikacji aberracji chromosomalnej i jednoczesnej szybkiej analizy dużych (\u003e 500) numerów komórek. Metoda ma wysoką dokładność podczas identyfikowania chromosomów przyrody i nieznane fragmenty DNA chromosomowego.

Tradycyjny cytogenetyczny Podczas badania Karyotypu zawsze był ograniczony poziom rozdzielczości zgięcia. Nawet przy użyciu bardzo dodawania metod różnicowych chromosomów barwiących, właśnie ujawniliśmy więcej zespołów na chromosomie, ale nie byliśmy pewni, że dotrzemy do poziomu molekularnego pozwolenia. Najnowsze osiągnięcia technologii DNA i cytogenetyki umożliwiły stosowanie metod ryb do analizy zmian w DNA chromosomalnym na poziomie cząsteczkowym. Cytogenetyka molekularna zapewniła rewolucyjny przełom w cytogenetyce, umożliwiając:

Analiza struktury chromosomów DNA w zakresie 10-100 kilobanów;
Przeprowadzić diagnozę kolejnych komórek interfazowych, które miały ogromny wpływ na diagnozę prenatalną i preimplanting diagnostyki genetycznej (PGD).

Technologia rybna Wykorzystuje sondę DNA, która wiąże lub renaturze specyficzne sekwencje DNA wewnątrz chromosomu. Denaturowana sonda inkubuje się z rodzimym DNA komórki, również denaturowanej do stanu jednołańcuchowego. Sonda zastępuje biotyna-deoksyuridintrifoshoshosforan lub fosforan Digoxygenin-Uridinifriff na tymidynie. Po wyremontowaniu sondy rodzimego DNA, kompleks ZOND-DNA można wykryć przez dodanie do uniknięcia fluorochroma, wiązania z biotyną lub fluorochromami antydigoksygoksygeniny. Dodatkowe wzmocnienie sygnału można uzyskać przez dodanie antynovidyny i badano wynikowy kompleks z mikroskopem fluorescencyjnym. Zamontowane różne sondy DNA z kilkoma różnymi fluorochromami można jednocześnie wizualizować kilka chromosomów lub segmentów chromosomalnych wewnątrz pojedynczej komórki jako wielobarwne sygnały.

Możliwość określenia specyficzne segmenty genów.Istniejące lub nieobecne na chromosomach umożliwiły diagnozowanie syndromów sekwencji genów na poziomie DNA, jak jednak i translokacji jąder interfazowych, często w poszczególnych komórkach.

Materiał dla Ryba. Są to chromosomy metafazy uzyskane z podziału komórek lub jąder interfazy komórek, które nie są w podziale. Plastry są poddawane wstępnie obróbce RNazy i proteinazę, aby usunąć RNA, który może wejść do hybrydyzacji krzyżowej z sondy i chromatyny. Następnie są ogrzewane w formamidu do denaturowania DNA i przymocowane z alkoholem lodowym. Sonda jest następnie przygotowana do hybrydyzacji przez ogrzewanie. Następnie sonda i preparat chromosomalny mieszano i uszczelniają szkło powlekające w 37 ° C do hybrydyzacji. Zmieniając temperaturę inkubacji lub składu soli do hybrydyzacji, możliwe jest zwiększenie specyficzności wiązania i zmniejszenia oznakowania tła.

Zastosowanie hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ - technologia ryb

Wydajność technologii rybnych Po raz pierwszy został wykazany, gdy lokalizacja genesów na. Wraz z wprowadzeniem fluorescencyjnej metody etykietowania, hybrydyzacja in situ okazała się niezbędna do diagnozowania anomalii chromosomowych, które nie są wykrywane przez tradycyjne metody pasm. Ryby odgrywały również kluczową rolę w popełnienia jednego z najbardziej niezwykłych odkryć nowoczesnej genetyki - nadruku genomowego.

Jego technologia rozwoju Ryba. Otrzymane w trzech formach. Centrome lub satelita alfa, sondy charakteryzują się względną specyficznością chromosomalną, były one stosowane najczęściej w genetyce komórek interfazowych. Sondy te są generowane do pewnego stopnia rozproszone sygnały odpowiedniej mocy w dziedzinie centrnerów, ale nie wchodzą do hybrydyzacji krzyżowej z chromosomami o podobnych sekwencji centromerycznych. Obecnie opracowano jedno źródła, które zapewniają dyskretny sygnał z określonego zespołu chromosomowego i pozwalające uniknąć zjawiska krzyżowo-hybrydyzacji. Sondy te można również wykorzystać do określenia preparatu i określonych regionów chromosomów, przypuszczalnie powiązanych z jednym lub innym zespołem. Jedno-źródła i sondy centromediczne opracowane do chromosomów 13, 18, 21, X i Y są używane do diagnostyki prenatalnej.

Możliwe jest również "barwienie" z całymi chromosomami za pomocą Ryba.. Dzięki technologii spektralnej Karyotypowania, przy której stosuje się mieszanina różnych fluorochromów, stała się obecnie możliwa do stworzenia unikalnego wzoru fluorescencyjnego dla każdego pojedynczego chromosomu z 24 oddzielnymi kolorami. Technologia ta pozwala nam określić złożoną restrukturyzację chromosomową, niewidoczną przy użyciu tradycyjnych technik cytogenetycznych.

metoda Ryba. w diagnostyce prenatalnej. Dla kobiet o starszych wiech reprodukcyjnych ciąża może być powodem nie tak bardzo za radość co do obaw. Wraz z wiekiem kobiet związany jest ryzyko rozwoju chromosomalnych anomalii płodowych. Amniocenteza przeprowadzona w 16 tygodniu ciąży, a następnie analiza kariotypu trwa 10-14 dni. Korzystanie z ryb w wstępnym badaniu pozwala przyspieszyć diagnostykę i zmniejszyć czas oczekiwania. Większość genetycznych i laboratoriów przestrzegała opinii, że metoda rybna nie powinna być stosowana wyizolowana na decyzję w sprawie dalszej ciąży. Metoda rybna musi być uzupełniony przez analizę Karyotypową, a jego wyniki muszą być skorelowane z patologicznym obrazem badań ultradźwiękowych (ultradźwiękowych) lub bilaków bochemicznych krwinek.

Syndromy genów. sekwencje Znany również jako syndromy Microdellius lub znane są również segmentowe aneussia. To usunięcie sąsiednich fragmentów chromosomów obejmujących, z reguły wielu genów. Zespoły sekwencji genów zostały po raz pierwszy opisane w 1986 r., Korzystając z klasycznych technik cytogenetyki. Teraz, dzięki ryb, możliwe jest zidentyfikowanie submikrobloskopowych delecji na poziomie DNA, co umożliwiło zidentyfikowanie najmniejszego regionu delegacji związanego z rozwojem zespołu, zwanego regionem krytycznym. Po określeniu regionu krytycznego zespół często staje się możliwe do zidentyfikowania określonych genów, których brak jest uznawany za związany z tym zespołem. W ostatnio wydanym instrukcji obsługi zespołów genowych zgłoś 18 usuwania i syndromów mikrich związanych z 14 chromosomami. Niektóre z najczęstszych syndromów sekwencji genów i ich objawów klinicznych przedstawiono w tabeli. 5-2.

Telomery - Edukacja, pokryta końcem długimi i krótkimi ramionami chromosomami. Składają się z powtarzalnych sekwencji TTAGGG i zapobiegają między sobą fuzji sekcji końcowych z chromosomami. Sondy teomeryczne odgrywają ważną rolę w rozpoznaniu złożonych transakcji, które nie mogą być określone przez tradycyjne metody cytogenetyczne. Ponadto jeden z odkryć projektu "ludzki genom" był fakt, że chromosomy regiony, sąsiednie do telomerów, są bogate w geny. Obecnie pokazano, że miski submikropowe subtelecombs są odpowiedzialne za występowanie wielu genetycznie zdeterminowanych chorób.

Hybrydyzacja kwasu nukleinowego in situ Metoda opiera się na możliwości tworzenia hybrydów dwułańcuchowych między sztucznie stworzonych sekwencji jednorazowych (Ribo-albo deoksyrybologiczna, oligo lub polinukleotyd) oznaczone sondami i sekwencjami uzupełniającymi w celach - analizowane DNA lub RNA molekuły. Aby zidentyfikować obszary hybrydyzacji próbki DNA (sonda DNA), uczynimy każdą grupę reporterową: ü z radioaktywnym izotopem, ü z fluorochromoma, ü przez enzym, który daje barwienie lub produkt luminescencyjny, ü Hapten, z którym oznakowany korpus jest związany i tak dalej.

Odsłaniając hybrydę ze względu na obecność w grupie reporterowej sondy jest możliwe, aby oszacować liczbę genów kodujących pewien rodzaj RNA, w celu określenia proporcji DNA przekroczenia Netrans w genomie - w celu ustalenia przyczepności niektórych genów Inne - i ich dokładna lokalizacja na chromosomach. Metoda hybrydyzacji molekularnej ma wysoką czułość (można zidentyfikować niewielką ilość oznaczonej sondy (10 -15 i 10-19 m), a odpowiednio, odpowiednio sekwencję komplementarną w celu) i szybkość analizy, która umożliwia korzystanie z Ta metoda zarówno dla działalności badawczej, jak i diagnozowania chorób dziedzicznych i zakaźnych w medycynie, medycynie weterynaryjnej i produkcji roślinnej.

Pojawienie się nowych technologii cytogetyki molekularnej, w oparciu głównie na hybrydyzacji in situ kwasów nukleinowych, znacznie rozszerzył możliwości diagnostyki chromosomowej.

Cytogenetyka interfaza: 1. Multicolor banding chromosomes (MVS). 2. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (ryba). 3. Kombinacja ryb z innymi metodami: -citologia + ryby; -Histology + ryby; -Munofenotypowanie + ryby (fikcja); Cytogenetyka metazna: 1. Solidne chromosomy (cały obraz). 2. Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH). 3. Karotypowanie z zmiennością kolorów (SSC). 4. Multicolor Karyotyping: Spex Karotyping (niebo); Multicolor Fish (M - Fish, M - Band).

Ryby - Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ jest metodą cytogenetyczną stosowaną do wykrywania i lokalizacji określonych sekwencji DNA na chromosomach, m. RNA itp. Sposób opiera się na hybrydyzacji fluorescencyjnej sondy DNA / RNA o komplementarnej sekwencji DNA / RNA. Identyfikacja etykiety występuje z mikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ryb została wprowadzona dłużej niż 30 lat temu. Jest szeroko rozpowszechniany jako sposób fizycznego odwzorowania genów na chromosomach. Później zaczął być stosowany w innych dziedzinach badań (w obszarach genetyki klinicznej, leku reprodukcyjne, toksykologii, biologii ewolucyjnej, genomiki porównawczej i komórkowej oraz biologii chromosomalnej). W tej chwili ryby są głównie wykorzystywane do budowy map fizycznych i genetycznych chromosomów, w celu zidentyfikowania strukturalnego przebudowy, translokacji, mikrodelilacji, amplifikacji genów w interfazie i chromosomach metafazy. W wyniku rozwoju nauki (lepsze zrozumienie właściwości chemicznych i fizycznych kwasów nukleinowych i chromatyny), a także rozwój mikroskopii fluorescencyjnej i wizualizacji cyfrowej, metoda jest stale ulepszona (ulepszona czułość, specyficzność, uprawnienia) i opracowano wiele wariantów tej metody.

1) Komórki są upuszczane do szklanej slajdów chromosomów do rozprzestrzeniania 4) chromosomy są licznikiem barwione przy użyciu DAPI 2) Fluorestly etykietowana sonda jest umieszczona na chromosach i seaydów. 3) sonda i chromosomy są denaturowane, hybrydyzowany następnie przemyto 5) slajdów jest oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym

Ogólny rodzaj protokołu dla preparatu ryb można przedłożyć w następujący sposób: 1. Przygotowanie leku histologicznego lub cytologicznego. Wytwarzanie preparatu histologicznego przeprowadza się zgodnie ze standardowym schemacją: przycinanie, oznakowanie, okablowanie, wypełnienie, mikrotomia, pomieszczenie do przechowywania szkła i opakowania. Przy wytwarzaniu leku cytologicznego stosuje się specjalne roztwory wytrącające i wirowanie, co umożliwia uzyskanie skoncentrowanej zawiesiny komórek. 2. Przetwarzanie wstępne (jeśli to konieczne). Lek jest traktowany proteazami, aby wyeliminować obecność białek, które utrudniają hybrydyzację. 3. Stosowanie sondy DNA na leku i późniejszym denaturacji. W celu oznaczenia sondy i DNA próbki, są one leczone formamidem i ogrzewane do temperatury około 85-900 C.

4. Hybrydyzacja. Po denaturacji lek ochłodzono do pewnej temperaturze (370 ° C w przypadku badań klinicznych) i inkubowano w komorze mokrej przez kilka godzin (czas trwania inkubacji jest wskazany w każdym konkretnym protokole). Obecnie automatyczne hybrydyzery są używane do denaturacji i hybrydyzacji. 5. Płukanie. Po zakończeniu hybrydyzacji konieczne jest umycie niepowiązanych sond, które w przeciwnym razie utworzy tło, które utrudnia, że \u200b\u200btrudno jest ocenić wyniki analizy rybnej. Do prania zwykle stosuje się roztwór zawierający cytrynian i chlorek sodu (SSC). 6. Counter-barwnik. Za pomocą barwników fluorescencyjnych (DAPI - 4, 6 -tydamidin-2 fenindlidol; jodek propidyny) przeprowadza się w kolorze wszystkich DNA jądrowego. 7. Analiza wyników z mikroskopem fluorescencyjnym. Wykonywanie rutynowych operacji (opakowanie, wstępne przetwarzanie, płukanie) mogą być zautomatyzowane.

Badanie sekcji telomerycznych z mikroskopem fluorescencyjnym. Obrazy uzyskane na etapie interfazu (jądra) i metafazy (poszczególne chromosomy) są łączone. Niebieski kolor - Dapi.

Zalety ryb - metoda: 1. Możliwość badania materiału genetycznego w juklei interfazowej; 2. Uzyskanie obiektywnych wyników zgodnie z zasadą "tak / nie" - jest to metoda ilościowa; 3. stosunkowo prosta interpretacja wyników; wysoka rozdzielczość. Wady rybne - Metody: 1. Barwniki fluorescencyjne Szybko "Fade"; 2. Dla Wyniki wyników potrzebny jest fluorescencyjny wysokiej jakości. Mikroskop.

Metoda rybna jest oparta na reakcji hybrydyzacji między DNA utworzonym zgodnie ze specjalnymi technologiami - sonda jest nukleotydem, sekwencją ograniczonej wielkości i komplementarnej sekcji DNA jądrowego badanego leku cytogenetycznego. Sonda DNA jest głównym elementem preparatu ryb niesie "etykietę", która zawiera nukleotydki bezpośrednio związane z fluorochroma lub Haptan w celu dalszej wizualizacji przez przeciwciała, które przenoszą fluorochrom. Niezwiązany znakowany DNA jest przemywany, a następnie wykrywanie hybrydyzowanej sondy DNA jest wykrywane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Etykieta DNA jest podzielona na bezpośrednie i pośrednie. Direct LABIA. Wprowadzenie do elementów reporterowych DNA - - fluorochromes (Rodamina, dietyloaminaninumina, Teksas czerwony itp.). Pośrednia metoda etykietowania - próbka DNA jest wstępnie sprzężona z pośrednimi liganami (biotyna, dioksigeninę, 2, 4-ditrofifenol), której obecność na preparacie cytologicznej jest następnie wykrywana za pomocą fluorochromów. W tym przypadku czułość metody wzrasta wiele, ponieważ ligand może zawierać kilka miejsc interakcji z fluorochroma. Po raz pierwszy in situ, hybrydyzacja z 32-p-etykietowaną sondę opisano w 1969 roku. Rozwój neradoaktywnych systemów etykietowania i wykrywania sond DNA wykonał metodę hybrydyzacji w bezpiecznym miejscu, łatwy do wykonywania i mniej pracochłonnych podczas przetwarzania wyników. Barwniki fluorescencyjne są miękkie i łatwe w użyciu, mogą być przechowywane w nieskończoność, dają wysoką rozdzielczość i umożliwić jednoczesne zbadanie kilku sekwencji DNA.

Sonda: jednorazowe / dwustoczelne sondy oznakowane DNA / RNA. Sondy są przestrzegane bezpośrednio: przez wkładanie nukleidów, do których z fluorochrocher (PCR lub Tłumaczenie Nicka) 2) przez cząsteczkę reporterową (PR: Digoxigenin, Biotyna), do którego przymocowane są fluorescencyjnie oznaczone przeciwciała. Aby wzmocnić sygnał, można użyć wtórnych, trzeciorzędowych itp. Przeciwciała, oznaczone etykietą fluorescencyjną. DNazy Nicks DNA Nick Transototion DNA Polimeraza Dodaje nukleoty do 3 'Hydroksyl DNA polimerazę DNA Usuwa poszczególne bazy z wizualizacji końcowej 5' 5 'chromosomów: C DAPI (2 mg / ml). 4 ', 6 -DIAMIDINO-2 -HENYLINDOLE; silny wiązanie z sekcjami DNA bogatymi A-T; wzbudzenie światła UV; Emisje 461 Nm (niebieski).

Obecnie dostępne są kilka głównych podejść, które są szeroko stosowane przez nowoczesne cytogenetyczne molekularne: identyfikacja rozszerzonych obszarów chromosomowych i całych chromosomów. Wykrywanie w obszarze interesu określonej sekwencji DNA. Analiza zaburzeń równowagi poszczególnych obszarów chromosomalnych. Aby zidentyfikować rozszerzone obszary chromosomalne i całe chromosomy, chromosomy są szeroko stosowane specyficzne i specyficzne sondy DNA ("Sondy malarskie").

Charakterystyka sond różnych typów 1. Sondy specyficzne dla lokalizacji (LSI - Locus - specyficzne identyfikatory, wiązanie z pewnymi sekcjami chromosomami.) Sondy te służą do identyfikacji dostępnych krótkich (niesłuszujących) sekwencji dedykowanego DNA, który jest Służy do przygotowania znakowanej sondy i jej późniejszej hybrydyzacji z zestawem chromosomów. Są one przeznaczone do zidentyfikowania diagnostycznie i prognostycznie znaczących aberracji chromosomalnych w różnych warunkach patologicznych (monosomia i trisomii dla poszczególnych chromosomów). Najbardziej rozpowszechniona rozkład tych próbek otrzymano w prenatalnej diagnostyce cytogenetycznej, zwłaszcza w badaniach komórek tkanek do roborowych, jąder interfazowych amniocytów.

2. DNA - Próbki do TelcomericProbe (Tel Telericprobe) są zaprojektowane tak, aby zidentyfikować usuwania i przebudowy wpływających na części końcowe chromosomów barku. Takie sondy są specyficzne dla chromosomów P- lub Q-Ramionowych i obszarów uzupełniających o długości około 300 ton. N. Od końca chromosomu. Z reguły, DNA - sondy na krótkie i długie chromosomy ramionowe są związane z różnymi fluorochromami, co pozwala zidentyfikować na jednym cytogenetycznym przygotowaniu obu telomerowych sekcji chromosomów.

3. Protestujący centrdy, podajniki alubowe lub chromosomalne (CEP - centromere. Wyliczanie. Sonda) są próbki DNA specyficzne dla chromosomo reprezentowane przez sekwencje Tandem Alpha i beta-satelitarne powtórzenia. Powtórzenia te znajdują się korzystnie w centromistrach lub podstawowych sekcjach heterochromatycznych chromosomów. Wraz z ich pomocą, każdy chromosom może być pomalowany w innym kolorze, co pozwala szybko określić liczbę chromosomów i odchyleń od nr normalnej, 4. Sonda na całym chromosomie, sondy solidno-chromosomalnej (WCP-całe chromosom Malowanie są zestawem) małych sond, komplementarnych do poszczególnych sekcji chromosomu, ale w ogóle obejmują całą jego długość. Korzystając z biblioteki takich sond, możesz "malować" wszystkie chromosom i uzyskać różnicowy spektralny kariotyp osoby. Ten rodzaj analizy stosuje się do analizy aberracji chromosomowych, takich jak translokacje, gdy kawałek jednego chromosomu jest przenoszony do ramienia innego.

Pola ryb stosowania jest powszechnie stosowany do rozwiązania następujących zadań klinicodiagnostic: 1. Preneratal związany z przetrzymaniem i diagnozą anomalii chromosomowych. Używany w klinikach nadzorujących (ECO) i centra perinatalne. Umożliwia terminowo (przed implantacją zarodków w przypadku ECO lub we wczesnych etapach rozwoju płodu), aby zidentyfikować naruszenia genetyczne przyszłych dzieci i podjąć niezbędne środki. 2. Oślenie. Choroby Otkohematologiczne występują w wyniku różnych abberatów chromosomalnych, w związku z tym, że stosuje się ich diagnozę, odpowiednie sondy CEP i LSI są używane. 3. Diagnoza guzów stałych. Obecnie ustanawiają się coraz bardziej spowodowane linkami między rozwojem konkretnych chorób onkologicznych i zmian specyficznych dla nich w genomie. Dlatego, gdy używasz odpowiedniego DNCSOV, możesz kontynuować diagnozę rybą onkologiczną.

Interfaznacytogenetyka: Kombinacja ryb z innymi metodami: -Imunofenotypowa ryba (fikcja); + Fikcja (odpływowy immunofenotypowanie i cytogenetyka interpozycji jako narzędzie do badania nowotworów) - do badania komórek nowotworowych. W tej analizie użyj niezmiennych uderzeń krwi, szpik kostny lub narkotyki innych tkanek. 1 Etap - preparaty inkubuje się ze specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi, 2 etapami - prowadzenie koniugacji z fluoroforami do późniejszej wizualizacji kompleksu przeciwciała antygenowo-monoklonalnego. 3 etapy - Hybrydyzacja in situ z sondami DNA. Aby zidentyfikować przeciwciała monoklonalne i sondy DNA, używane są fluorofory różnią się kolorami. Badanie leku pod mikroskopem fluorescencyjnym w obecności niezbędnego zestawu filtrów umożliwia jednoczesne przeanalizowanie immunofenotypu hybrydyzacji i sygnałów w jądrach interfazy.

ChromosomOdeletionof Tnfaip 3 w C. HL wykryty interfasetyki. Analizy fiction. Przedstawiciel C. Przypadki HL łączące. Ekspresja CD 30 (czerwona) i sondy rybne dla TNFAIP 3 i chromosom 6 centromere (niebieski [b]). W testach podwójnie kolorowych w A-C i E i F sonda TNFAIP 3 jest oznaczona na zielono (g); W testie potrójnie kolorowej stosowanej w D sonda TNFAIP 3 zapewnia sygnał G / Orange Colocalized (CO). Dwie różne strategie służą do wyświetlania podwójnych i potrójnych testów rybnych w połączeniu z immunofluorescencją CD 30; ja. mi. Testy dwukolorowe (A-C i E i F) są wyświetlane przy użyciu wyświetlacza potrójnie kolorowego, uzyskiwanego przez oprogramowanie ISIS jest stosowane do testu potrójnie-koloru (D) do jednoczesnego pokazania czterech kolorów (tj. CD 30 [R], Tnfaip 3 [G] i pomarańczowy i chromosomowy 6 centromere [b]).

Rekord cyfrowego mikrociągnięcia odkrył możliwość tłumaczenia na pseudo-obowiązek nie tylko kombinacje fluoroforów, ale także stosunków ich intensywności

Multicolor chromosomowy barwienie (Muli. Opaska kolorów - MCV) Ta metoda nie jest przeznaczona do pełnej analizy wszystkich chromosomów, ale przeprowadzić szczegółową analizę oddzielnego chromosomu. Sondy DNA specyficzne dla lokalizacji są wykonane przez różne fluorofory lub kombinacje fluoroforowe, tak aby poziom sygnału każdego z sond DNA zmienia się przez intensywność. Nakładanie się profili intensywności sond DNA Sygnały zapewnia różnice w stosunku intensywności fluorescencji różnych fluoroforów wzdłuż chromosomu. Relacje intensywności można przetłumaczyć na pseudoket, a zatem każdy punkt obrazu, aw konsekwencji każdy z loci chromosomalnych będzie odpowiadał jej pseudokomórka. Ten wariant metody ryb Multicolor był bardzo skuteczny, gdy analizuje nie tylko interchromosomalny, ale także wewnątrzlomorami przebudowy podczas raka. Jednak jego pomyślne zastosowanie musi być wstępnie określone przez chromosomy, który zostanie zbadany. Ta metoda cytogenetyki molekularnej nadaje się do analizy zakłóceń Karyotypu związanego z niektórymi chromosomami.

Obecnie utworzone sondy DNA, zapewniające MCV dla wszystkich chromosomów ludzkich Multicolor Bandingpit ludzki chromosom (Meta Ilustracja 5; Idiogram chromosomowy 5; fluorochromaty używane dla MCV).

Cytogennetyczne metazny, które pojawiły się historycznie przed interfazem, pozwala określić szeroką gamę zaburzeń chromosomowych, ale konieczne jest, aby komórki w badaniu znajdują się na metaphazowych metapach.

Multicolor analiza Karyotypowania przeprowadza się przy użyciu DNA sond stałych barwiących się do ramion lub całych chromosomów (sond WCP - Cała farba chromosomowa). Takie sondy są hybrydyzowane z licznych krótkich sekwencji DNA znajdujących się na całej długości chromosomu. Tak więc, gdy badając pod mikroskopem fluorescencyjnym chromosom wygląda jednolicie kolorowy w pewnym kolorze.

Sondy DNA stosowane do takiej analizy składają się z mieszaniny stałych sond barwiących do kompletnego zestawu chromosomy ludzkiej oznaczonej kombinacją kilku fluorochromów, którego stosunek jest wybrany indywidualnie dla każdej pary chromosomów. Korzystanie z odpowiednich metod rejestracji i programów komputerowych do analizy obrazu, który oszacuje intensywność blaszki wszystkich fluorochromów dla każdego punktu obrazu pozwala wykonać Karyotypowanie, w którym każda para chromosomów ma własny unikalny "pseudokell".

M-Fish (Multiplex Multifluor Multipleks. Ryba) jest powszechną nazwą dla tradycyjnych ryb wielokolorowych przy użyciu zestawów filtra specyficznych dla fluorochromów. Zasada M-Ryby przekłada się w oddzielnej rejestracji cyfrowej sygnału wszystkich zastosowanych fluorochromów, który jest osiągnięty przez sekwencyjną zmianę zestawów filtrujących. Wszystkie obrazy są rejestrowane w osobnych plikach, co pozwala im wykonać ich skuteczne przetwarzanie związane z oddzieleniem sygnału i tła, a także oszacowanie sygnału ilościowego. Przetwarzanie wszystkich zapisanych informacji za pomocą specjalnego oprogramowania przekłada informacje o poziomie sygnałów fluorochromowa na każdym obrazie w pseudo-obowiązku. Jednym z głównych ograniczeń liczby stosowanych sond DNA jest liczba dostępnych fluorochromów, z nieładującymi widmami wzbudzanymi i emisjami oraz obecnością odpowiednich zestawów filtrujących.

24-kolorowe ryby Najbardziej szerokie ryby M są używane jako 24-kolorowe ryby dla jednoczesnej identyfikacji materiału przez wszystkie chromosomy ludzkie. Ma wysoką wydajność wykrywania transakcji chromosomowych, ale nie ma na celu zidentyfikowania delecji i inwersji. Jednak problem ten może być częściowo rozwiązany przez jednoczesny chromosom DAPI, który umożliwia analizę różnicy przydzielonej z chromosomami, afiliacją chromosomalną materiału materiału jest już zidentyfikowane. Niestety, należy zauważyć, że jakość chromosomów Dapi-Banding po tym, jak M-Ryby jest znacznie gorszy od koloru GTGDivive, a nawet Dapi-banding po zwykłej hybrydyzacji in situ.

Rx. Ryba Zasada Fish M-Fish zastosowano do tworzenia wielofunkcyjnego paska chromosomu ludzkiego i metodą multicolor Bandingahromosos, na podstawie interspear in situ hybrydyzacji. W przeciwieństwie do 24 kolorowych ryb, ta metoda pozwala bezpośrednio zidentyfikować część przewodowań wewnątrzromozownych. Sondy DNA używane w RX. Ryba jest oznaczona kombinacją, 3-fluorochromami, która zapewnia 7 psów pseudooceli. Specjalnie kolorowe oddzielne obszary chromosomów, tworząc ich przydzielony kolor. Taka cecha próbek DNA dla RX. Ryby jest spowodowane sposobem, w jaki są one otrzymane. Są one specyficzne dla chromosomy biblioteki DNA dwóch rodzajów Gibbonów: Hylobates Concolor i Hylobates Syndactylus.

W wyniku intensywnych przebudowach chromosomalnych, które miało miejsce w tworzeniu nowoczesnych typów Gibbonów, ich chromosomy okazały się mocno przeciągane w porównaniu z organizacją chromosomu u ludzi, których chromosomy są znane ze swojego konserwatyzmu. Stosunek chromosomu 1 osoba do chromosomów gibonowych pokazano na rysunku 1,

Figura 2 przedstawia ogólny widok ludzkiego chromosomu uzyskanego w wyniku RX. Ryba. a) płyta metafazy b) układanie chromosomów.

Jednak RXFFIK ma wystarczająco poważne ograniczenia - restrukturyzacja chromosomów, która wystąpiła wewnątrz jednego koloru RX-pasma nie może być wykryta przy użyciu tej metody, jeśli nie prowadzą do znaczących i łatwo widocznych zmian w rozmiarze tego pasma. - Sondy są pomalowane na kilka obszarów chromosomowych różnych chromosomów w jednym pseudokomierze. Jednakże, ze wzrostem liczby zastosowanych fluorochromów metoda RXFFIZEm będzie bardziej informacyjna niż rutynowa ryba 24-kolorowa.

Zalety RXFFI zawiera obecnie następujące elementy: Metoda umożliwia analizę całego ludzkiego genomu w jednym eksperymencie Multicolor Fish. Dostępne są dostępne w handlu zestawy znakowanych próbek DNA i niezbędne systemy wykrywania. Metoda pozwala na szybką identyfikację znacznej części wewnętrznej i interchromosomalnych przegrupowania. Możliwe jest automatyczne identyfikowanie chromosomów metafazy "Banding Color". Dla każdego chromosomu ludzkiego znajduje się unikalny kod kreskowy. RXFFIK jest zintegrowany z stacją roboczą CYTO. Wizja i standardowe systemy mikroskopii fluorescencyjnej.

Spektrokariotypowanie (niebo-spektralkarytypowanie) Podstawowe zasady analizowania mikroskopijnych obrazów podczas widmowej Karyotypowania są praktycznie nie różniczym od użytej ryby M. Różnice są związane z metodą rejestracji obrazu. Technologia Sky umożliwia podczas jednego pomiaru, aby uzyskać krzywe widmowe dla wszystkich punktów obrazu, niezależnie od zależności z epifluorescencji lub z tradycyjną mikroskopią światła. W przypadku spektralnego Karyotypowania przez wszystkie chromosomy ludzkie, pięć fluorochromów stosuje się w zielonym widmie: dwa na czerwono i dwa w podczerwieni. Wzbudzenie i emisje wszystkich fluorochromów stosowanych w sondach DNA są stosowane w jednym zestawie filtrów, co pozwala uniknąć ich sekwencyjnej zmiany, pośrednich ognisku, aw konsekwencji, problemy związane z nimi, takie jak przesunięcie przestrzenne obrazu, definicja wartości progowych i masek segmentacyjnych. W oparciu o analizę krzywych widmowych, obecność lub brak określonych fluorochromów w tym punkcie jest określona.

Następnym krokiem jest procedura klasyfikacji, która umożliwia bezpośrednio i jednoznacznie określa przynależność chromosomalną analizowanej materiału. Zapewnia to niezawodną identyfikację (z dokładnością do chromosomu) przez chromosomy markerowe, a także chromosomy pochodne, które są konsekwencją różnych przegrupowania. Wielką zaletą nieba jest to, że kolor DAPI jest zarejestrowany równolegle do obrazu widmowego. Poprawa programu DAPI banding umożliwia uzyskanie otworu różnicowego w jakości w pobliżu GTG-banding. Możliwość równoległej analizy widmowej obrazu i wysokiej jakości różnicowych chromosomów kolorów znacznie upraszcza interpretację wyników nieba i umożliwia dokładniejsze określenie punktów przerw chromosomowych. Niewątpliwe zalety nieba odnosi się do możliwości wykorzystania fluorochromów z nakładającymi się widmami wzbudzenia i emisją, co znacznie rozszerza listę fluorochromów odpowiednich do stosowania fluorochromów, a także zwiększa liczbę, fluorochromy, które mogą być stosowane jednocześnie. Włączenie do listy nowych fluorochromu nie wymaga zakupu nowego zestawu filtrów, ponieważ wystarczy do jednego bloku filtra dla ryb widmowych i jednego bloku filtra dla DAPI.

Wady nieba obejmują: - długi czas ekspozycji wymagany do rejestrowania mikroskopijnych obrazów. - Niebo jest nieco bardziej wydajne niż M-Fish, w razie potrzeby, badania z stosunkowo małymi sondami DNA.

Karotypujący kolor koloru (CSKS zmieniający się kolorowy Karyotyping) Metoda ta opiera się na analizie różnicy długości sygnału między próbkami DNA, hybrydyzowaną z sondami DNA związanymi z fluorochromami oraz sondami nośnikami przeciwciała DNA. Metoda wystąpi, jeśli istnieją tylko 3 filtry i nie wymaga specjalnych komorowych i oprogramowania. Aby zidentyfikować chromosomy, przeprowadzana jest jedna hybrydyzacja, a dwa obrazy są uzyskiwane. Metoda opiera się na różnicy w długości sygnału fluorescencyjnego, ponieważ czas ekspozycji próbek DNA związanych z przeciwciałami wynosi 80 do 90% mniej niż próbki związane z fluorochromami. Po reakcji hybrydyzacji rozmazy są wykazywane z odpowiednimi pierwotnymi przeciwciałami, a następnie przeprowadzić wizualizację, aby dać pierwszy strzał. Preparaty są następnie wykazywane z wtórnymi przeciwciałami i avidinem związanym z tymi samymi fluorochromami. Rozmazów można kontrolować za pomocą DAPI.

W przyszłości otrzymuje się fotografie preparatów, używając przemian 3 filtrów. Obrazy te są porównywane za pomocą specjalnego oprogramowania, a drugi ujęcie jest uzyskiwany, na którym będą widoczne tylko chromosomy związane z niektórymi przeciwciałami. Tak więc niektóre chromosomy będą fluorescencyjne tylko w pierwszym lub drugim strzale, podczas gdy inne zmieni ich kolor na różnych zdjęciach.

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) Metoda została utworzona w celu zidentyfikowania zaburzeń ilościowych w genomie. Opiera się na reakcji hybrydyzacji in situ przy użyciu całego genomu jako DNA. Dedykowany i normalny DNNA DNNA ogłosiły fluorochromy różnych kolorów, obracając je w ten sposób w sondach DNA. Równoważne ilości tych sond mieszano i stosuje się w hybrydyzacji z kontrolą leku cytogenetycznego. Po rybach, metafaza analizowana jest na mikroskopie fluorescencyjnym, określając przy użyciu specjalistycznego programu analizy komputera intensywność fluorescencji dwóch fluorochromów wzdłuż całej długości każdego chromosomu.

W przypadku braku ilościowych zmian w Karyotypu badanego próbki, zaobserwowano pewien stosunek intensywności blasku dwóch fluorochromów. W przypadku wzmocnienia genów intensywność sygnału odpowiedniego fluorochroma zostanie zintensyfikowana, aw przypadku utraty części materiału genetycznego, wręcz przeciwnie, aby osłabić. W ten sposób CGH pozwala zidentyfikować nierównowagę genomową, ale ta metoda nie może być wykorzystana do wykrywania zrównoważonych transakcji i inwersji, a trisomii i delecje mogą być zdefiniowane tylko wtedy, gdy rozmiar niezrównoważonego obszaru wynosi co najmniej 10 milionów par nukleotydów.

Nierównowaga chromosomalna w próbce testowej szacowana jest przez różnicę intensywności fluorescencji dwóch różnych fluorochromów, obliczając relację fluorescencyjną (FD).

Metoda CGH ma wiele zalet w porównaniu z innymi sposobami analizy zmian w genomie: Po pierwsze, nie zależy od źródła badanego materiału i może być z powodzeniem przeprowadzona z niewielką ilością testowanego DNA, w tym archiwum materiał. Po drugie, pozwala uzyskać szczegółowe informacje o stratach lub zwiększaniu liczby kopii materiału genetycznego w całym genomie w jednym eksperymencie. Po trzecie, metoda CGH nie wymaga wytwarzania leków przez chromosom metafazy z badania tkanki, która jest, nie zależy od procesu uprawy komórek i powiązanych artefaktów.

Siota hybrydyzacja genomowa (hybrydyzacja genomicin situ, Gish) - wariant hybrydyzacji situ, który polega na tym, że do hybrydyzacji ze stałymi próbkami jakości fluorescencyjnie oznaczonej sondy, całkowitego genomowego DNA jednego typu ciała jest używany, z którym całkowity genomowy DNA konkuruje drugą formę ciała; Służy do określenia międzyspecyficznych i intraspekcyjnych różnic między genomami, przebudową chromosomalną, delecje podstawienia.

Wariacje Ryba 1) Q-Fish - Ryba ilościowa: Zaprojektowany przez Lansdorp i in.: U. M. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowsska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward i P. M. Lansdorp. 1998. Krótkie telomery na chromosom człowieka 17 p. NAT. Genet. 18: 76-80. Metoda ilościowa. Zaprojektowany do pracy z cytometrią przepływową. Początkowo wykorzystano do pomiaru długości chromosomu (rozdzielczość: 200 bp), licząc liczbę powtórzeń telomerowych. Używane są sondy sprzężone PNA. Początkowo zbadano chromosomy metafazy (rzeczywiste qFFY), obecnie ta metoda ma zastosowanie do chromosomów interfazowych (IQ-Fish). Q-Fish prowadzi się na hodowli komórek, sekcjach tkankowych (zarówno w okularach). Obecnie Q-Fish jest ważnym narzędziem w badaniu roli telomerów w procesach przetwarzania starzenia się i prowizji.

PNA-Fish - Peptyd Kwasy nukleinowe Ryby: Peptydowe kwasy nukleinowe (PNAS) - syntetyczne analogi DNA, w których oscylacja cukru fosforanu oscylowca podtrzymująca bazę azotową jest zastępowana przez nieuzapany rdzeń peptydowy. W wyniku takiej struktury: z hybrydyzującą sondy oligomerycznej z komplementarnym DNA / RNA, nie ma odpychania elektrostatycznego. Dopleksy PNA-DNA (PNA-RNA) są znacznie bardziej stabilne z naturalnym homo / heterodupleksami. Wysoka specyfika wiązania PNA-DNA: Hybrydyzacja PNA-DNA jest znacznie bardziej wrażliwa w odniesieniu do niespójności pary terenów niż hybrydyzację DNA-DNA. Tak więc za pomocą sondy PNA można rozróżnić między dwoma centromedami, różniące tylko jedną parę baz. PNA ma względną hydrofobowość (w porównaniu z DNA), w wyniku czego PNA jest lepsza interfigurowana przez ściany komórkowe \u003d\u003e Powszechne stosowanie w mikrobiologii. W oparciu o wysoką specyficzność wiązania: Uważa się, że technologia PNA wkrótce stanie się podstawą do tworzenia sond specyficznych dla alleli dla hybrydyzacji in situ. Jest stosowany w genetyce, cytogenetyce, epigenetyce, mikrobiologii itp.

3) Flow-Fish - Ryby dla cytometrii przepływowej: oferowane w 1998 r.: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, Dynamika Długość Telomere w ludzkich subpopulacjach limfocytów mierzonych przez cytometrię przepływową. Natura Biotechnol. 16, 743-747 (1998). Kombinacja Q-Fish and Flow Cytometria, umożliwiająca analizę (pomiaru) sygnału i sortowania. Dla ryb przepływowych stosuje się zawiesinę komórek (do pomiaru długości chromosomów telomerowych), spreadów chromosomalnych i dedykowanych chromosomów (do dalszego mapowania). Podobnie jak w q-rybach, oznaczonych PNA sondami telomerowymi (na przykład do wizualizacji i pomiaru długości powtórzeń telomerowych), główną zaletą jest szybsza metoda (analiza / sortowanie dużej liczby komórek / chromosomów). Jest on szeroko stosowany do studiowania różnych problemów: starzenie, ochrona telomeru, badanie zawieszenia hemotopoetycznego komórek macierzystych ex vivo, badanie bakterii.

Analiza multiparametryczna umożliwia różnicowanie typów komórek w jednej próbce, umożliwiając kontrolę wewnętrzną i analizę podtyp leukocytów.

Zalety przepływu ryb: łatwo powtarzalny wynik Umiejętność analizy podgrup komórek w populacji przy użyciu fizycznych immunofluorescencji i markerów jest lepsza wydajność niż w Q-Fish możliwość uzyskania danych ilościowych na temat fluorescencji tysięcy komórek.

Badanie chromosomu Wybrane przy użyciu metod cytometrii przepływowej 1. Sortuj według chromosomu przy użyciu cytometrii przepływowej - Karyotypowanie przy użyciu cytometrii przepływowej stosuje się do dalszego mapowania genów i konstruować bibliotek chromosomalnych. - Identyfikacja i lokalizacja genów na różnych chromosomach składa się z późniejszym wykorzystaniem metod etykietowania ryb / zagruntowanych in situ lub jego różnic i specyficznych chromosomów. - Do 2011 r. Z powodzeniem posortowano tylko 17 gatunków hodowanych roślin. - Sortuj według metafazy lub brudnych chromosomów z indeksem wysokiego podziału.

Etykieta fluorescencyjna: - chromosomy są utrudnione przez fluorochromy specyficzne dla kwasów nukleinowych. - Fluorochromy są wybierane zgodnie z 1) ze swoimi zasadami azotowymi, 2) z warunkami eksperymentalnymi (w tym z uwzględnieniem długości fal istniejących laserów). 1. W przypadku analizy monovariant, farby są używane, nie specyficzne dla par lub gc par: jodek propidowy (szczyt wzbudzenia: 535 Nm, emisje: 617 Nm, Wymagany laser: 488 NM-Argon Laser lub lampa + filtr długoterminowy) ETIDIUMBROMIDE (Szczyty wzbudzenia: 300 i 520 NM, Emisje: 600 Nm, Wymagany laser: 488 NM-Argon Laser Lampa + Filtr Długoterminowy) Tagi DNA Farba DNA nie zależy od zawartości A, G, T lub Casic Bases. 2. W przypadku analizy zaburzeń, użyj: chromycyny (specyficzne dla par podstawy G-C), szczyt A 3 wzbudzenia: 458 Nm, emisje 580 Nm. Laser:, 458 nm minimum 400 m. W mocy. Hoechst 33258 (specyficzne dla pary A-T bazgów), wzbudzenia: 351 -364 nm, emisja: 470 nm. Laser: 351 -364 Nm (potężny). Lasery powinny być rozdzielone w czasie i przestrzeni ze względu na częściowe nakładanie się widm fluorochromów.

2. Badania metodą chromosomów / sekwencji nukleotydowych po sortowaniu (do budowy map fizycznych i genetycznych itp.) Prins Fish Bac-Fish Prins C-Prins Studium dużych genomów z długimi chromosomami. Sekwencje odwzorowania z dużą liczbą powtórzeń (PR: Telomeryczne i Centromeds). Używaj krótkich sond. Dzięki dużej liczbie powtórzeń sygnał jest silny. Standardowa wartość sondy: 15 - 30 nukleotydów. Ryba.

Problemy z rybami: Trudno jest zlokalizować sekwencje jednorazowe DNA (I.E. Unikalne unikalne sekwencje DNA), ponieważ przy użyciu standardowych krótkich sond sygnał będzie bardzo słaby. Wzrost długości sondy do kilku kilobanów w celu zwiększenia sygnału zmniejszy czułość i \u003d\u003e do nienoskującego wiązania. Roztwór: Bac-Fish -Bac-Fish jest kombinacją metody ryb i stosowania genomowych klonów DNA wbudowanych w sztuczny chromosom bakteryjny (BAC), umożliwiający osadzenie dużych sekwencji DNA. - Skuteczna metoda identyfikacji i mapowania poszczególnych chromosomów organizmów z małymi genomami. Sonda wykorzystuje sondy BAC, overgos (nakładające się oligonukleotydy).

Alternatywa dla ryb: Prins Prins (zagruntowane etykietowanie in situ) - Sposób chromosomy Lame z wyżarzaniem podkładu DNA oligonukleotydowego o homologicznej sekwencji denaturowanej chromosomalnej DNA i kolejnego enzymatycznego wydłużenia podkładu in situ oznaczonych nukleotydami. Po raz pierwszy opisany Koch i in. W 1989 r. (Koch, Je, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N. i Bolund, I. (1989) Metody ograniczania oligonukleotydów do etykietowania specyficznych dla chromosomów alfa satelitarnego DNA in situ. Chromosoma 98, 259 - 265). Prins jest alternatywą dla ryb. Służy do zlokalizowania sekwencji nukleotydowych, rozpoznawania i odliczania metapsu lub chromosomów interfazowych lub par chromosomalnych (w tym aneuploidii chromosomalnej). Wyżarzanie nieznanego podkładu (podkład - nasiona) z badanym materiałem wydłużającym DNA z wykorzystaniem termostabilnej polimerazy DNA i etykietowane nukleotydes Reakcja (mocowanie cząsteczki blokującej do 3 "-Connet) Primer: Fragment restrykcji PCR Produkt oligonukleotydowa etykieta nukleotydowa: - Prosto ( Fluorochromas) - pośrednie (biotyny / kopalnia fluorochropizowana avidin / antiop) - tylko jedna para homologicznych chromosomów (jeden chromosom) można zidentyfikować w wynikach każdej reakcji prins. Następna reakcja Prins na tym samym szkle może być wykonywana tylko po zablokowaniu poprzedniego. - Jest używany do sekwencji DNA z dużą ilością powtórzeń.

Zalety Prins: 1. Wymagane jest minimalne informacje o sekwencji wymaganej do syntezy podkładu oligonukleotydowego. 2. Najszybsza i najprostsza metoda wykrywania sekwencji zainteresowania nas na chromosomie (w porównaniu z zastosowaniem ciężkich sond dla ryb, hybrydyzację bardzo dużym okresie czasu). 3. Wyjątek etapu testowego sondy. 4. Zdolność do wybierania podkładu z nukleotydami w celu zwiększenia sygnału C-Prins podczas wykrywania krótkich unikalnych sekwencji. Aby zidentyfikować małe powtórki lub krótkie unikalne sekwencje, używana jest bardziej wrażliwa metoda - prążki rowerowe (C -prins). Pransowanie C-Prins Proponited Gosden i in. W 1991 r. Ulepszony szeroko stosowany protokół - Kubaláková i in. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák Ma, Dole J (2001). Lokalizacja sekwencji DNA na chromosomach roślinnych za pomocą Prins i C-Prins. Metody w nauce komórkowej 23: 71 -82). C-Prins obejmuje szereg cykli termicznych podobnych do PCR.

Płyn osłonowy dla ryb: -BD Standard BioLocience (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Cytometria przepływowa i ryby, aby zmierzyć średnią długość telomerów (przepływów). 2006. Protokoły przyrody 1, - 2365 - 2376) -40 m. M KCL + 10 m. M na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Sortowanie przepływu chromosomów mitotycznych w pszenicy zwyczajnej (Triticum Aestivum L.). Genetyka. 2000; 156 (4): 2033 -41) -mg . SO 4 Bufor bez Dithiothreitolu (LJ. LI, L. MA, K. ARUGOGANATHAN, YC Piosence. Chromosomy posortowane przepływowe: drobny materiał do mapowania fizycznego genu roślinnego. Cariologia. 2006, Vol. 59, № 2: 99 -103) -Atoklaved 0. 1% (WT / VOL) \u200b\u200bNA. Cl -50 m. M na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Sortowanie chromosomów w pszenicy tetraploidalnej i jego potencjał do analizy genomu. Genetyka. 2005, 170 (2): 823-829) -Chromosome-stabilizujący bufor poliaminowy (Dajnkiewicy z, Robinson JP, Crissman H. Cytometria przepływowa, 2 nd. Część B. San Diego, CA. Press akademicki, Inc. 1994)

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ. lub metoda rybna (POL. Fluoresencja in situ. hybrydyzacja - Ryba. ) - metoda cytogenetyczna, która jest używana do wykrywania i określenia położenia określonej sekwencji DNA na chromosomach metafazy lub w jądrach interfazy in situ.. Ponadto ryby służy do identyfikacji konkretnego mRNA w próbce tkaniny. W tym drugim przypadku metoda ryb pozwala na ustalenie cech przestrzenno-czasowych ekspresji genów w komórkach i tkankach.

PRONDES.

Z hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ. Sondy DNA (próbki DNA) są używane, które są związane z celami uzupełniającymi w próbce. Sondy DNA obejmują nukleozydy oznaczone fluoroforem (bezpośrednią misją) lub takimi koniugatami, takimi jak biotyna lub digoksygenina (znakowanie pośrednie). Dzięki bezpośredniemu etykiecie, sonda DNA związana z celem można obserwować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego natychmiast po zakończeniu hybrydyzacji. W przypadku znakowania pośredniego konieczne jest dodatkowa procedura barwienia, podczas której wykryty biotynę przy użyciu avidin fluorescencyjnej lub steppendavidin i digoksygeniny - z przeciwciałami fluorescencyjnymi. Chociaż pośrednia wersja próbek DNA wymaga dodatkowych odczynników i kosztów czasu, ta metoda pozwala nam osiągnąć wyższy poziom sygnału ze względu na obecność cząsteczek flutorochromatyczne przeciwciała lub avidine cząsteczki 3-4. Ponadto, w przypadku etykiety pośredniej możliwa jest wzmocnienie sygnału kaskadowego.

Aby utworzyć próbki DNA, sklonowane sekwencje DNA, genomowe DNA, produkty PCR, oznaczone oligonukleotydy, a także DNA uzyskane przez mikrodalizację.

Etykietowanie sondy można prowadzić na różne sposoby, na przykład przez pseudonim lub z PCR z oznakowanymi nukleotydami.

Procedura hybrydyzacji.

Schemat eksperymentu na hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ. Zlokalizować pozycję genu w jądrze

W pierwszym etapie konstruowane są wnioski. Wielkość sondy powinna być wystarczająco duża, aby zapewnić, że hybrydyzacja odbywa się na określonej witrynie, ale nie zbyt duża (nie więcej niż 1 tys. N), aby nie zapobiegać procesowi hybrydyzacji. Podczas identyfikacji określonych lokalizacji lub podczas malowania całe chromosomy muszą blokować hybrydyzację próbek DNA z niezrozumiałe powtarzającymi się sekwencjami DNA, dodając do mieszaniny hybrydyzacji przez powtórki DNA nie wroga (na przykład DNA COT-1). Jeśli sonda DNA jest DNA dwuskładnikowym, musi być denaturowana przed hybrydyzacją.

Przy następnym etapie przygotowywane są preparaty jąder interfazy lub chromosomych metapowych. Komórki są zamocowane na podłożu, z reguły, na szybie ślizgowej przeprowadzane jest denaturacja DNA. Aby zachować morfologię, chromosomy lub denaturacji jąder prowadzi się w obecności formamidu, co zmniejsza temperaturę denaturacji do 70 °.

Wizualizacja podłączonych sond DNA prowadzona jest z mikroskopem fluorescencyjnym. Intensywność sygnału fluorescencyjnego zależy od wielu czynników - skuteczności etykiety do sondy, rodzaj sondy i rodzaju barwnika fluorescencyjnego.

Literatura

Rubtsov N.B. Metody pracy z chromosomami ssaków: badania. Ręczny / Nowosib. Stan UN-T. Nowosybirsk, 2006. 152 p.

Rubtsov N.B. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych in situ. W analizie anomalii chromosomowych. Rozdział w książce "Wprowadzenie do diagnostyki molekularnej" T. 2. "Molekularne metody genetyczne w diagnostyce chorób dziedzicznych i onkologicznych" / ed. MAMA Pedseva, D.V. Zaletaeva. Literatura edukacyjna dla studentów uniwersytetów medycznych. M.: Medycyna, 2011. T. 2. P. 100-136.

Notatki

Fundacja Wikimedia. 2010.

Oglądaj, co jest "hybrydyzacją fluorescencyjną in situ" w innych słowników:

Termin ten ma inne wartości, patrz hybrydyzację. Hybrydyzacja DNA, hybrydyzacja kwasu nukleinowego związku in vitro komplementarne jednowa łańcuchów kwasów nukleinowych w jednej cząsteczce. Z całkowitą komplementarnością ... Wikipedia

Metoda definicji hybrydyzacja fluorescencyjna in situ.

Materiał w badaniu Zobacz opis

Dostępne wyjazd do domu

Badanie służy do wybierania indywidualnej chemioterapii adiuwantowej podczas raka piersi lub z rakiem żołądka.

Rak piersi (RMW) przechodzi najpierw wśród chorób onkologicznych u kobiet. Komórki guzów piersiowych mogą zawierać różne rodzaje receptorów, które są wrażliwe na niektóre substancje (hormony lub inne biologicznie aktywne cząsteczki). W zależności od obecności komórek nowotworowych receptorów hormonalnych (estrogen i progesteronu) lub ludzkiego współczynnika wzrostu naskórka typu 2 (ludzki receptor czynnika wzrostu naskórka 2, HER2), receptor hormon-receptor-pozytywny, her2-pozytywny i potrójny negatywny rmzh. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę indywidualny wybór terapii i przewidzieć sukces traktowania.

HER2 jest receptorem, który jest obecny w tkankach i jest normalny, uczestniczący w regulacji podziału i zróżnicowania komórek. Nadmiar na powierzchni komórek nowotworowych (hiperwexpresji) jest z góry określony przez szybki niekontrolowany wzrost nowotworu, wysokiego ryzyka przerzutów i niskiej wydajności niektórych rodzajów leczenia. Her2 Hyperexpression w niektórych podtypach RMW prowadzi do wzmocnienia proliferacji i angiogenezy, a także naruszenie regulacji apoptozy (genetycznie zaprogramowane komórki samozniszczenia). Obecnie istnieją narkotyki, których celem jest receptor HER2. W szczególności Herceptin (Trastuzumab), który jest przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko receptorom HER2 / NEU.

Wzmocnienie i hiperekspresyjność HER2 (ERBB-2) są stosunkowo specyficzne zdarzenia dla raka piersi i praktycznie nie występują w nowotworach innych lokalizacji. Rak żołądka (Rs) jest jednym z niewielu wyjątków: Aktywacja HER2 odnotowano około 10-15% przypadków nowotworów złośliwych nowotworów tego organu i koreluje z agresywnym przebiegem choroby. Z nowotworami piersi HER2 na powierzchni komórek nowotworowych może być obecny nadmiar receptorów HER2 (który jest wskazany jako pozytywny status HER2 lub pozytywny status szary). Zjawisko to obserwuje się w 15-20% kobiet cierpiących na RMG. Ocena statusu HER2 jest ważna dla określenia taktyki leczenia.

Główne znormalizowane sposoby wykrywania HER2 / NEU i / lub wzmacniające genę HER2 / NEU - metody immunohistochemicznej (podłużnej) i hybrydyzacji fluorescencyjnych in situ (ryb). Oba badania prowadzą się na preparatach histologicznych (odcinki materiału nowotworowego, wypełnione parafiną) stosując przeciwciała poliklonalne (IDS), sondy fluorescencyjne (ryby) i różnych systemów wizualizacji.

Przy ocenie wyników reakcji dawnej wyrażenie jest uwzględniane tylko w inwazyjnym składniku guza. Ocena wyników reakcji przeprowadza się przy użyciu skali wynikowej: 0, 1+, 2+, 3+, opracowanego przez producenta badawczego i otrzymał zgodę ekspertów. Hercept-status, szacowany jako 0 i 1+, należy uznać za negatywne - hiper białka, jest nieobecny, który jest skorelowany z brakiem amplifikacji genu. Hercept-status, oszacowany jako 3+, jest dodatni, tj. Nadszedł wyrażenie hiper białka, który jest skorelowany z obecnością amplifikacji genów. Hercept-Status 2+ jest uważany za niepewny, tj. Według ekspresji białka, określony na podstawie reakcji immunohistochemicznej, niemożliwe jest pewność oceny wzmocnienia genu, więc badanie jest wymagane, bezpośrednio ujawniając obecność lub brak amplifikacji. Metoda ryb jest używana na sekcjach z tej samej próbki (bloku), na której przeprowadzono badania immunohistochemiczne. Wraz z hybrydyzacji ryb, oszacowanie obecności amplifikacji genu HER2 przeprowadza się przez obliczenie stosunku czerwonego fluorescencji (odpowiadającego oznaczonym genom HER2) i sygnałami zielonymi fluorescencyjnymi, które są oznaczone przez sekcję centrującą 17-osobowego chromosomu . Stosunek większy niż 2 wskazuje obecność amplifikacji HER2. Metoda ryb jest bardziej wrażliwa niż podłą, ponieważ umożliwia bezpośrednio ocenianie obecności lub braku wzmocnienia.

Materiał do badań: blok parafiny z bioptatem nowotworowym.

Uwaga! Upewnij się, że:

szkło z barwieniem IGI z przeciwciałami do Her2 / Neu
kierunek od lekarza lub wyciąg z wynikami badań histologicznych i ov z przeciwciałami do jej-2 / Neu

Literatura

Zavalishina L.e., Frank G.a. Studium morfologiczne Status HER2. Metodologia i atlas. - m.: Ed. Media medica. 2006: 98.
Choroby złośliwe w Rosji w 2011 r. (Zachorowalność i śmiertelność). Ed. W I. Nizova, v.v. Starinsky, g.v. Petrova. - M.: FGBU "Mnii ich. rocznie Herzen »Ministerstwo Zdrowia Rosji. 2013: 289.
Onkologia. Zalecenia kliniczne. Stowarzyszenie Onkologów Rosji. Ed. W I. Nizova, S.L. Daryalova. - m.: Ed. "Hotar-Media". 2008: 702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. i in. Trastuzumab w połączeniu z chemioterapią a her2-pozytywnym zaawansowanym gastrycznym lub gastro-oesophageal rakiem (TOGA): faza 3, open-etykiet, randomizowany kontrolowany próba. Lancet. 2010; 376: 687-697.
Dabbs D.J. Immunohistochemia diagnostyczna: aplikacje teranostyczne i genomowe. Elsevier, 4-th Edition. 2013: 960.
Ferlay J., Shin H.r., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. Globocan 2008, Częstość raka i śmiertelność i śmiertelność na całym świecie: IARC Baza raka nr 10. Lyon, Francja: Międzynarodowa Agencja Badań nad rakiem; 2010. Dostępne od: http://globocan.irc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann V., Senn H.J. Najważniejsze spotkanie: International Expert Consensus w zakresie terapii podstawowej wczesnego raka piersi 2005. Annale of onkology. 2005; 16 (10): 1569-1583.
Kurman R.j., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. Którzy klasyfikacją guzów kobiecego narządów reprodukcyjnych. Kto naciśnij, 4-TH EDITION. 2014; 4: 316.
Nordiqc. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.w., Park J.H. i in. Amplication Her2 / Neu jest niezależnym czynnikiem prognostycznym w raku żołądkowym. Choroby trawienne i nauki. 2006; 51 (8): 1371-1379.
Slamon D. i in. Adiuwant trastuzumab w her2-pozytywny rak piersi. Nowa Anglia Dziennik medycyny. 2011; 365: 1273-1283.