Fluorescējoša in situ hibridizācija. Fluorescējoša in situ hibridizācija (FISH)

Dažos gadījumos ar citoģenētisko pētījumu nepietiek, lai izdarītu secinājumu par kariotipu; šajos gadījumos tiek izmantotas molekulārās citoģenētiskās metodes, jo īpaši fluorescences in situ hibridizācija (angļu valodā - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

Jaunu tehnoloģiju rašanās molekulārajā citoģenētikā, kas balstīta galvenokārt uz nukleīnskābju hibridizāciju in situ, ir būtiski paplašinājusi hromosomu diagnostikas iespējas. In situ hibridizācijas metode ir izstrādāta, lai lokalizētu specifiskas DNS sekvences tieši citoloģiskajos preparātos. Hromosomu un hromosomu reģionu identificēšanā ir notikusi pāreja no hromosomu citoloģiskās organizācijas analīzes uz to DNS sekvenču analīzi, kas tos veido. Klasisko citoloģisko metožu efektivitātes salīdzinājums hromosomu pārkārtojumu noteikšanai un analīzei, piemēram, diferenciāla hromosomu krāsošana, ar modernām molekulārās citoģenētiskās tehnoloģijām parādīja, ka hematoloģisku traucējumu gadījumā hromosomu citoloģiskā analīze atklāj un pareizi identificē tikai aptuveni trešdaļu atkārtotu hromosomu diapazonu. izmantojot spektrālo kariotipēšanu (SKY). Apmēram trešā daļa pārkārtojumu tiek nepareizi identificēti ar citoloģiskām metodēm, un trešā daļa paliek pilnīgi nepamanīta. Klasiskās citoģenētiskās analīzes metodes ļauj noteikt tikai aptuveni 15% no SKY identificētajiem hromosomu pārkārtojumiem.

FISH metode izmanto fluorescējošas molekulas, lai krāsotu gēnus vai hromosomas in vivo. Metode tiek izmantota gēnu kartēšanai un hromosomu aberāciju identificēšanai.

Metode sākas ar īsu DNS sekvenču sagatavošanu, ko sauc par zondēm, kas papildina DNS sekvences, kas pārstāv pētījuma objektu. Zondes hibridizējas (saistās) ar komplementāriem DNS reģioniem un, pateicoties tam, ka tie ir marķēti ar fluorescējošu marķējumu, ļauj redzēt interesējošo gēnu lokalizāciju DNS vai hromosomās. Atšķirībā no citām hromosomu izpētes metodēm, kurām nepieciešama aktīva šūnu dalīšanās, FISH var veikt ar nedalāmām šūnām, padarot metodi elastīgu.

FISH var izmantot dažādiem mērķiem, izmantojot trīs dažādu veidu zondes:

* lokusam specifiskas zondes, kas saistās ar noteiktām hromosomu daļām. Šīs zondes izmanto, lai identificētu pieejamo izolētas DNS īso secību, ko izmanto marķētas zondes sagatavošanai un tās sekojošai hibridizācijai ar hromosomu kopu;
* alfa vai centromēru atkārtotās zondes ir hromosomu centromēru reģionu atkārtotas sekvences. Ar to palīdzību katru hromosomu var nokrāsot citā krāsā, kas ļauj ātri noteikt hromosomu skaitu un novirzes no to parastā skaita;
* Zondes visai hromosomai ir mazu zondu kopums, kas papildina atsevišķas hromosomas daļas, bet kopumā aptver visu tās garumu. Izmantojot šādu zondu bibliotēku, var "izkrāsot" visu hromosomu un iegūt indivīda diferenciālo spektrālo kariotipu. Šāda veida analīzi izmanto, lai analizētu hromosomu aberācijas, piemēram, translokācijas, kad vienas hromosomas gabals tiek pārnests uz citas hromosomas roku.

Fluorescējoši marķēta in situ hibridizācija (FISH)

Pētījuma materiāls ir asinis, kaulu smadzenes, audzēja biopsija, placenta, augļa audi vai amnija šķidrums. Paraugi analīzei laboratorijā jānogādā svaigi. Preparātus (slaidus) sagatavo tieši no audu paraugiem vai pēc to kultivēšanas. Var izmantot gan metafāzes, gan starpfāzu šūnu preparātus. Specifiskas DNS zondes, kas marķētas ar fluorescējošām iezīmēm, hibridizējas ar hromosomu DNS, un vienlaikus var izmantot vairākas zondes dažādos lokos.

FISH ir noderīga un jutīga citoģenētiskās analīzes metode, lai noteiktu kvantitatīvās un kvalitatīvās hromosomu aberācijas, piemēram, delēcijas (tostarp mikrodelecijas), translokācijas, dubultošanos un aneuploidiju. FISH uz starpfāzu hromosomām ir ātra metode 21., 18. vai 13. trisomijas vai dzimuma hromosomu aberāciju pirmsdzemdību diagnostikai. Onkoloģijā FISH var noteikt vairākas translokācijas (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), kas saistītas ar ļaundabīgiem hematoloģiskiem audzējiem. Šo metodi var izmantot arī, lai uzraudzītu vēža atlikušās sekas pēc ķīmijterapijas un kaulu smadzeņu transplantācijas un noteiktu pastiprinātus onkogēnus (c-myc/n-myc), kas saistīti ar sliktu prognozi dažiem audzējiem. FISH izmanto arī, lai uzraudzītu kaulu smadzeņu allotransplantāta izdzīvošanu, kas iegūta no pretējā dzimuma indivīda.

FISH ir jutīga metode hromosomu aberāciju noteikšanai un liela (> 500) šūnu skaita ātrai analīzei vienlaikus. Metode ir ļoti precīza, lai identificētu hromosomu raksturu un nezināmus hromosomu DNS fragmentus.

Tradicionālā citoģenētika pētot kariotipu, to vienmēr ierobežoja izšķirtspējas joslas līmenis. Pat ar augstas izšķirtspējas diferenciālo hromosomu krāsošanu mēs atradām tikai vairāk joslu katrā hromosomā, taču mēs nebijām pārliecināti, ka sasniedzam molekulāro izšķirtspējas līmeni. Nesenie DNS tehnoloģiju un citoģenētikas sasniegumi ir ļāvuši izmantot FISH metodes, lai analizētu hromosomu DNS izmaiņas molekulārā līmenī. Molekulārā citoģenētika ir nodrošinājusi revolucionāru izrāvienu citoģenētikā, ļaujot:

Analizēt hromosomu DNS struktūru diapazonā no 10-100 kilobāzēm;
diagnosticēt nedalāmas starpfāzes šūnas, kurām bija milzīga ietekme uz pirmsdzemdību diagnostiku un preimplantācijas ģenētisko diagnozi (PGD).

FISH tehnoloģija izmanto DNS zondi, kas saista vai renaturē noteiktas DNS sekvences hromosomā. Denaturēto zondi inkubē ar native šūnu DNS, kas arī tiek denaturēta līdz vienpavediena stāvoklim. Zonde aizstāj biotīna dezoksiuridīna trifosfātu vai digoksigenīna uridīna trifosfātu ar timidīnu. Pēc dabiskās DNS renaturēšanas ar zondi zondes-DNS kompleksu var noteikt, pievienojot ar fluorohromu iezīmētu biotīnu saistošu avidīnu vai ar fluorohromu iezīmētu antidigoksigenīnu. Papildu signāla pastiprināšanu var iegūt, pievienojot antiavidīnu un pārbaudot iegūto kompleksu, izmantojot fluorescences mikroskopiju. Marķējot dažādas DNS zondes ar vairākiem dažādiem fluorohromiem, vairākas hromosomas vai hromosomu segmentus vienā šūnā var vizualizēt vienlaikus kā daudzkrāsainus signālus.

Spēja definēt specifiski gēnu segmenti, kas atrodas vai nav hromosomās, ļāva diagnosticēt gēnu secību sindromus DNS līmenī, kā arī translokācijas starpfāzu kodolos, bieži vien atsevišķās šūnās.

materiāls priekš ZIVIS var kalpot vai nu metafāzes hromosomas, kas iegūtas no dalīšanās šūnām, vai starpfāzu kodoli no šūnām, kas neatrodas dalīšanās stadijā. Sekcijas tiek iepriekš apstrādātas ar RNāzi un proteināzi, lai noņemtu RNS, kas var krusteniski hibridizēties ar zondi un hromatīnu. Pēc tam tos karsē formamīdā, lai denaturētu DNS, un fiksē ar ledusaukstu spirtu. Pēc tam zondi karsējot sagatavo hibridizācijai. Pēc tam zondi un hromosomu preparātu sajauc un aizzīmogo ar pārklājumu 37 ° C temperatūrā hibridizācijai. Mainot inkubācijas temperatūru vai hibridizācijas šķīduma sāls sastāvu, var palielināt saistīšanās specifiku un samazināt fona marķējumu.

Fluorescējošas in situ hibridizācijas pielietojums – FISH tehnoloģija

FISH tehnoloģijas efektivitāte pirmo reizi tika pierādīts, lokalizējot gēnus uz . Ieviešot fluorescējošās marķēšanas metodi, in situ hibridizācija ir kļuvusi par neaizstājamu tādu hromosomu anomāliju diagnostikā, kuras netiek atklātas ar tradicionālajām joslu noteikšanas metodēm. FISH arī spēlēja galveno lomu vienā no neparastākajiem mūsdienu ģenētikas atklājumiem, genoma nospiedumu veidošanā.

Tās izstrādes tehnoloģija ZIVIS saņemtas trīs formās. Centromēru jeb alfa-satelītu zondes raksturo relatīva hromosomu specifika, tās visbiežāk izmantoja starpfāzu šūnu ģenētikā. Šīs zondes ģenerē nedaudz izkliedētus atbilstoša stipruma signālus centromēra reģionā, bet ne krusteniski hibridizējas ar hromosomām, kurām ir līdzīgas centromēru sekvences. Šobrīd ir izstrādātas vienas kopijas zondes, kas dod diskrētu signālu no konkrētas hromosomas joslas un ļauj izvairīties no krusteniskās hibridizācijas fenomena. Šīs zondes var izmantot arī, lai noteiktu kopiju skaitu un konkrētus hromosomu reģionus, par kuriem ir aizdomas, ka tie ir saistīti ar konkrēto sindromu. Prenatālajai diagnostikai tiek izmantotas vienas kopijas un centromēru zondes, kas paredzētas 13., 18., 21., X un Y hromosomām.

Ir iespējams arī "nokrāsot" veselas hromosomas ar ZIVIS. Pateicoties spektrālās kariotipēšanas tehnoloģijai, kurā tiek izmantots dažādu fluorohromu maisījums, tagad ir iespējams izveidot unikālu fluorescējošu rakstu katrai atsevišķai hromosomai ar 24 atsevišķām krāsām. Šī tehnoloģija ļauj noteikt sarežģītus hromosomu pārkārtojumus, kas nav redzami, izmantojot tradicionālās citoģenētiskās metodes.

Metode ZIVIS pirmsdzemdību diagnostikā. Sievietēm vecākajā reproduktīvā vecumā grūtniecība var būt iemesls ne tik daudz priekam, bet gan bažām. Ar sievietes vecumu ir saistīts augļa hromosomu anomāliju attīstības risks. Amniocentēze, ko veic 16. grūtniecības nedēļā, kam seko kariotipa analīze, ilgst 10-14 dienas. FISH izmantošana pirmspārbaudē ļauj ātrāk diagnosticēt un samazināt gaidīšanas laiku. Lielākā daļa ģenētiķu un laboratoriju uzskata, ka FISH metodi nevajadzētu izmantot atsevišķi, lai pieņemtu lēmumus par turpmāko grūtniecības pārvaldību. FISH metode ir jāpapildina ar kariotipisko analīzi, un tās rezultātiem jābūt vismaz korelē ar ultraskaņas (ultraskaņas) vai mātes asins bioķīmiskās skrīninga patoloģisko ainu.

Gēnu sindromi sekvences pazīstami arī kā mikrodelecijas sindromi vai segmentālā aneizomija. Tās ir blakus esošo hromosomu fragmentu dzēšanas, parasti ietverot daudzus gēnus. Gēnu sekvences sindromi pirmo reizi tika aprakstīti 1986. gadā, izmantojot klasiskās citoģenētiskās metodes. Tagad, pateicoties FISH, ir iespējams identificēt submikroskopiskās dzēšanas DNS līmenī, kas ļāva identificēt mazāko izdzēsto reģionu, kas saistīts ar konkrēta sindroma attīstību, ko sauc par kritisko reģionu. Kad ir identificēts sindroma kritiskais reģions, bieži vien ir iespējams identificēt konkrētus gēnus, kuru trūkums tiek uzskatīts par saistītu ar sindromu. Nesenajā gēnu sekvences sindromu rokasgrāmatā ir ziņots par 18 dzēšanas un mikrodelācijas sindromiem, kas saistīti ar 14 hromosomām. Daži no visbiežāk sastopamajiem gēnu sekvences sindromiem un to klīniskās izpausmes ir parādīti tabulā. 5-2.

Telomēri- veidojumi, kas aptver hromosomu garo un īso roku galus. Tie sastāv no atkārtotām TTAGGG sekvencēm un novērš hromosomu galu saplūšanu kopā. Telomēru zondēm ir svarīga loma sarežģītu translokāciju atpazīšanā, kuras nevar noteikt ar tradicionālajām citoģenētiskajām metodēm. Turklāt viens no cilvēka genoma projekta atklājumiem bija fakts, ka hromosomu reģioni, kas atrodas blakus telomēriem, ir bagāti ar gēniem. Tagad ir pierādīts, ka submikroskopiskas subtelomēras dzēšanas ir atbildīgas par daudzu ģenētiski noteiktu slimību rašanos.

Nukleīnskābju hibridizācija in situ Metodes pamatā ir iespēja veidot divpavedienu hibrīdus starp iezīmētām zondēm, kas mākslīgi izveidotas, pamatojoties uz vienpavedienu sekvencēm (ribo- vai dezoksiribo-, oligo- vai polinukleotīdu) un tām komplementārām sekvencēm. mērķi - analizētas DNS vai RNS molekulas. Lai identificētu hibridizācijas vietas, DNS zonde (DNS zonde) tiek marķēta ar reportieru grupu: ü radioaktīvs izotops, ü fluorohroms, ü ferments, kas rada traipu vai luminiscējošu produktu, ü haptēns, ar kuru saistās iezīmētais ķermenis, utt.

Nosakot hibrīdu reportieru grupas klātbūtnes dēļ zondē, var - novērtēt noteiktu RNS veidu kodējošo gēnu skaitu, - noteikt netranskribētās DNS īpatsvaru genomā, - noteikt noteiktu saikni. gēnus savā starpā un to precīzu atrašanās vietu hromosomās. Molekulārās hibridizācijas metodei ir augsta jutība (iespējams noteikt nelielu daudzumu iezīmētās zondes (10 -15 un 10 -19 M) un attiecīgi tās komplementāro secību mērķī) un ātra analīze, kas padara to. šo metodi iespējams izmantot gan pētnieciskai darbībai, gan iedzimtu un infekcijas slimību diagnostikai medicīnā, veterinārmedicīnā un augkopībā.

Jaunu tehnoloģiju rašanās molekulārajā citoģenētikā, kas balstīta galvenokārt uz nukleīnskābju hibridizāciju in situ, ir būtiski paplašinājusi hromosomu diagnostikas iespējas.

Starpfāzu citoģenētika: 1. Daudzkrāsu hromosomu joslas (MCB). 2. Fluorescējošā in situ hibridizācija (FISH). 3. FISH kombinācija ar citām metodēm: -citoloģija + FISH; -histoloģija + ZIVIS; -imūnfenotipēšana + ZIVIS (FICTION); Metafāzes citoģenētika: 1. Cietā hromosomu iekrāsošanās (Visa glezna). 2. Salīdzinošā genoma hibridizācija (CGH). 3. Krāsu maiņas kariotipēšana (CCK). 4. Daudzkrāsu kariotipēšana: spektrālā kariotipēšana (SKY); daudzkrāsains FISH (M - FISH, M - BAND).

FISH – fluorescences in situ hibridizācija – ir citoģenētiska metode, ko izmanto specifisku DNS sekvenču noteikšanai un lokalizācijai hromosomās, mRNS uc Metodes pamatā ir fluorescējoši iezīmētas DNS/RNS zondes hibridizācija ar komplementāru DNS/RNS sekvenci. Marķējums tiek noteikts, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. FISH metode tika ieviesta pirms vairāk nekā 30 gadiem. Tā ir kļuvusi plaši izplatīta kā metode gēnu fiziskai kartēšanai hromosomās. Vēlāk to pielietoja citās pētniecības jomās (klīniskās ģenētikas, reproduktīvās medicīnas, toksikoloģijas, evolūcijas bioloģijas, salīdzinošās un šūnu genomikas un hromosomu bioloģijas jomās). Šobrīd FISH galvenokārt izmanto hromosomu fizisko un ģenētisko karšu veidošanai, strukturālu pārkārtojumu, translokāciju, mikrodelāciju, gēnu amplifikācijas noteikšanai starpfāžu un metafāžu hromosomās. Zinātnes sasniegumu rezultātā (labāka izpratne par nukleīnskābju un hromatīna ķīmiskajām un fizikālajām īpašībām), kā arī fluorescences mikroskopijas un digitālās attēlveidošanas attīstība, metode ir pastāvīgi pilnveidota (jutības, specifiskuma, izšķirtspējas uzlabojumi) un ir izstrādātas daudzas šīs metodes variācijas.

1) Šūnas tiek nomestas uz stikla priekšmetstikliņa, izraisot hromosomu izplatīšanos. 4) Hromosomas tiek pretkrāsotas, izmantojot DAPI. 2) Fluorescējoši marķēta zonde tiek novietota uz hromosomām un noslēgta. 3) Zonde un hromosomas tiek denaturētas, hibridizētas un pēc tam mazgātas. 5) Priekšmetstikliņu skatās fluorescējošā mikroskopā.

FISH iestatīšanas protokola vispārīgo skatījumu var attēlot šādi: 1. Histoloģiskā vai citoloģiskā preparāta sagatavošana. Histoloģiskā preparāta sagatavošana tiek veikta saskaņā ar standarta shēmu: griešana, marķēšana, elektroinstalācija, izliešana, mikrotomija, griezuma novietošana uz stikla priekšmetstikliņa un deparafinēšana. Sagatavojot citoloģisko preparātu, tiek izmantoti speciāli izgulsnēšanas šķīdumi un centrifugēšana, kas ļauj iegūt koncentrētu šūnu suspensiju. 2. Iepriekšēja apstrāde (ja nepieciešams). Preparātu apstrādā proteāzes, lai novērstu to proteīnu klātbūtni, kas kavē hibridizāciju. 3. DNS zondes uzlikšana preparātam un sekojoša denaturēšana. Lai denaturētu zondi un DNS paraugu, tos apstrādā ar formamīdu un karsē līdz aptuveni 85-900 C temperatūrai.

4. Hibridizācija. Pēc denaturācijas zāles atdzesē līdz noteiktai temperatūrai (370 C klīnisko pētījumu gadījumā) un vairākas stundas inkubē mitrā kamerā (inkubācijas ilgums norādīts katrā konkrētajā protokolā). Pašlaik denaturēšanai un hibridizācijai tiek izmantoti automātiskie hibridizatori. 5. Mazgāšana. Kad hibridizācija ir pabeigta, nesaistītās zondes ir jānomazgā, pretējā gadījumā tas radītu fonu, kas apgrūtina FISH rezultātu novērtēšanu. Skalošanai parasti izmanto šķīdumu, kas satur citrātu un nātrija hlorīdu (SSC). 6. Pretkrāsošana. Ar fluorescējošu krāsvielu palīdzību (DAPI - 4, 6-diamidin-2 fenilindols; propīdija jodīds) tiek iekrāsota visa kodola DNS. 7. Rezultātu analīze, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. Ikdienas darbības (deparafinēšana, pirmapstrāde, mazgāšana) var tikt automatizētas.

Telomēru reģionu pārbaude, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. Starpfāzes (kodols) un metafāzes (atsevišķas hromosomas) stadijā iegūtie attēli tiek apvienoti. zila krāsa - DAPI.

FISH metodes priekšrocības: 1. Iespēja pētīt ģenētisko materiālu starpfāžu kodolos; 2. Objektīvu rezultātu iegūšana uz jā/nē ir kvantitatīvā metode 3.Salīdzinoši vienkārša rezultātu interpretācija;augsta izšķirtspēja.FISH metodes trūkumi:1.fluorescējošās krāsvielas ātri "izbalē";mikroskops.

FISH metodes pamatā ir hibridizācijas reakcija starp DNS zondi, kas izveidota, izmantojot īpašas tehnoloģijas, kas ir ierobežota izmēra nukleotīdu secība, un pētāmā citoģenētiskā preparāta kodola DNS komplementāru sekciju. DNS zonde ir galvenais elements FISH iestatīšanai, un tai ir "etiķete", t.i., tajā ir nukleotīdi, kas ir tieši saistīti ar fluorohromu vai haptēnu, lai to tālāk vizualizētu ar antivielām, kas satur fluorohromu. Nesaistītā marķētā DNS tiek nomazgāta un pēc tam hibridizētā DNS zonde tiek noteikta, izmantojot fluorescējošu mikroskopu.

DNS marķēšana ir sadalīta tiešā un netiešā. Tiešā marķēšana DNS ievada reportiera elementus - fluorohromus (rodamīnu, dietilaminokumarīnu, Teksasas sarkano u.c.). Netiešā marķēšanas metode - DNS paraugs tiek iepriekš konjugēts ar starpposma ligandiem (biotīns, dioksigenīns, 2, 4-dinitrofenols), kuru klātbūtne citoloģiskā preparātā pēc tam tiek noteikta, izmantojot fluorohromus. Šajā gadījumā metodes jutība ievērojami palielinās, jo ligandā var būt vairākas mijiedarbības vietas ar fluorohromu. In situ hibridizācija ar 32P iezīmētu zondi pirmo reizi tika aprakstīta 1969. gadā. Neradioaktīvu sistēmu izstrāde DNS zondu marķēšanai un noteikšanai ir padarījusi in situ hibridizācijas metodi drošu, viegli izpildāmu un mazāk darbietilpīgu rezultātu apstrādē. Fluorescējošās krāsvielas ir mīkstas un viegli lietojamas, tās var uzglabāt neierobežotu laiku, nodrošina augstu izšķirtspēju un ļauj vienlaikus pārbaudīt vairākas DNS sekvences.

Zondes: vienpavedienu/divpavedienu DNS/RNS primārās/sekundāri iezīmētās zondes. Zondes tiek marķētas: 1) tieši: ievietojot nukleotīdus, kuriem ir pievienots fluorohroms (PCR vai nick translācija) 2) caur reportiermolekulu (piem.: digoksigenīns, biotīns), kurai ir pievienotas fluorescējoši iezīmētas antivielas. Lai uzlabotu signālu, varat izmantot sekundārās, terciārās utt. antivielas, kas marķētas ar fluorescējošu marķējumu. DNāze ieskauj DNS Niku Translation DNS polimerāze I pievieno jaunus nukleotīdus 3' hidroksil-DNS polimerāze I noņem atsevišķas bāzes no 5' gala hromosomu attēlveidošanas: izmantojot DAPI (2 mg/ml). 4',6-diamidino-2-fenilindols; spēcīga saistīšanās ar A-T bagātiem DNS reģioniem; ierosināšana ar UV gaismu; emisija 461 nm (zils).

Pašlaik ir vairākas galvenās pieejas, ko plaši izmanto mūsdienu molekulārā citoģenētika: paplašinātu hromosomu reģionu un veselu hromosomu materiāla identificēšana. Konkrētas DNS sekvences noteikšana interesējošajā reģionā. Atsevišķu hromosomu reģionu nelīdzsvarotības analīze. Lai identificētu paplašināto hromosomu reģionu un veselu hromosomu materiālu, plaši tiek izmantotas hromosomām un reģionam specifiskās DNS zondes (“krāsošanas zondes”).

Dažādu veidu zondu raksturojums 1. lokusspecifiskās zondes (LSI - locus - specifiski identifikatori, kas saistās ar noteiktiem hromosomu reģioniem.) Šīs zondes izmanto, lai identificētu pieejamo izolētās DNS īso (neatkārtojamo) secību, kas tiek izmantota. lai sagatavotu iezīmētu zondi un tās turpmāko hibridizāciju ar hromosomu kopu. Tie ir paredzēti, lai noteiktu diagnostiski un prognostiski nozīmīgas hromosomu aberācijas dažādos patoloģiskos apstākļos (monosomija un trisomija atsevišķām hromosomām). Šo paraugu visizplatītākā izmantošana iegūta pirmsdzemdību citoģenētiskajā diagnostikā, īpaši horiona audu šūnu un amniocītu starpfāzu kodolu pētījumos.

2. DNS zondes uz hromosomu telomēriskajiem reģioniem (TEL telomerprobe) ir paredzētas, lai noteiktu dzēšanas un pārkārtošanās, kas ietekmē hromosomu zaru gala reģionus. Šādas zondes ir specifiskas hromosomu p- vai q-zariem un ir komplementāras apmēram 300 kb garam reģionam. no hromosomas beigām. Parasti DNS zondes īsajām un garajām hromosomu rokām ir saistītas ar dažādiem fluorohromiem, kas ļauj noteikt abus hromosomas telomērus reģionus vienā citoģenētiskajā preparātā.

3. centromēru atkārtošanās zondes, alfa vai hromosomu skaitītāji (CEP - centromērs. Uzskaitījums. Zonde) ir hromosomām specifiskas DNS zondes, kuras attēlo tandēma alfa un beta satelītu atkārtojumu sekvences. Šie atkārtojumi pārsvarā atrodas hromosomu centromēriskajos vai pericentromēriskajos heterohromatīna reģionos. Ar to palīdzību katru hromosomu var nokrāsot citā krāsā, kas ļauj ātri noteikt hromosomu skaitu un novirzes no to parastā skaita, papildinot atsevišķas hromosomas sadaļas, bet kopumā aptverot visu tās garumu. Izmantojot šādu zondu bibliotēku, var "izkrāsot" visu hromosomu un iegūt indivīda diferenciālo spektrālo kariotipu. Šāda veida analīzi izmanto, lai analizētu hromosomu aberācijas, piemēram, translokācijas, kad vienas hromosomas gabals tiek pārnests uz citas hromosomas roku.

Pielietojums FISH tiek plaši izmantots šādu klīniskās diagnostikas uzdevumu risināšanai: 1. Perimplantācija pirmsdzemdību un hromosomu anomāliju diagnostika. Izmanto in vitro apaugļošanas (IVF) klīnikās un perinatālajos centros. Ļauj savlaicīgi (pirms embrija implantācijas IVF gadījumā vai augļa attīstības sākumposmos) identificēt ģenētiskos traucējumus vēl nedzimušam bērnam un veikt nepieciešamos pasākumus. 2. Onkohematoloģija. Onkohematoloģiskās slimības rodas dažādu hromosomu aberāciju rezultātā, tāpēc to diagnostikai tiek izmantotas atbilstošas CEP un LSI zondes. 3. Solīdu audzēju diagnostika. Pašlaik arvien vairāk tiek konstatētas cēloņsakarības starp specifisku vēža attīstību un specifiskām izmaiņām to genomā. Tāpēc, izmantojot atbilstošas DNS zondes, ir iespējams veikt onkoloģisko FISH diagnostiku.

Starpfāzu citoģenētika: FISH kombinācija ar citām metodēm: - FISH imūnfenotipēšana (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) - audzēju šūnu izpētei. Šai analīzei tiek izmantotas nekrāsotas asiņu, kaulu smadzeņu vai citu audu preparātu uztriepes. 1. posms - preparātus inkubē ar specifiskām monoklonālām antivielām, 2. posms - konjugāciju ar fluoroforiem veic turpmākai antigēnu-monoklonālo antivielu kompleksa vizualizācijai. 3. posms - veic in situ hibridizāciju ar DNS zondēm. Fluorofori, kas atšķiras pēc krāsas, tiek izmantoti, lai noteiktu monoklonālās antivielas un DNS zondes. Preparāta izpēte fluorescējošā mikroskopā ar nepieciešamo filtru komplektu ļauj vienlaicīgi analizēt hibridizācijas imūnfenotipu un signālus starpfāzu kodolos.

TNFAIP 3 hromosomu dzēšana c. HL atklāts ar starpfāzu citoģenētiku. FICTION analīzes par. pārstāvis c. HL gadījumi apvienoti. CD 30 ekspresija (sarkana) un FISH zondes TNFAIP 3 un 6. hromosomas centromēram (zils [b]). Divkrāsu testos A–C un E un F zonde TNFAIP 3 ir marķēta zaļā krāsā (g); trīskrāsu testā, kas izmantots D, TNFAIP 3 zonde dod g/oranžu kolokalizētu (co) signālu. Tiek izmantotas divas dažādas stratēģijas, lai parādītu dubultās un trīskrāsu FISH testus kombinācijā ar CD 30 imunofluorescenci; i. e. , dubultkrāsu testi (A–C un E un F) tiek parādīti, izmantojot trīskrāsu displeju, savukārt viltus daudzkrāsu displejs, kas iegūts ar Isis programmatūru, tiek izmantots trīskrāsu testam (D), lai vienlaikus parādītu četras krāsas ( i., CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] un oranžs, un 6. hromosomas centromērs [b]).

Mikroattēlu digitālā ierakstīšana ir pavērusi iespēju pseidokrāsās pārvērst ne tikai fluoroforu kombinācijas, bet arī to attiecības, intensitātes

Hromosomu daudzkrāsu krāsošana (Muli. Color Banding — MSV) Šī metode nav paredzēta pilnīgai visu hromosomu analīzei, bet gan vienas hromosomas detalizētai analīzei. Vietai specifiskās DNS zondes ir marķētas ar dažādiem fluoroforiem vai fluoroforu kombinācijām, lai katras DNS zondes signāla līmenis atšķiras pēc intensitātes. DNS zondes signālu intensitātes profili, kas pārklājas, nodrošina dažādu fluoroforu fluorescences intensitātes attiecību atšķirības gar hromosomu. Intensitātes koeficientus var pārvērst pseidokāsās, un tādējādi katram attēla punktam un līdz ar to katram hromosomu lokam būs sava pseidokrāsa. Šī daudzkrāsu FISH metodes versija izrādījās ļoti efektīva ne tikai starphromosomu, bet arī intrahromosomu pārkārtojumu analīzē onkoloģisko slimību gadījumā. Tomēr, lai to veiksmīgi izmantotu, vispirms ir jānosaka hromosoma, kas tiks izmeklēta. Šī molekulārās citoģenētikas metode ir piemērota ar noteiktām hromosomām saistītu kariotipa traucējumu analīzei.

Līdz šim ir izveidoti DNS zondu komplekti, kas nodrošina MCV visām cilvēka hromosomām 5. hromosomā; 5. hromosomas daudzkrāsu joslas; 5. hromosomas idiogramma; fluorohromi, ko izmanto MSV).

Metafāzes citoģenētika, kas vēsturiski radusies agrāk nekā starpfāzu citoģenētika, ļauj noteikt plašu hromosomu traucējumu klāstu, taču tas prasa, lai pētāmās šūnas būtu mejozes metafāzes stadijā.

Daudzkrāsu kariotipēšana Analīze tiek veikta, izmantojot DNS zondes ar nepārtrauktu krāsošanu uz rokām vai veselām hromosomām (WCP zondes - veselas hromosomas krāsa). Šādas zondes hibridizējas ar daudzām īsām DNS sekvencēm, kas atrodas visā hromosomas garumā. Tādējādi, skatoties fluorescējošā mikroskopā, hromosoma šķiet vienmērīgi iekrāsota noteiktā krāsā.

Šajā analīzē izmantotās DNS zondes sastāv no cietu krāsošanas zondu maisījuma pilnam cilvēka hromosomu komplektam, kas marķēts ar vairāku fluorohromu kombināciju, kuru attiecība tiek izvēlēta atsevišķi katram hromosomu pārim. Atbilstošu reģistrācijas metožu un datorprogrammu izmantošana attēlu analīzei, kas novērtē visu fluorohromu luminiscences intensitāti katram attēla punktam, ļauj veikt kariotipēšanu, kurā katram hromosomu pārim ir sava unikālā "pseidokrāsa". ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor or multiplex. FISH) ir vispārīgs nosaukums tradicionālajām daudzkrāsu FISH, kas izmanto fluorohromam specifiskus filtru komplektus. M-FISH princips sastāv no visu izmantoto fluorohromu signāla atsevišķa digitāla ieraksta, kas tiek panākts, secīgi mainot filtru komplektus. Visi attēli tiek ierakstīti atsevišķos failos, kas ļauj veikt to efektīvu apstrādi, kas saistīta ar signāla un fona atdalīšanu, kā arī signāla kvantitatīvo noteikšanu. Visas ierakstītās informācijas apstrāde ar speciālas programmatūras palīdzību pārvērš informāciju par fluorohroma signālu līmeni katrā attēla punktā pseidokāsās. Viens no galvenajiem izmantoto DNS zondu skaita ierobežojumiem ir pieejamo fluorohromu skaits ar nepārklājošiem ierosmes un emisijas spektriem, kā arī atbilstošu filtru komplektu pieejamība.

24 krāsu FISH Visplašāk izmantotais M-FISH ir 24 krāsu FISH, lai vienlaicīgi identificētu materiālu no visām cilvēka hromosomām. Tas ir ļoti efektīvs hromosomu translokāciju noteikšanā, bet nav paredzēts dzēšanas un inversiju noteikšanai. Tomēr šo problēmu var daļēji atrisināt, vienlaikus krāsojot hromosomas ar DAPI, kas ļauj analizēt to hromosomu diferenciālo svītrojumu, kuru hromosomu materiāls jau ir identificēts. Diemžēl jāatzīmē, ka hromosomu DAPI joslu kvalitāte pēc M-FISH ir ievērojami zemāka par GTG diferenciālo krāsošanu un pat DAPI joslu pēc parastās in situ hibridizācijas.

Rx. FISH M-FISH princips ir izmantots, lai ģenerētu daudzkrāsu svītrkodu cilvēka hromosomām un daudzkrāsu hromosomu joslu noteikšanas metodi, kuras pamatā ir starpsugu in situ hibridizācija. Atšķirībā no 24 krāsu FISH, šī metode ļauj tieši noteikt daļu intrahromosomu pārkārtojumu. Rx izmantotās DNS zondes. FISH marķēta ar 3 fluorohromu kombināciju, kas nodrošina 7 pseido krāsas. Tie īpaši krāso atsevišķus hromosomu reģionus, radot to krāsu svītras. Šī Rx DNS paraugu iezīme. ZIVIS nosaka to iegūšanas veids. Tās ir hromosomām specifiskas divu gibonu sugu DNS bibliotēkas: Hylobates concolor un Hylobates syndactylus.

Mūsdienu gibonu sugu veidošanās laikā notikušo intensīvo hromosomu pārkārtojumu rezultātā to hromosomu materiāls izrādījās ļoti sajaukts, salīdzinot ar hromosomu organizāciju cilvēkiem, kuru hromosomas ir pazīstamas ar savu konservatīvismu. Cilvēka 1. hromosomas attiecība pret gibona hromosomām ir parādīta 1. attēlā,

2. attēlā parādīts vispārējs skats uz cilvēka hromosomām, kas iegūtas Rx rezultātā. ZIVIS. a) Metafāzes plāksne b) Hromosomu izkārtojums.

Tomēr RXFISH ir nopietni ierobežojumi - hromosomu pārkārtojumus, kas notikuši vienā krāsu RX joslā, nevar noteikt, izmantojot šo metodi, ja vien tie neizraisa būtiskas un viegli pamanāmas izmaiņas šīs joslas izmērā. - zondes iekrāso vairākus dažādu hromosomu hromosomu reģionus vienā pseidokrāsā. Tomēr, palielinoties izmantoto fluorohromu skaitam, RXFISH metode neapšaubāmi būs informatīvāka nekā parastā 24 krāsu FISH.

RXFISH priekšrocības pašlaik ietver šādus punktus: Metode ļauj analizēt visu cilvēka genomu vienā daudzkrāsu FISH eksperimentā. Ir pieejami komerciāli pieejami marķētu DNS zondu komplekti un nepieciešamās noteikšanas sistēmas. Metode ļauj ātri identificēt ievērojamu intra- un starphromosomu pārkārtojumu daļu. Ir iespējama “krāsu joslu” metafāzes hromosomu automātiska identificēšana. Katrai cilvēka hromosomai ir unikāls krāsu svītrkods. RXFISH ir integrēts Cyto darbstacijā. Redzes un standarta fluorescences mikroskopijas sistēmas.

Spektrālā kariotipēšana (SKY-spectralkaryotyping) Mikroskopisko attēlu analīzes pamatprincipi spektrālās kariotipizācijā ir praktiski tādi paši kā M-FISH. Atšķirības ir saistītas ar attēla reģistrēšanas veidu. SKY tehnoloģija ļauj iegūt spektrālās līknes visiem attēla punktiem viena mērījuma laikā neatkarīgi no tā, vai tas ir saistīts ar epifluorescenci vai ar tradicionālo gaismas mikroskopiju. Visu cilvēka hromosomu spektrālajai kariotipēšanai tiek izmantoti pieci fluorohromi, viens zaļajā spektrā, divi sarkanā un divi infrasarkanajā. Visu DNS zondu marķēšanā izmantoto fluorohromu ierosināšana un emisija notiek ar vienu filtru komplektu, kas ļauj izvairīties no to secīgas maiņas, starpfokusēšanas un līdz ar to saistītām problēmām, piemēram, attēla telpiskās nobīdes, robežvērtību noteikšanas. un segmentācijas maskas. Pamatojoties uz spektrālo līkņu analīzi, nosaka specifisku fluorohromu esamību vai neesamību noteiktā punktā.

Nākamais solis ir klasifikācijas procedūra, kas ļauj tieši un nepārprotami noteikt analizējamā materiāla hromosomu piederību. Tas nodrošina uzticamu marķiera hromosomu materiāla, kā arī dažādu pārkārtojumu rezultātā radušos hromosomu atvasinājumu identificēšanu (līdz hromosomai). SKY lielā priekšrocība ir tā, ka DAPI krāsojums tiek reģistrēts paralēli spektrālajam attēlam. Programmatūras DAPI joslu uzlabošana ļauj sasniegt diferenciālu svītrojumu kvalitātē, kas ir tuvu GTG joslām. Spektrālā attēla paralēlās analīzes un hromosomu kvalitatīvās diferenciālās krāsošanas iespēja ievērojami vienkāršo SKY rezultātu interpretāciju un ļauj precīzāk noteikt hromosomu pārtraukumu punktus. Neapšaubāmas SKY priekšrocības ietver iespēju izmantot fluorohromus ar pārklājošiem ierosmes un emisijas spektriem, kas ievērojami paplašina izmantojamo fluorohromu sarakstu, kā arī palielina vienlaikus lietojamo fluorohromu skaitu. Jauna fluorhroma iekļaušanai sarakstā nav jāiegādājas jauns filtru komplekts, jo SKY pietiek ar vienu filtru vienību spektrālajam FISH un vienu filtra bloku DAPI.

SKY trūkumi ietver: - ilgu ekspozīcijas laiku, kas nepieciešams mikroskopisku attēlu ierakstīšanai. - SKY ir nedaudz mazāk efektīva nekā M-FISH, ja runa ir par pētniecību ar salīdzinoši mazām DNS zondēm.

Krāsu mainīgā kariotipēšana (CCK Krāsu mainīgā kariotipēšana) Šīs metodes pamatā ir signāla garuma atšķirības analīze starp DNS paraugiem, kas hibridizēti ar DNS zondēm, kas saistītas ar fluorohromiem, un DNS zondēm, kas satur antivielas. Metode ir iespējama tikai ar 3 filtriem, un tai nav nepieciešamas īpašas kameras un programmatūra. Lai identificētu hromosomas, tiek veikta viena hibridizācija un iegūti divi attēli. Metodes pamatā ir fluorescējošā signāla garuma atšķirība, jo ar antivielām saistīto DNS paraugu ekspozīcijas laiks ir par 80–90% mazāks nekā paraugiem, kas saistīti ar fluorohromiem. Pēc hibridizācijas reakcijas uztriepes tiek pakļautas atbilstošām primārajām antivielām un pēc tam tiek vizualizētas, lai iegūtu pirmo attēlu. Pēc tam priekšmetstikliņus pakļauj sekundārajām antivielām un avidīnam, kas saistīts ar tiem pašiem fluorohromiem. Sitienus var nokrāsot, izmantojot DAPI.

Nākotnē preparātu attēlus atkal iegūst, izmantojot pēc kārtas 3 filtrus. Šie attēli tiek salīdzināti, izmantojot īpašu programmatūru, un tiek iegūts otrs attēls, kurā būs redzamas tikai ar noteiktām antivielām saistītās hromosomas. Tādējādi dažas hromosomas fluorescēs tikai pirmajā vai otrajā skenēšanas reizē, bet citas mainīs krāsu dažādās skenēšanas reizē.

Salīdzinošā genoma hibridizācija (CGH) Metode tika izveidota, lai identificētu kvantitatīvus traucējumus genomā. Tas ir balstīts uz in situ hibridizācijas reakcijas veikšanu, izmantojot visu genomu kā DNS zondi. Izolētā un normāla donora DNS tiek marķēta ar dažādu krāsu fluorohromiem, tādējādi pārvēršot tos par DNS zondēm. Ekvivalentus daudzumus šīs zondes sajauc un izmanto hibridizācijā ar kontroles citoģenētisko preparātu. Pēc FISH metafāzes tiek analizētas fluorescējošā mikroskopā, izmantojot specializētu datora attēlu analīzes programmu, lai noteiktu divu fluorohromu fluorescences intensitāti visā katras hromosomas garumā.

Ja testa parauga kariotipa kvantitatīvām izmaiņām nav, tiks novērota noteikta abu fluorohromu luminiscences intensitātes attiecība. Gēnu amplifikācijas gadījumā palielināsies atbilstošā fluorohroma signāla intensitāte, bet ģenētiskā materiāla daļas zuduma gadījumā, gluži pretēji, vājināsies. Tādējādi CGH ļauj noteikt genoma nelīdzsvarotību, taču šo metodi nevar izmantot, lai noteiktu sabalansētas translokācijas un inversijas, un trisomijas un dzēšanas var noteikt tikai tad, ja nelīdzsvarotā reģiona izmērs ir vismaz 10 miljoni bāzes pāru.

Hromosomu nelīdzsvarotību testa paraugā aprēķina pēc divu dažādu fluorohromu fluorescences intensitātes starpības, aprēķinot fluorescēšanas koeficientu (RF).

CGH metodei ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar citām genoma izmaiņu analīzes metodēm: Pirmkārt, tā nav atkarīga no testa materiāla avota, un to var veiksmīgi veikt ar nelielu daudzumu pārbaudītas DNS, ieskaitot arhīvu materiālu. Otrkārt, tas ļauj iegūt detalizētu informāciju par ģenētiskā materiāla kopiju skaita zudumu vai pieaugumu visā genomā vienā eksperimentā. Treškārt, CGH metode neprasa metafāzes hromosomu preparātu sagatavošanu no pētāmajiem audiem, tas ir, tā nav atkarīga no šūnu kultivēšanas procesa un ar to saistītajiem artefaktiem.

Genomiskā situ hibridizācija (genomicin situ hybridization in, GISH) ir situ hibridizācijas metodes variants, kas sastāv no tā, ka hibridizācijai ar fiksētiem paraugiem kā fluorescējoši iezīmētu zondi izmanto vienas organismu sugas kopējo genoma DNS, ar ar ko konkurē citas organismu sugas kopējā genoma DNS; izmanto, lai noteiktu starpsugu un intrasugu atšķirības genomos, hromosomu pārkārtošanās, svītrojumi un aizvietojumi.

FISH variācijas 1) Q-FISH — kvantitatīvā FISH: izstrādāja Lansdorps et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward un P. M. Lansdorp. 1998. Īsi telomēri cilvēka hromosomā 17 lpp. Nat. Genet. 18:76-80. kvantitatīvā metode. Paredzēts darbam ar plūsmas citometriju. Sākotnēji to izmantoja, lai izmērītu hromosomu garumu (izšķirtspēja: 200 bp), skaitot telomēru atkārtojumu skaitu. Tiek izmantotas PNA konjugētas zondes. Sākotnēji tika pētītas metafāzes hromosomas (pareizi QFISH), tagad šī metode ir piemērojama arī starpfāzu hromosomām (IQ-FISH). Q-FISH veic uz šūnu kultūru, audu sekcijām (abām uz brillēm). Šobrīd Q-FISH ir nozīmīgs instruments, pētot telomēru lomu novecošanās un vēža veidošanās procesos.

PNA-FISH — peptīdu nukleīnskābes FISH: peptīdu nukleīnskābes (PNS) ir sintētiski DNS analogi, kuros dezoksiribozes fosfāta cukura mugurkauls, kas atbalsta slāpekļa bāzi, ir aizstāts ar neuzlādētu peptīdu mugurkaulu. Šīs struktūras rezultātā: kad PNA-oligomēra zonde hibridizējas ar komplementāru DNS/RNS, elektrostatiskā atgrūšanās nenotiek. PNA-DNS (PNA-RNS) dupleksi ir daudz stabilāki nekā dabiskie homo/heterodupleksi. Augsta PNS-DNS saistīšanās specifika: PNS-DNS hibridizācija ir daudz jutīgāka pret bāzu pāru neatbilstību nekā DNS-DNS hibridizācija. Tādējādi, izmantojot PNA zondi, var atšķirt divus centromēriskus atkārtojumus, kas atšķiras tikai ar vienu bāzes pāri. PNA ir relatīva hidrofobitāte (salīdzinot ar DNS), kā rezultātā PNA labāk izkliedējas caur šūnu sieniņām => plašs pielietojums mikrobioloģijā. Pamatojoties uz augstu saistīšanās specifiku: tiek uzskatīts, ka PNA tehnoloģija drīz kļūs par pamatu alēlēm specifisku zondu izveidei in situ hibridizācijai. To izmanto ģenētikā, citoģenētikā, epiģenētikā, mikrobioloģijā utt.

3) Flow-FISH — FISH plūsmas citometrijai: 1998. gadā ierosināja: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Telomēra garuma dinamika cilvēka limfocītu apakšpopulācijās, mērīta ar plūsmas citometriju . dabas biotehnoloģija. 16, 743–747 (1998). Q-FISH un plūsmas citometrijas kombinācija, kas ļauj veikt signālu analīzi (mērīšanu) un šķirošanu. Flow-FISH izmanto šūnu suspensiju (hromosomu telomēru garuma mērīšanai), hromosomu izplatību un izolētas hromosomas (turpmākai kartēšanai). Tāpat kā Q-FISH, tiek izmantotas PNA marķētas telomēriskās zondes (piemēram, lai vizualizētu un izmērītu telomēru atkārtojumu garumu). Galvenā priekšrocība ir ātrāka metode (liela skaita šūnu/hromosomu analīze/šķirošana). To plaši izmanto, lai pētītu dažādas problēmas: novecošanu, telomēru saglabāšanos, hematopoētisko cilmes šūnu suspensiju ex vivo izpēti, baktēriju izpēti.

Daudzparametriskā analīze ļauj diferencēt šūnu tipus vienā paraugā, ļaujot veikt iekšējo kontroli un leikocītu apakštipu analīzi.

Flow-FISH priekšrocības: viegli reproducējami rezultāti Spēja analizēt šūnu apakšgrupas populācijā, izmantojot fizisko imunofluorescenci un marķierus Labāka veiktspēja nekā Q-FISH Spēja kvantitatīvi noteikt tūkstošiem šūnu fluorescenci.

IZOLĒTO HROMOSOMU IZMEKLĒŠANA AR PLŪSMAS CITOMETRIJU 1. Hromosomu šķirošana pēc plūsmas citometrijas. Kariotipēšana ar plūsmas citometriju tiek izmantota gēnu tālākai kartēšanai un hromosomu bibliotēku veidošanai. - Gēnu identificēšana un lokalizācija šķirotajās hromosomās tiek veikta, vēlāk izmantojot FISH metodes / PRINS metodi (primed in situ marķēšana) vai tās variācijas un hromosomām specifisku PCR. - Līdz 2011.gadam līdz šim veiksmīgi sašķirotas tikai 17 kultivēto augu sugu hromosomas. - Metafāzes vai pahitēnisko hromosomu šķirošana ar augstu dalīšanas indeksu.

Fluorescējoša etiķete: - Hromosomas ir marķētas ar nukleīnskābēm specifiskiem fluorohromiem. - Fluorohromi tiek izvēlēti atbilstoši 1) specifiskumam slāpekļa bāzēm, 2) eksperimentālajiem apstākļiem (t.sk. ņemot vērā pieejamo lāzeru viļņu garumus). 1. Monovariantu analīzē izmantojiet krāsvielas, kas nav specifiskas A-T vai G-C pāriem: propīdija jodīds (ierosmes maksimums: 535 nm, emisijas: 617 nm, nepieciešams lāzers: 488 nm argona lāzers vai lampa + garās caurlaidības filtrs) etīdija bromīds (ierosme). maksimumi: : 300 un 520 nm, emisijas: 600 nm, nepieciešamais lāzers: 488 nm argona lāzers vai lampa + garās caurlaidības filtrs) Šīs etiķetes iekrāso DNS neatkarīgi no A, G, T vai slāpekļa bāzu satura. 2. Divfaktoru analīzei izmantojiet: hromomicīnu (specifiski G-C bāzu pāriem), A3 ierosmes maksimumu: 458 nm, emisiju 580 nm. Lāzers: , 458 nm vismaz 400 m. V jauda. Hoechst 33258 (specifiski A-T bp), ierosme: 351-364 nm, emisija: 470 nm. Lāzers: 351-364 nm (jaudīgs). Lāzeri ir jāatdala laikā un telpā fluorohroma spektru daļējas pārklāšanās dēļ.

2. Hromosomu/nukleotīdu secību izpēte pēc šķirošanas (fizisko un ģenētisko karšu veidošanai u.c.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Lielu genomu ar garām hromosomām izpēte. Sekvenču kartēšana ar lielu atkārtojumu skaitu (piemēram, telomēriskie un centromēriskie reģioni). Īsu zondu izmantošana. Lielā atkārtojumu skaita dēļ signāls ir spēcīgs. Standarta zondes izmērs: 15 - 30 nukleotīdi. ZIVIS

FISH problēmas: ir grūti lokalizēt viena lokusa DNS sekvences (t.i., neatkārtotas unikālas DNS sekvences), jo signāls būs ļoti vājš, izmantojot standarta īsas zondes. Palielinot zondes garumu līdz vairākām kilobāzēm, lai uzlabotu signālu, samazināsies jutība un => nespecifiskā saistīšanās. Risinājums: BAC-FISH -BAC-FISH ir FISH metodes un genoma DNS klonu izmantošanas kombinācija, kas integrēta baktēriju mākslīgajās hromosomās (BAC), ļaujot ievietot lielas DNS sekvences. - Efektīva metode organismu ar maziem genomiem atsevišķu hromosomu identificēšanai un kartēšanai. Kā zonde tiek izmantotas BAC zondes, overgos (oligonukleotīdu pārklāšanās).

Alternatīva FISH: PRINS PRINS (primed in situ marķēšana) ir hromosomu marķēšanas metode, savienojot oligonukleotīda DNS praimeru ar homologu denaturētas hromosomu DNS secību un sekojošu praimera enzīmu pagarināšanu in situ ar iezīmētiem nukleotīdiem. Pirmo reizi aprakstīja Koch et al. 1989. gadā (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N. un Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming metodes alfa satelīta DNS hromosomu specifiskajai marķēšanai in situ. Chromosoma 98, 259 –265). PRINS ir alternatīva ZIVIS. To izmanto nukleotīdu secību lokalizācijai, metafāzes vai starpfāzu hromosomu vai hromosomu pāru atpazīšanai un skaitīšanai (ieskaitot hromosomu aneuploīdiju). nemarķētā praimera (primer-primer) atkausēšana ar interesējošo DNS; praimera pagarināšana ar termostabilas DNS polimerāzes un marķētu nukleotīdu palīdzību; reakcijas pārtraukšana (bloķējošās molekulas pievienošana 3' galam) Primer : PCR restrikcijas fragments; - netiešs (biotīns/dig fluorohroma konjugēts avidīns/anti-dig) - Katras PRINS reakcijas rezultātos var identificēt tikai vienu homologu hromosomu pāri (vienu hromosomu). Nākamo PRINS reakciju uz tā paša priekšmetstikliņa var veikt tikai pēc iepriekšējās bloķēšanas. - Izmanto DNS sekvencēm ar lielu atkārtojumu skaitu.

PRINS priekšrocības: 1. Nepieciešama minimāla informācija par secību, kas nepieciešama oligonukleotīdu praimera sintēzei. 2. Ātrākā un vienkāršākā metode interesējošās secības noteikšanai hromosomā (salīdzinājumā ar smago FISH zondu izmantošanu, kas hibridizējas ļoti ilgā laika periodā). 3. Zondes marķēšanas posma izslēgšana. 4. Iespēja pagarināt praimeru ar iezīmētiem nukleotīdiem, lai uzlabotu c-PRINS signālu, nosakot īsas unikālas sekvences. Lai identificētu mazkopiju atkārtojumus vai īsas unikālas sekvences, tiek izmantota jutīgāka metode - cikliskā PRINS (c-PRINS). C-PRINS ierosināja Gosden et al. 1991. gadā uzlabots plaši izmantots protokols, ko izstrādāja Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). DNS sekvenču lokalizācija augu hromosomās, izmantojot PRINS un C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS ietver virkni termisko ciklu, kas ir līdzīgi PCR.

Apvalka šķidrums FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Plūsmas citometrija un FISH, lai izmērītu vidējo telomēru garumu (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 - 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Plūsmas šķirošana mitotisko hromosomu mīkstajos kviešu (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . Tātad 4 buferis bez ditiotreitola (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine materiāls for plant genephysical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99-103 ) -autoklāvēts 0,1% (masa/tilp.) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, ): 17(02), : 823–829) -Hromosomu stabilizējošais poliamīna buferšķīdums (olbaltumvielas saturošs apvalka šķidrums) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Edit. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Fluorescences in situ hibridizācija

Fluorescējošā hibridizācija in situ , vai FISH metodi (ang. Fluorescence in situ hibridizācija - ZIVIS ) - citoģenētiska metode, ko izmanto, lai noteiktu un noteiktu konkrētas DNS sekvences atrašanās vietu metafāzes hromosomās vai starpfāzu kodolos. in situ. Turklāt FISH izmanto, lai noteiktu specifiskas mRNS audu paraugā. Pēdējā gadījumā FISH metode ļauj noteikt gēnu ekspresijas spatiotemporālās iezīmes šūnās un audos.

Zondes

Ar fluorescējošu hibridizāciju in situ izmantot DNS zondes (DNS zondes), kas saistās ar komplementāriem mērķiem paraugā. DNS zondes satur nukleozīdus, kas marķēti ar fluoroforiem (tieša marķēšana) vai konjugātus, piemēram, biotīnu vai digoksigenīnu (netiešā marķēšana). Ar tiešu marķēšanu ar mērķi saistīto DNS zondi var novērot, izmantojot fluorescējošu mikroskopu tūlīt pēc hibridizācijas pabeigšanas. Netiešās marķēšanas gadījumā ir nepieciešama papildu krāsošanas procedūra, kuras laikā biotīnu nosaka, izmantojot fluorescējoši iezīmētu avidīnu vai stepavidīnu, bet digoksigenīnu, izmantojot fluorescējoši iezīmētas antivielas. Lai gan netiešā DNS paraugu marķēšanas versija prasa papildu reaģentus un laiku, šī metode parasti nodrošina augstāku signāla līmeni, jo uz antivielas vai avidīna molekulas ir 3-4 fluorohroma molekulas. Turklāt netiešās marķēšanas gadījumā ir iespējama signāla kaskādes pastiprināšana.

Lai izveidotu DNS paraugus, tiek izmantotas klonētas DNS sekvences, genoma DNS, PCR reakcijas produkti, marķēti oligonukleotīdi un DNS, kas iegūta ar mikrodissekciju.

Zondes marķēšanu var veikt dažādos veidos, piemēram, ar nick-translāciju vai PCR ar iezīmētiem nukleotīdiem.

Hibridizācijas procedūra

Fluorescējošās hibridizācijas eksperimenta shēma in situ lai lokalizētu gēna atrašanās vietu kodolā

Pirmais solis ir zondes dizains. Zondes izmēram jābūt pietiekami lielam, lai hibridizācija notiktu noteiktā vietā, bet ne pārāk lielam (ne vairāk kā 1 kb), lai netraucētu hibridizācijas procesu. Identificējot specifiskus lokusus vai krāsojot veselas hromosomas, ir jābloķē DNS zondu hibridizācija ar neunikālām atkārtotām DNS sekvencēm, pievienojot hibridizācijas maisījumam nemarķētus DNS atkārtojumus (piemēram, Cot-1 DNS). Ja DNS zonde ir divpavedienu DNS, pirms hibridizācijas tā ir jādenaturē.

Nākamajā posmā tiek sagatavoti starpfāzu kodolu vai metafāzes hromosomu preparāti. Šūnas tiek fiksētas uz substrāta, parasti uz stikla priekšmetstikliņa, kam seko DNS denaturācija. Lai saglabātu hromosomu vai kodolu morfoloģiju, denaturāciju veic formamīda klātbūtnē, kas ļauj samazināt denaturācijas temperatūru līdz 70°.

Saistīto DNS zondu vizualizācija tiek veikta, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. Fluorescējošā signāla intensitāte ir atkarīga no daudziem faktoriem - zondes marķēšanas efektivitātes, zondes veida un fluorescējošās krāsas veida.

Literatūra

Rubcovs N.B. Metodes darbam ar zīdītāju hromosomām: Proc. pabalsts / Novosib. Valsts un-t. Novosibirska, 2006. 152 lpp.

Rubcovs N.B. Nukleīnskābju hibridizācija in situ hromosomu anomāliju analīzē. Nodaļa grāmatā "Ievads molekulārajā diagnostikā" 2. sēj. "Molekulārās ģenētiskās metodes iedzimtu un onkoloģisko slimību diagnostikā" / Red. M.A. Paltseva, D.V. Zaļetajevs. Mācību literatūra medicīnas augstskolu studentiem. M.: Medicīna, 2011. T. 2. S. 100–136.

Piezīmes

Wikimedia fonds. 2010 .

Skatiet, kas ir "fluorescējošā in situ hibridizācija" citās vārdnīcās:

Šim terminam ir citas nozīmes, skatiet hibridizāciju. DNS hibridizācija, nukleīnskābju hibridizācija in vitro komplementāru vienpavedienu nukleīnskābju kombinācija vienā molekulā. Ar pilnīgu komplementaritāti ... ... Wikipedia

Noteikšanas metode fluorescējoša in situ hibridizācija.

Materiāls tiek pētīts Skatīt aprakstā

Iespējama mājas vizīte

Pētījumu izmanto, lai izvēlētos individuālu adjuvantu ķīmijterapiju krūts vēža vai kuņģa vēža ārstēšanai.

Krūts vēzis (BC) ieņem pirmo vietu sieviešu onkoloģisko slimību vidū. Krūts audzēja šūnās var būt dažāda veida receptori, kas ir jutīgi pret noteiktām vielām (hormoniem vai citām bioloģiski aktīvām molekulām). Atkarībā no hormonu receptoru (estrogēna un progesterona) vai cilvēka epidermas augšanas faktora 2. tipa receptoru (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2) klātbūtnes audzēja šūnās tiek izolēts hormonu receptoru pozitīvs, HER2 pozitīvs un trīskārši negatīvs krūts vēzis. . Tas ir svarīgi ņemt vērā, individuāli izvēloties terapiju un prognozējot ārstēšanas panākumus.

HER2 ir receptors, kas atrodas audos un parasti piedalās šūnu dalīšanās un diferenciācijas regulēšanā. Tās pārpalikums uz audzēja šūnu virsmas (hiperekspresija) nosaka neoplazmas strauju nekontrolētu augšanu, augstu metastāžu risku un dažu ārstēšanas veidu zemo efektivitāti. HER2 hiperekspresija dažos krūts vēža apakštipos izraisa pastiprinātu proliferāciju un angiogenēzi, kā arī apoptozes (ģenētiski ieprogrammētas šūnu pašiznīcināšanās) disregulāciju. Pašlaik ir zāles, kuru mērķis ir HER2 receptori. Tas jo īpaši ir Herceptin (trastuzumabs), kas ir monoklonāla antiviela pret HER2/neu receptoriem.

HER2 (ErbB-2) onkogēna amplifikācija un pārmērīga ekspresija ir salīdzinoši specifiski notikumi krūts karcinomas gadījumā un praktiski nenotiek citas lokalizācijas audzējos. Kuņģa vēzis (GC) ir viens no nedaudzajiem izņēmumiem: HER2 aktivācija tiek novērota aptuveni 10-15% šī orgāna ļaundabīgo audzēju gadījumu un korelē ar slimības agresīvo gaitu. HER2 pozitīva krūts vēža gadījumā uz audzēja šūnu virsmas var būt pārmērīgs HER2 receptoru daudzums (saukts par HER2 pozitīvu vai Hercept pozitīvu). Šo parādību novēro 15-20% sieviešu, kas cieš no krūts vēža. HER2 statusa novērtēšana ir svarīga, lai noteiktu ārstēšanas taktiku.

Galvenās standartizētās metodes HER2/neu pārmērīgas ekspresijas un/vai HER2/neu gēna amplifikācijas noteikšanai ir imūnhistoķīmiskā (IHC) metode un fluorescences in situ hibridizācija (FISH). Abi pētījumi tiek veikti ar histoloģiskiem preparātiem (parafīnā iestrādātām audzēja materiāla sekcijām), izmantojot poliklonālās antivielas (IHC), fluorescējošās zondes (FISH) un dažādas attēlveidošanas sistēmas.

Novērtējot IHC reakcijas rezultātus, ekspresija tiek ņemta vērā tikai audzēja invazīvā komponentā. Reakcijas rezultāti tiek novērtēti, izmantojot punktu skalu: 0, 1+, 2+, 3+, ko izstrādājis testa ražotājs un apstiprinājuši eksperti. Hercepta statuss, kas novērtēts kā 0 un 1+, ir jāuzskata par negatīvu - nav proteīna pārmērīgas ekspresijas, kas korelē ar tā gēna amplifikācijas neesamību. Hercepta statuss, kas novērtēts kā 3+, ir pozitīvs, t.i., ir proteīna pārmērīga ekspresija, kas korelē ar gēnu amplifikācijas klātbūtni. Hercepta statuss 2+ tiek uzskatīts par nenoteiktu, t.i., proteīnu ekspresiju, kas noteikta, pamatojoties uz imūnhistoķīmisko reakciju, nevar droši spriest pēc gēnu amplifikācijas, tāpēc ir nepieciešams pētījums, kas tieši atklāj amplifikācijas esamību vai neesamību. FISH metodi izmanto sekcijās no tā paša parauga (bloka), kurā tika veikts imūnhistoķīmiskais pētījums. FISH hibridizācijā HER2 gēna amplifikācijas esamība tiek novērtēta, saskaitot sarkano fluorescējošo (atbilst iezīmētajiem HER2 gēniem) un zaļo fluorescējošo signālu attiecību, kas iezīmē 17. hromosomas centromērisko reģionu. Attiecība, kas lielāka par 2, norāda uz HER2 amplifikāciju. FISH metode ir jutīgāka nekā IHC, jo tā ļauj tieši novērtēt amplifikācijas esamību vai neesamību.

Materiāls pētījumam: parafīna bloks ar audzēja biopsiju.

Uzmanību! OBLIGĀTI:

priekšmetstikliņus ar IHC krāsošanu ar antivielām pret HER2/neu
ārsta nosūtījums vai izraksts ar histoloģiskā un IHC pētījuma rezultātiem ar antivielām pret Her-2/neu

Literatūra

Zavalishina L.E., Frenks G.A. HER2 statusa morfoloģiskais pētījums. Metodika un atlants. - M.: Red. Medika Medica. 2006:98.
Ļaundabīgās slimības Krievijā 2011. gadā (saslimstība un mirstība). Ed. UN. Čisova, V.V. Starinskis, G.V. Petrova. - M.: FGBU "MNIOI viņiem. P.A. Herzens" no Krievijas Veselības ministrijas. 2013:289.
Onkoloģija. Klīniskās vadlīnijas. Krievijas onkologu asociācija. Ed. UN. Čisova, S.L. Darjalova. - M.: Red. "GEOTAR-Media". 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. u.c. Trastuzumabs kombinācijā ar ķīmijterapiju pret ķīmijterapiju atsevišķi HER2 pozitīva progresējoša kuņģa vai gastroezofageālā savienojuma vēža (ToGA) ārstēšanai: 3. fāzes, atklāts, randomizēts kontrolēts pētījums. Lancete. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Diagnostiskā imūnhistoķīmija: terapijas un genomikas pielietojumi. Elsevier, 4. izdevums. 2013:960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, vēža sastopamība un mirstība visā pasaulē: IARC vēža bāze Nr. 10. Liona, Francija: Starptautiskā vēža izpētes aģentūra; 2010. Pieejams no: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. Sanāksmes svarīgākie notikumi: Starptautiskais ekspertu konsenss par agrīna krūts vēža primāro terapiju, 2005. Onkoloģijas gadagrāmata. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. PVO sieviešu reproduktīvo orgānu audzēju klasifikācija. WHO Press, 4. izdevums. 2014; 4:316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Parks D.I., Yun J.W., Park J.H. un citi. Her2 / neu amplifikācija ir neatkarīgs prognostisks faktors kuņģa vēža gadījumā. Gremošanas slimības un zinātnes. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D. et al. Adjuvants trastuzumabs HER2 pozitīva krūts vēža gadījumā. New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.