ფლუორესცენტური in situ ჰიბრიდიზაცია. ფლუორესცენტური in situ ჰიბრიდიზაცია (FISH)

ზოგიერთ შემთხვევაში, ციტოგენეტიკური კვლევა საკმარისი არ არის კარიოტიპის შესახებ დასკვნის გასაცემად, ამ შემთხვევაში გამოიყენება მოლეკულური ციტოგენეტიკური მეთოდები, კერძოდ, fluorescence in situ ჰიბრიდიზაცია (ინგლისური - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

მოლეკულური ციტოგენეტიკის ახალი ტექნოლოგიების გაჩენამ, ძირითადად ნუკლეინის მჟავების in situ ჰიბრიდიზაციაზე დაფუძნებული, მნიშვნელოვნად გააფართოვა ქრომოსომული დიაგნოსტიკის შესაძლებლობები. შემუშავებულია in situ ჰიბრიდიზაციის მეთოდი სპეციფიკური დნმ-ის თანმიმდევრობების ლოკალიზაციისთვის უშუალოდ ციტოლოგიურ პრეპარატებზე. ქრომოსომების და ქრომოსომული უბნების იდენტიფიკაციაში მოხდა გადასვლა ქრომოსომის ციტოლოგიური ორგანიზაციის ანალიზიდან დნმ-ის თანმიმდევრობების ანალიზზე, რომლებიც ქმნიან მათ. კლასიკური ციტოლოგიური მეთოდების ეფექტურობის შედარება ქრომოსომული გადაწყობების გამოვლენისა და ანალიზისთვის, როგორიცაა ქრომოსომების დიფერენციალური შეღებვა, თანამედროვე მოლეკულურ ციტოგენეტიკურ ტექნოლოგიებთან, აჩვენა, რომ ჰემატოლოგიურ დარღვევებში ქრომოსომების ციტოლოგიური ანალიზი აღმოაჩენს და სწორად იდენტიფიცირებს მხოლოდ დაახლოებით მესამედს. სპექტრალური კარიოტიპინგი (SKY). გადაწყობების დაახლოებით მესამედი ციტოლოგიური მეთოდებით არასწორად არის გამოვლენილი, ხოლო მესამედი სრულიად შეუმჩნეველი რჩება. ციტოგენეტიკური ანალიზის კლასიკური მეთოდები შესაძლებელს ხდის გამოავლინოს SKY-ის მიერ გამოვლენილი ქრომოსომული გადაწყობების მხოლოდ დაახლოებით 15%.

FISH მეთოდი იყენებს ფლუორესცენტულ მოლეკულებს გენების ან ქრომოსომების in vivo შესაღებად. მეთოდი გამოიყენება გენის რუკების და ქრომოსომული აბერაციების იდენტიფიცირებისთვის.

ტექნიკა იწყება დნმ-ის მოკლე მიმდევრობების მომზადებით, რომელსაც ეწოდება ზონდები, რომლებიც ავსებენ დნმ-ის თანმიმდევრობებს, რომლებიც წარმოადგენს კვლევის ობიექტს. ზონდები ჰიბრიდიზაციას უკეთებენ (აკავშირებენ) დნმ-ის დამატებით რეგიონებს და, იმის გამო, რომ ისინი ფლუორესცენტური ეტიკეტით არის მონიშნული, საშუალებას გაძლევთ ნახოთ დნმ-ში ან ქრომოსომებში საინტერესო გენების ლოკალიზაცია. ქრომოსომების შესწავლის სხვა მეთოდებისგან განსხვავებით, რომლებიც საჭიროებენ უჯრედების აქტიურ გაყოფას, FISH შეიძლება განხორციელდეს არაგამყოფ უჯრედებზე, რაც მეთოდს მოქნილს ხდის.

FISH შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა მიზნებისთვის სამი სხვადასხვა ტიპის ზონდების გამოყენებით:

* ლოკუსსპეციფიკური ზონდები, რომლებიც აკავშირებენ ქრომოსომების გარკვეულ ნაწილებს. ეს ზონდები გამოიყენება იზოლირებული დნმ-ის ხელმისაწვდომი მოკლე თანმიმდევრობის იდენტიფიცირებისთვის, რომელიც გამოიყენება ეტიკეტირებული ზონდის მოსამზადებლად და მისი შემდგომი ჰიბრიდიზაციისთვის ქრომოსომების ნაკრებით;
* ალფა ან ცენტრომერული განმეორებითი ზონდები არის ქრომოსომების ცენტრომერული რეგიონების განმეორებადი თანმიმდევრობები. მათი დახმარებით, თითოეული ქრომოსომა შეიძლება შეიღებოს სხვადასხვა ფერში, რაც საშუალებას გაძლევთ სწრაფად განსაზღვროთ ქრომოსომების რაოდენობა და მათი ნორმალური რიცხვიდან გადახრები;
* მთელი ქრომოსომის ზონდები არის მცირე ზომის ზონდები, რომლებიც ავსებენ ქრომოსომის ცალკეულ ნაწილებს, მაგრამ ზოგადად ფარავს მის მთელ სიგრძეს. ასეთი ზონდების ბიბლიოთეკის გამოყენებით შეიძლება მთელი ქრომოსომა „გაფერადდეს“ და მივიღოთ ინდივიდის დიფერენციალური სპექტრული კარიოტიპი. ამ ტიპის ანალიზი გამოიყენება ქრომოსომული აბერაციების გასაანალიზებლად, როგორიცაა ტრანსლოკაცია, როდესაც ერთი ქრომოსომის ნაწილი მეორეს მხარზე გადადის.

ფლუორესცენტური ეტიკეტით in situ ჰიბრიდიზაცია (FISH)

კვლევის მასალაა სისხლი, ძვლის ტვინი, სიმსივნის ბიოფსია, პლაცენტა, ნაყოფის ქსოვილები ან ამნიონური სითხე. ანალიზისთვის ნიმუშები უნდა გადაეცეს ახალი ლაბორატორიას. პრეპარატები (სლაიდები) მზადდება უშუალოდ ქსოვილის ნიმუშებიდან ან მათი გაშენების შემდეგ. შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც მეტაფაზური, ასევე ინტერფაზური უჯრედების პრეპარატები. ფლუორესცენტური ეტიკეტებით მარკირებული დნმ-ის სპეციფიური ზონდები ჰიბრიდირებულია ქრომოსომულ დნმ-თან და მრავალი ზონდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ერთდროულად სხვადასხვა ლოკებზე.

FISH არის ციტოგენეტიკური ანალიზის სასარგებლო და მგრძნობიარე მეთოდი რაოდენობრივი და ხარისხობრივი ქრომოსომული აბერაციების გამოსავლენად, როგორიცაა წაშლა (მათ შორის მიკროდაშლა), ტრანსლოკაცია, გაორმაგება და ანევპლოიდი. FISH ინტერფაზურ ქრომოსომებზე არის სწრაფი მეთოდი 21, 18 ან 13 ტრისომიის ან სქესის ქრომოსომის აბერაციების პრენატალური დიაგნოსტიკისთვის. ონკოლოგიაში, FISH-ს შეუძლია გამოავლინოს მთელი რიგი გადაადგილება (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), რომლებიც დაკავშირებულია ჰემატოლოგიურ ავთვისებიან სიმსივნეებთან. მეთოდი ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ქიმიოთერაპიის და ძვლის ტვინის ტრანსპლანტაციის შემდეგ კიბოს ნარჩენი ეფექტების მონიტორინგისთვის და ზოგიერთი სიმსივნის ცუდ პროგნოზთან დაკავშირებული გაძლიერებული ონკოგენების (c-myc/n-myc) გამოსავლენად. FISH ასევე გამოიყენება საპირისპირო სქესის ინდივიდისგან მიღებული ძვლის ტვინის ალოგრაფტის გადარჩენის მონიტორინგისთვის.

FISH არის მგრძნობიარე მეთოდი ქრომოსომული აბერაციების იდენტიფიცირებისთვის და დიდი (> 500) უჯრედების ერთბაშად სწრაფი ანალიზისთვის. მეთოდი უაღრესად ზუსტია ქრომოსომების ბუნებისა და ქრომოსომული დნმ-ის უცნობი ფრაგმენტების იდენტიფიცირებაში.

ტრადიციული ციტოგენეტიკაკარიოტიპის შესწავლისას ის ყოველთვის შემოიფარგლებოდა გარჩევადობის ზოლის დონით. ქრომოსომების მაღალი გარჩევადობის დიფერენციალური შეღებვის შემთხვევაშიც კი, ჩვენ მხოლოდ მეტი ზოლები აღმოვაჩინეთ თითო ქრომოსომაზე, მაგრამ დარწმუნებული არ ვიყავით, რომ გარჩევადობის მოლეკულურ დონემდე მივდიოდით. დნმ-ის ტექნოლოგიებისა და ციტოგენეტიკის ბოლოდროინდელმა მიღწევებმა შესაძლებელი გახადა FISH მეთოდების გამოყენება მოლეკულურ დონეზე ქრომოსომული დნმ-ის ცვლილებების გასაანალიზებლად. მოლეკულურმა ციტოგენეტიკამ უზრუნველყო რევოლუციური გარღვევა ციტოგენეტიკაში, რაც საშუალებას აძლევს:

ქრომოსომების დნმ-ის სტრუქტურის ანალიზი 10-100 კილობაზის დიაპაზონში;
არაგამყოფი ინტერფაზური უჯრედების დიაგნოსტიკისთვის, რამაც დიდი გავლენა მოახდინა პრენატალურ დიაგნოზზე და პრეიმპლანტაციის გენეტიკურ დიაგნოზზე (PGD).

FISH ტექნოლოგიაიყენებს დნმ-ის ზონდს, რომელიც აკავშირებს ან აღადგენს სპეციფიკურ დნმ-ის თანმიმდევრობებს ქრომოსომაში. დენატურირებული ზონდი ინკუბირებულია მშობლიური უჯრედის დნმ-ით, ასევე დენატურირებულია ერთჯაჭვიან მდგომარეობაში. ზონდი ცვლის ბიოტინ დეოქსიურიდინ ტრიფოსფატს ან დიგოქსიგენინ ურიდინ ტრიფოსფატს თიმიდინით. ზონდის მიერ მშობლიური დნმ-ის რენატურაციის შემდეგ, ზონდი-დნმ კომპლექსი შეიძლება გამოვლინდეს ფტოროქრომით ეტიკეტირებული ბიოტინის დამაკავშირებელი ავიდინის ან ფტოროქრომით მარკირებული ანტიდიგოქსიგენინის დამატებით. დამატებითი სიგნალის გაძლიერება შეიძლება მიღებულ იქნას ანტიავიდინის დამატებით და მიღებული კომპლექსის გამოკვლევით ფლუორესცენტული მიკროსკოპის გამოყენებით. სხვადასხვა დნმ-ის ზონდებს რამდენიმე სხვადასხვა ფტორქრომით მარკირებით, რამდენიმე ქრომოსომა ან ქრომოსომის სეგმენტი ერთ უჯრედში შეიძლება ერთდროულად ვიზუალურად ვიზუალურად იყოს მრავალფერადი სიგნალის სახით.

განსაზღვრის უნარი კონკრეტული გენის სეგმენტებიქრომოსომებზე არსებული ან არარსებობა, შესაძლებელი გახადა დნმ-ის დონეზე გენის თანმიმდევრობის სინდრომების დიაგნოსტიკა, აგრეთვე ტრანსლოკაციები ინტერფაზურ ბირთვებში, ხშირად ცალკეულ უჯრედებში.

მასალა თევზიშეიძლება ემსახურებოდეს უჯრედების გაყოფისგან მიღებული მეტაფაზური ქრომოსომები ან უჯრედების ინტერფაზური ბირთვები, რომლებიც არ არიან გაყოფის ეტაპზე. სექციები წინასწარ არის დამუშავებული RNase-ით და პროტეაზათი, რათა ამოიღონ რნმ, რომელიც შეიძლება ჯვარედინი ჰიბრიდიზაცია მოხდეს ზონდთან და ქრომატინთან. შემდეგ ისინი თბება ფორმამიდში დნმ-ის დენატურად და ფიქსირდება ყინულივით ცივი სპირტით. შემდეგ ზონდი მზადდება ჰიბრიდიზაციისთვის გაცხელებით. ამის შემდეგ, ზონდი და ქრომოსომის პრეპარატი შერეულია და დალუქულია საფარით 37 °C ტემპერატურაზე ჰიბრიდიზაციისთვის. ინკუბაციური ტემპერატურის ან ჰიბრიდიზაციის ხსნარის მარილის შემადგენლობის შეცვლით, შეკავშირების სპეციფიკა შეიძლება გაიზარდოს და ფონური მარკირება შემცირდეს.

ფლუორესცენტური in situ ჰიბრიდიზაციის გამოყენება - FISH ტექნოლოგია

FISH ტექნოლოგიის ეფექტურობაპირველად აჩვენეს გენების ლოკალიზაციით. ფლუორესცენტური მარკირების მეთოდის დანერგვით, in situ ჰიბრიდიზაცია გახდა შეუცვლელი ქრომოსომული პათოლოგიების დიაგნოსტიკისთვის, რომლებიც არ არის გამოვლენილი ტრადიციული ზოლის მეთოდებით. FISH-მა ასევე მნიშვნელოვანი როლი ითამაშა თანამედროვე გენეტიკის ერთ-ერთ ყველაზე არაჩვეულებრივ აღმოჩენაში, გენომიურ ანაბეჭდში.

მისი განვითარების ტექნოლოგია თევზიმიღებული სამი ფორმით. ცენტრომერული, ან ალფა-სატელიტური ზონდები ხასიათდება შედარებითი ქრომოსომული სპეციფიკით; ისინი ყველაზე ხშირად გამოიყენებოდა ინტერფაზური უჯრედების გენეტიკაში. ეს ზონდები წარმოქმნიან ადეკვატური სიძლიერის გარკვეულწილად დიფუზურ სიგნალებს ცენტრომერის რეგიონში, მაგრამ არ ჯვარედინი ჰიბრიდიზაციას ახდენენ მსგავსი ცენტრომერული თანმიმდევრობის მქონე ქრომოსომებთან. ამჟამად შემუშავებულია ერთი ეგზემპლარი ზონდები, რომლებიც იძლევიან დისკრეტულ სიგნალს კონკრეტული ქრომოსომის ზოლიდან და საშუალებას გაძლევთ თავიდან აიცილოთ ჯვარედინი ჰიბრიდიზაციის ფენომენი. ეს ზონდები ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას ასლის რაოდენობის და კონკრეტული ქრომოსომული რეგიონების დასადგენად, რომლებიც ეჭვმიტანილია კონკრეტულ სინდრომთან. პრენატალური დიაგნოსტიკისთვის გამოიყენება 13, 18, 21, X და Y ქრომოსომებისთვის განკუთვნილი ერთჯერადი ასლი და ცენტრომერული ზონდები.

ასევე შესაძლებელია მთელი ქრომოსომების „შეღებვა“. თევზი. სპექტრალური კარიოტიპის ტექნოლოგიის წყალობით, რომელიც იყენებს სხვადასხვა ფტოროქრომების ნარევს, ახლა უკვე შესაძლებელია უნიკალური ფლუორესცენტური ნიმუშის შექმნა თითოეული ცალკეული ქრომოსომისთვის 24 ინდივიდუალური ფერით. ეს ტექნოლოგია შესაძლებელს ხდის განვსაზღვროთ რთული ქრომოსომული გადაწყობები, რომლებიც არ ჩანს ტრადიციული ციტოგენეტიკური ტექნიკის გამოყენებით.

მეთოდი თევზიპრენატალურ დიაგნოზში. ხანდაზმული რეპროდუქციული ასაკის ქალებისთვის ორსულობა შეიძლება იყოს არა იმდენად სიხარულის, რამდენადაც შეშფოთების მიზეზი. ქალის ასაკთან დაკავშირებულია ნაყოფის ქრომოსომული დარღვევების განვითარების რისკი. ამნიოცენტეზი, რომელიც ტარდება ორსულობის მე-16 კვირაში, რასაც მოჰყვება კარიოტიპის ანალიზი 10-14 დღე სჭირდება. წინასწარი გამოკვლევის დროს FISH-ის გამოყენება უფრო სწრაფი დიაგნოსტიკისა და ლოდინის დროის შემცირების საშუალებას იძლევა. გენეტიკოსებისა და ლაბორატორიების უმეტესობა თვლის, რომ FISH მეთოდი არ უნდა იქნას გამოყენებული იზოლირებულად ორსულობის სამომავლო მართვის შესახებ გადაწყვეტილების მისაღებად. FISH მეთოდს უნდა დაემატოს კარიოტიპური ანალიზი და მისი შედეგები მაინც უნდა იყოს კორელირებული ულტრაბგერითი (ულტრაბგერითი) ან დედის სისხლის ბიოქიმიური სკრინინგის პათოლოგიურ სურათთან.

გენების სინდრომები თანმიმდევრობებიასევე ცნობილია როგორც მიკროდელეციის სინდრომები, ან სეგმენტური ანევსომია. ეს არის ქრომოსომის მიმდებარე ფრაგმენტების წაშლა, რომელიც ჩვეულებრივ მოიცავს ბევრ გენს. გენის თანმიმდევრობის სინდრომები პირველად აღწერილი იქნა 1986 წელს კლასიკური ციტოგენეტიკური ტექნიკის გამოყენებით. ახლა, FISH-ის წყალობით, შესაძლებელია სუბმიკროსკოპული წაშლის იდენტიფიცირება დნმ-ის დონეზე, რამაც შესაძლებელი გახადა ყველაზე პატარა წაშლილი რეგიონის იდენტიფიცირება, რომელიც დაკავშირებულია კონკრეტული სინდრომის განვითარებასთან, სახელწოდებით კრიტიკული რეგიონი. როდესაც სინდრომისთვის კრიტიკული რეგიონის იდენტიფიცირება მოხდება, ხშირად შესაძლებელია კონკრეტული გენების იდენტიფიცირება, რომელთა არარსებობა სინდრომთან ასოცირებულად ითვლება. გენების თანმიმდევრობის სინდრომების უახლესი გზამკვლევი იუწყება 18 დელეციის და მიკროდელეციის სინდრომებს, რომლებიც დაკავშირებულია 14 ქრომოსომასთან. ზოგიერთი ყველაზე გავრცელებული გენის თანმიმდევრობის სინდრომი და მათი კლინიკური გამოვლინებები ნაჩვენებია ცხრილში. 5-2.

ტელომერები- წარმონაქმნები, რომლებიც ფარავს ქრომოსომების გრძელი და მოკლე მკლავების ბოლოებს. ისინი შედგება TTAGGG თანმიმდევრობის განმეორებისგან და ხელს უშლიან ქრომოსომის ბოლოების შერწყმას. ტელომერული ზონდები მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ რთული გადაადგილების ამოცნობაში, რომელთა დადგენა შეუძლებელია ტრადიციული ციტოგენეტიკური მეთოდებით. გარდა ამისა, ადამიანის გენომის პროექტის ერთ-ერთი აღმოჩენა იყო ის ფაქტი, რომ ტელომერების მიმდებარე ქრომოსომების რეგიონები მდიდარია გენებით. ახლა უკვე ნაჩვენებია, რომ სუბმიკროსკოპული სუბტელომერული წაშლა პასუხისმგებელია მრავალი გენეტიკურად განსაზღვრული დაავადების წარმოქმნაზე.

ნუკლეინის მჟავების in situ ჰიბრიდიზაცია მეთოდი ეფუძნება ორჯაჭვიანი ჰიბრიდების ფორმირების შესაძლებლობას ეტიკეტირებულ ზონდებს შორის, რომლებიც ხელოვნურად შექმნილ იქნა ერთჯაჭვიანი მიმდევრობების (რიბო- ან დეოქსირიბო-, ოლიგო- ან პოლინუკლეოტიდის) საფუძველზე და მათ დამატებით თანმიმდევრობებს შორის. სამიზნეები - გაანალიზებული დნმ ან რნმ მოლეკულები. ჰიბრიდიზაციის ადგილების იდენტიფიცირებისთვის, დნმ-ის ზონდი (დნმ ზონდი) იარლიყებულია მომხსენებელი ჯგუფით: ü რადიოაქტიური იზოტოპი, ü ფტორქრომი, ü ფერმენტი, რომელიც იძლევა ლაქას ან ლუმინესცენტურ პროდუქტს, ü ჰაპტენი, რომლითაც ეტიკეტირებული სხეული აკავშირებს, და ა.შ.

ზონდში მომხსენებელი ჯგუფის არსებობის გამო ჰიბრიდის გამოვლენით შესაძლებელია - რნმ-ის გარკვეული ტიპის კოდირების გენების რაოდენობის დადგენა, - გენომში არატრანსკრიბირებული დნმ-ის პროპორციის დადგენა, - დადგენა. გარკვეული გენების ერთმანეთთან კავშირი და მათი ზუსტი მდებარეობა ქრომოსომებზე. მოლეკულური ჰიბრიდიზაციის მეთოდს აქვს მაღალი მგრძნობელობა (მცირე რაოდენობის მარკირებული ზონდი (10-15 და 10-19 მ) და, შესაბამისად, მისი დამატებითი თანმიმდევრობა სამიზნეში შეიძლება გამოვლინდეს) და ანალიზის სიჩქარე, რაც საშუალებას იძლევა გამოიყენოს ეს მეთოდი როგორც კვლევისთვის. საქმიანობა და მემკვიდრეობითი და ინფექციური დაავადებების დიაგნოსტიკა მედიცინაში, ვეტერინარიასა და მოსავლის წარმოებაში.

მოლეკულურ ციტოგენეტიკაში ახალი ტექნოლოგიების გაჩენამ, ძირითადად ნუკლეინის მჟავების in situ ჰიბრიდიზაციაზე დაფუძნებული, მნიშვნელოვნად გააფართოვა ქრომოსომული დიაგნოსტიკის შესაძლებლობები.

ინტერფაზური ციტოგენეტიკა: 1. მრავალფეროვანი ქრომოსომის ზოლები (MCB). 2. Fluorescent in situ ჰიბრიდიზაცია (FISH). 3. FISH-ის კომბინაცია სხვა მეთოდებთან: -ციტოლოგია + FISH; -ჰისტოლოგია + FISH; -იმუნოფენოტიპირება + FISH (FICTION); მეტაფაზური ციტოგენეტიკა: 1. ქრომოსომების მყარი შეღებვა (მთლიანი შეღებვა). 2. შედარებითი გენომის ჰიბრიდიზაცია (CGH). 3. ფერის ცვლილების კარიოტიპინგი (CCK). 4. მრავალფეროვანი კარიოტიპირება: სპექტრული კარიოტიპინგი (SKY); მრავალფერიანი თევზი (M - FISH, M - BAND).

FISH - fluorescence in situ ჰიბრიდიზაცია - არის ციტოგენეტიკური მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ქრომოსომებზე, mRNA და ა.შ. სპეციფიკური დნმ-ის თანმიმდევრობების აღმოსაჩენად და ლოკალიზაციისთვის. ტექნიკა დაფუძნებულია ფლუორესცენტურად მარკირებული დნმ/რნმ ზონდის ჰიბრიდიზაციაზე დამატებითი დნმ/რნმ თანმიმდევრობით. ეტიკეტის აღმოჩენა ხდება ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით. FISH მეთოდი დაინერგა 30 წელზე მეტი ხნის წინ. იგი ფართოდ გავრცელდა, როგორც ქრომოსომებზე გენების ფიზიკურად გამოსახვის მეთოდი. მოგვიანებით იგი გამოიყენეს კვლევის სხვა სფეროებში (კლინიკური გენეტიკის, რეპროდუქციული მედიცინის, ტოქსიკოლოგიის, ევოლუციური ბიოლოგიის, შედარებითი და ფიჭური გენომიკის და ქრომოსომული ბიოლოგიის სფეროებში). ამ დროისთვის, FISH ძირითადად გამოიყენება ქრომოსომების ფიზიკური და გენეტიკური რუქების შესაქმნელად, სტრუქტურული გადაწყობების, ტრანსლოკაციების, მიკრო წაშლის, გენების გაძლიერების გამოსავლენად ინტერფაზასა და მეტაფაზურ ქრომოსომებში. მეცნიერების მიღწევების შედეგად (ნუკლეინის მჟავების და ქრომატინის ქიმიური და ფიზიკური თვისებების უკეთ გააზრება), ასევე ფლუორესცენტული მიკროსკოპისა და ციფრული გამოსახულების შემუშავების შედეგად, მეთოდი მუდმივად იხვეწებოდა (მგრძნობელობის, სპეციფიკის, გარჩევადობის გაუმჯობესება) და შემუშავებულია ამ მეთოდის მრავალი ვარიაცია.

1) უჯრედები იშლება შუშის სლაიდზე, რაც იწვევს ქრომოსომების გავრცელებას. 4) ქრომოსომები იღებება DAPI-ს გამოყენებით. 3) ზონდი და ქრომოსომა დენატურირებულია, ჰიბრიდირებული, შემდეგ გარეცხილი 5) სლაიდი ნახულია ფლუორესცენტური მიკროსკოპით

FISH-ის დაყენების პროტოკოლის ზოგადი შეხედულება შეიძლება წარმოდგენილი იყოს შემდეგნაირად: 1. ჰისტოლოგიური ან ციტოლოგიური ნიმუშის მომზადება. ჰისტოლოგიური პრეპარატის მომზადება ხდება სტანდარტული სქემის მიხედვით: ჭრა, მარკირება, გაყვანილობა, ჩამოსხმა, მიკროტომია, ჭრილის დადება მინის სლაიდზე და დეპარაფინიზაცია. ციტოლოგიური პრეპარატის მომზადებისას გამოიყენება სპეციალური პრეციპიტაციური ხსნარები და ცენტრიფუგირება, რაც შესაძლებელს ხდის კონცენტრირებული უჯრედული სუსპენზიის მიღებას. 2. წინასწარი მკურნალობა (საჭიროების შემთხვევაში). პრეპარატი მუშავდება პროტეაზებით, რათა აღმოიფხვრას ცილების არსებობა, რომლებიც აფერხებენ ჰიბრიდიზაციას. 3. დნმ-ის ზონდის გამოყენება პრეპარატზე და შემდგომ დენატურაცია. ზონდის და ნიმუშის დნმ-ის დენატურაციის მიზნით, ისინი მუშავდება ფორმამიდით და თბება დაახლოებით 85-900 C ტემპერატურამდე.

4. ჰიბრიდიზაცია. დენატურაციის შემდეგ პრეპარატი გაცივდება გარკვეულ ტემპერატურამდე (კლინიკური კვლევების შემთხვევაში 370 C) და ინკუბირებულია ტენიან კამერაში რამდენიმე საათის განმავლობაში (ინკუბაციის ხანგრძლივობა მითითებულია თითოეულ კონკრეტულ პროტოკოლში). ამჟამად, ავტომატური ჰიბრიდიზატორები გამოიყენება დენატურაციისა და ჰიბრიდიზაციისთვის. 5. სარეცხი. ჰიბრიდიზაციის დასრულების შემდეგ, შეუზღუდავი ზონდები უნდა გაირეცხოს, რაც სხვაგვარად შექმნის ფონს, რომელიც ართულებს FISH-ის შედეგების შეფასებას. გამრეცხვისთვის ჩვეულებრივ გამოიყენება ციტრატის და ნატრიუმის ქლორიდის (SSC) შემცველი ხსნარი. 6. კონტრშეღებვა. ფლუორესცენტური საღებავების (DAPI - 4, 6-დიამიდინ-2 ფენილინდოლი; პროპიდიუმის იოდიდი) დახმარებით ხდება მთელი ბირთვული დნმ-ის შეღებვა. 7. შედეგების ანალიზი ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით რუტინული ოპერაციები (დეპარაფინიზაცია, წინასწარი დამუშავება, რეცხვა) შეიძლება ავტომატიზირებული იყოს.

ტელომერული უბნების გამოკვლევა ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით. ინტერფაზის (ბირთვი) და მეტაფაზის (ცალკეული ქრომოსომა) სტადიაზე მიღებული სურათები გაერთიანებულია. ლურჯი ფერი - DAPI.

FISH მეთოდის უპირატესობები: 1. ინტერფაზურ ბირთვებში გენეტიკური მასალის შესწავლის შესაძლებლობა; 2. დიახ/არა პრინციპით ობიექტური შედეგების მიღება რაოდენობრივი მეთოდია 3. შედეგების შედარებით მარტივი ინტერპრეტაცია, მაღალი გარჩევადობა FISH მეთოდის ნაკლოვანებები: 1. ფლუორესცენტური საღებავები სწრაფად „ქრება“ მიკროსკოპი.

FISH მეთოდი ეფუძნება ჰიბრიდიზაციის რეაქციას სპეციალური ტექნოლოგიების გამოყენებით შექმნილ დნმ-ის ზონდს შორის, რომელიც არის შეზღუდული ზომის ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა და შესწავლილი ციტოგენეტიკური პრეპარატის ბირთვული დნმ-ის დამატებითი განყოფილება. დნმ-ის ზონდი არის მთავარი ელემენტი FISH-ის დასაყენებლად და ატარებს "ეტიკეტს", ანუ შეიცავს ნუკლეოტიდებს, რომლებიც პირდაპირ კავშირშია ფტორქრომთან ან ჰაპტენთან შემდგომი ვიზუალიზაციისთვის ანტისხეულების მიერ, რომლებიც ატარებენ ფტოროქრომს. შეუზღუდავი მარკირებული დნმ ირეცხება და შემდეგ ჰიბრიდირებული დნმ-ის ზონდი აღმოჩენილია ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით.

დნმ მარკირება იყოფა პირდაპირ და არაპირდაპირ. პირდაპირი მარკირება შემოაქვს დნმ-ში რეპორტიორ ელემენტებს - ფტოროქრომებს (როდამინი, დიეთილამინოკუმარინი, ტეხასის წითელი და ა.შ.). არაპირდაპირი მარკირების მეთოდი - დნმ-ის ნიმუში წინასწარ კონიუგირებულია შუალედური ლიგანდებთან (ბიოტინი, დიოქსიგენინი, 2, 4-დინიტროფენოლი), რომლის არსებობა ციტოლოგიურ პრეპარატზე შემდეგ ვლინდება ფტოროქრომების გამოყენებით. ამ შემთხვევაში, მეთოდის მგრძნობელობა მნიშვნელოვნად იზრდება, რადგან ლიგანდი შეიძლება შეიცავდეს ფტოროქრომთან ურთიერთქმედების რამდენიმე ადგილს. In situ ჰიბრიდიზაცია 32 P-ის მარკირებული ზონდით პირველად იქნა აღწერილი 1969 წელს. არარადიოაქტიური სისტემების შემუშავებამ დნმ-ის ზონდების მარკირებისა და გამოვლენის მიზნით in situ ჰიბრიდიზაციის მეთოდი უსაფრთხო, მარტივი შესასრულებელი და ნაკლებად შრომატევადი გახადა შედეგების დამუშავებისას. ფლუორესცენტური საღებავები რბილი და მარტივი გამოსაყენებელია, მათი შენახვა შესაძლებელია განუსაზღვრელი ვადით, იძლევა მაღალი გარჩევადობის საშუალებას და იძლევა დნმ-ის რამდენიმე თანმიმდევრობის ერთდროულად გამოკვლევის საშუალებას.

ზონდები: ერთჯაჭვიანი/ორჯაჭვიანი დნმ/რნმ პირველადი/მეორადი ეტიკეტირებული ზონდები. ზონდები იარლიყება: 1) უშუალოდ: ნუკლეოტიდების ჩასმით, რომლებზეც მიმაგრებულია ფტოროქრომი (PCR ან ნიკის ტრანსლაცია) 2) რეპორტიორი მოლეკულის მეშვეობით (მაგ.: დიგოქსიგენინი, ბიოტინი), რომელსაც მიმაგრებულია ფლუორესცენტურად მარკირებული ანტისხეულები. სიგნალის გასაძლიერებლად შეგიძლიათ გამოიყენოთ მეორადი, მესამეული და ა.შ ანტისხეულები, რომლებიც ეტიკეტირებულია ფლუორესცენტური ეტიკეტით. DNase nicks დნმ Nick Translation დნმ პოლიმერაზა I ამატებს ახალ ნუკლეოტიდებს 3' ჰიდროქსილ დნმ პოლიმერაზა I-ს აშორებს ცალკეულ ფუძეებს ქრომოსომის 5' ბოლოდან: DAPI (2 მგ/მლ) გამოყენებით. 4', 6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლი; ძლიერი შეკავშირება A-T მდიდარ დნმ რეგიონებთან; აგზნება UV შუქით; ემისია 461 ნმ (ლურჯი).

ამჟამად, არსებობს რამდენიმე ძირითადი მიდგომა, რომელსაც ფართოდ იყენებს თანამედროვე მოლეკულური ციტოგენეტიკა: გაფართოებული ქრომოსომის რეგიონებისა და მთლიანი ქრომოსომების მასალის იდენტიფიცირება. კონკრეტული დნმ-ის თანმიმდევრობის ინტერესის რეგიონში აღმოჩენა. ცალკეული ქრომოსომული რეგიონების დისბალანსის ანალიზი. გაფართოებული ქრომოსომული რეგიონებისა და მთლიანი ქრომოსომების მასალის იდენტიფიცირებისთვის ფართოდ გამოიყენება ქრომოსომისთვის სპეციფიკური და რეგიონისთვის სპეციფიკური დნმ-ის ზონდები („შეღებვის ზონდები“).

სხვადასხვა ტიპის ზონდების მახასიათებლები 1. ლოკუსსპეციფიკური ზონდები (LSI - locus - სპეციფიკური იდენტიფიკატორები, რომლებიც აკავშირებენ ქრომოსომების გარკვეულ რეგიონებს.) ეს ზონდები გამოიყენება იზოლირებული დნმ-ის ხელმისაწვდომი მოკლე (არაგანმეორებადი) თანმიმდევრობის დასადგენად, რომელიც გამოიყენება. მარკირებული ზონდის მომზადება და მისი შემდგომი ჰიბრიდიზაცია ქრომოსომების ნაკრებით. ისინი შექმნილია დიაგნოსტიკურად და პროგნოზულად მნიშვნელოვანი ქრომოსომული აბერაციების გამოსავლენად სხვადასხვა პათოლოგიურ პირობებში (მონოსომია და ტრისომია ცალკეული ქრომოსომებისთვის). ამ ნიმუშების ყველაზე ფართო გამოყენება იქნა მიღებული პრენატალური ციტოგენეტიკური დიაგნოსტიკის დროს, განსაკუთრებით ქორიონული ქსოვილის უჯრედების და ამნიოციტების ინტერფაზური ბირთვების კვლევებში.

2. ქრომოსომების ტელომერული რეგიონების დნმ-ის ზონდები (TEL telomericprobe) შექმნილია იმისთვის, რომ აღმოაჩინოს წაშლა და გადაწყობა, რომელიც გავლენას ახდენს ქრომოსომის მკლავების ტერმინალურ რეგიონებზე. ასეთი ზონდები სპეციფიკურია ქრომოსომების p- ან q-მკლავებისთვის და ავსებენ დაახლოებით 300 კბ სიგრძის რეგიონს. ქრომოსომის ბოლოდან. როგორც წესი, ქრომოსომების მოკლე და გრძელი მკლავების დნმ-ის ზონდები დაკავშირებულია სხვადასხვა ფტოროქრომებთან, რაც შესაძლებელს ხდის ქრომოსომის ორივე ტელომერული რეგიონის აღმოჩენას ერთ ციტოგენეტიკურ პრეპარატზე.

3. ცენტრომერული განმეორებითი ზონდები, ალფა ან ქრომოსომული მრიცხველები (CEP - centromere. Enumeration. Probe) არის ქრომოსომის სპეციფიკური დნმ-ის ზონდები, რომლებიც წარმოდგენილია ტანდემური ალფა და ბეტა თანამგზავრების გამეორებების თანმიმდევრობით. ეს გამეორებები ძირითადად განლაგებულია ქრომოსომების ცენტრომერულ ან პერიცენტრომერულ ჰეტეროქრომატინის რაიონებში. მათი დახმარებით, თითოეული ქრომოსომა შეიძლება შეიღებოს სხვადასხვა ფერში, რაც საშუალებას გაძლევთ სწრაფად განსაზღვროთ ქრომოსომების რაოდენობა და გადახრები მათი ნორმალური რიცხვიდან, ქრომოსომის ცალკეული მონაკვეთების შემავსებელი, მაგრამ ზოგადად მოიცავს მის მთელ სიგრძეს. ასეთი ზონდების ბიბლიოთეკის გამოყენებით შეიძლება მთელი ქრომოსომა „გაფერადდეს“ და მივიღოთ ინდივიდის დიფერენციალური სპექტრული კარიოტიპი. ამ ტიპის ანალიზი გამოიყენება ქრომოსომული აბერაციების გასაანალიზებლად, როგორიცაა ტრანსლოკაცია, როდესაც ერთი ქრომოსომის ნაწილი მეორეს მხარზე გადადის.

აპლიკაციები FISH ფართოდ გამოიყენება შემდეგი კლინიკური დიაგნოსტიკური ამოცანების გადასაჭრელად: 1. პრენატალური პერიპლანტაცია და ქრომოსომული დარღვევების დიაგნოსტიკა. გამოიყენება ინ ვიტრო განაყოფიერების (IVF) კლინიკებსა და პერინატალურ ცენტრებში. საშუალებას იძლევა დროულად (ემბრიონის იმპლანტაციამდე IVF-ის შემთხვევაში ან ნაყოფის განვითარების ადრეულ ეტაპებზე) გამოავლინოს გენეტიკური დარღვევები უშვილო ბავშვში და მიიღოს აუცილებელი ზომები. 2. ონკოჰემატოლოგია. ონკოჰემატოლოგიური დაავადებები წარმოიქმნება სხვადასხვა ქრომოსომული აბერაციების შედეგად, ამიტომ მათი დიაგნოსტიკისთვის გამოიყენება შესაბამისი CEP და LSI ზონდები. 3. მყარი სიმსივნეების დიაგნოსტიკა. ამჟამად, უფრო და უფრო მეტი მიზეზობრივი კავშირი მყარდება სპეციფიკური კიბოს განვითარებასა და გენომში კონკრეტულ ცვლილებებს შორის. ამიტომ, შესაბამისი დნმ-ის ზონდების გამოყენებისას შესაძლებელია ონკოლოგიური FISH დიაგნოსტიკის ჩატარება.

ინტერფაზური ციტოგენეტიკა: FISH-ის კომბინაცია სხვა მეთოდებთან: - FISH იმუნოფენოტიპირება (FICTION); + FICTION (ფლუორესცენციის იმუნოფენოტიპირება და ინტერფაზური ციტოგენეტიკა, როგორც ნეოპლაზმების გამოკვლევის ინსტრუმენტი) - სიმსივნური უჯრედების შესასწავლად. ამ ანალიზისთვის გამოიყენება სისხლის, ძვლის ტვინის ან სხვა ქსოვილის პრეპარატების შეუღებავი ნაცხი. ეტაპი 1 - პრეპარატები ინკუბირებულია სპეციფიკური მონოკლონური ანტისხეულებით, ეტაპი 2 - კონიუგაცია ფტოროფორებთან ტარდება ანტიგენ-მონოკლონური ანტისხეულების კომპლექსის შემდგომი ვიზუალიზაციისთვის. ეტაპი 3 - განახორციელეთ in situ ჰიბრიდიზაცია დნმ-ის ზონდებით. ფტორფორები, რომლებიც განსხვავდება ფერით, გამოიყენება მონოკლონური ანტისხეულების და დნმ-ის ზონდების გამოსავლენად. პრეპარატის შესწავლა ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ ფილტრების საჭირო კომპლექტით იძლევა ჰიბრიდიზაციის იმუნოფენოტიპის და სიგნალების ერთდროული ანალიზის საშუალებას ინტერფაზურ ბირთვებში.

TNFAIP 3-ის ქრომოსომალლეცია ქ. HL გამოვლენილია ინტერფაზური ციტოგენეტიკის მიხედვით. FICTION აანალიზებს. წარმომადგენელი გ. HL შემთხვევები კომბინირებული. CD 30 გამოხატულება (წითელი) და FISH ზონდები TNFAIP 3 და ქრომოსომა 6 ცენტრომერისთვის (ლურჯი [b]). A-C და E და F ორმაგი ფერის ანალიზებში TNFAIP 3 ზონდი მონიშნულია მწვანედ (g); D-ში გამოყენებული სამმაგი ფერის ანალიზში, TNFAIP 3 ზონდი იძლევა გ/ნარინჯისფერ კოლოკალიზებულ (კო) სიგნალს. ორი განსხვავებული სტრატეგია გამოიყენება ორმაგი და სამმაგი ფერის FISH ანალიზების საჩვენებლად CD 30 იმუნოფლუორესცენციასთან ერთად; მე. ე. , ორმაგი ფერის ანალიზები (A–C და E და F) ნაჩვენებია სამმაგი ფერადი დისპლეის გამოყენებით, ხოლო ცრუ მრავალფერიანი დისპლეი, რომელიც მიღებულია Isis პროგრამული უზრუნველყოფის მიერ, გამოიყენება სამმაგი ფერის ანალიზისთვის (D), რათა ერთდროულად აჩვენოს ოთხი ფერი ( ანუ, CD 30 [r], TNFAIP 3 [გ] და ნარინჯისფერი, და ქრომოსომა 6 ცენტრომერი [b]).

მიკროგამოსახულებების ციფრულმა ჩაწერამ გახსნა ფსევდოფერად გადაქცევის შესაძლებლობა არა მხოლოდ ფტორფორების კომბინაციით, არამედ მათი თანაფარდობით, ინტენსივობით.

ქრომოსომების მრავალფეროვანი შეღებვა (Muli. Color Banding - MSV) ეს მეთოდი განკუთვნილია არა ყველა ქრომოსომის სრული ანალიზისთვის, არამედ ერთი ქრომოსომის დეტალური ანალიზისთვის. ლოკუსსპეციფიკური დნმ-ის ზონდები მონიშნულია სხვადასხვა ფტორფორებით ან ფტორფორების კომბინაციით ისე, რომ დნმ-ის თითოეული ზონდის სიგნალის დონე განსხვავდება ინტენსივობით. დნმ-ის ზონდის სიგნალების გადაფარვის ინტენსივობის პროფილები იძლევა ვარიაციებს ქრომოსომის გასწვრივ სხვადასხვა ფტორფორების ფლუორესცენციის ინტენსივობის თანაფარდობებში. ინტენსივობის კოეფიციენტები შეიძლება ითარგმნოს ფსევდოფერებად და, ამრიგად, გამოსახულების თითოეულ წერტილს და, შესაბამისად, თითოეულ ქრომოსომულ ადგილს ექნება თავისი ფსევდოფერი. მულტიკოლორული FISH მეთოდის ეს ვარიანტი უაღრესად ეფექტური აღმოჩნდა ონკოლოგიურ დაავადებებში არა მარტო ქრომოსომული, არამედ ინტრაქრომოსომული გადაკეთებების ანალიზში. თუმცა, მისი წარმატებული გამოყენებისთვის, ჯერ უნდა განისაზღვროს ქრომოსომა, რომელიც იქნება გამოკვლეული. მოლეკულური ციტოგენეტიკის ეს მეთოდი შესაფერისია გარკვეულ ქრომოსომებთან დაკავშირებული კარიოტიპური დარღვევების ანალიზისთვის.

დღეისათვის შექმნილია დნმ-ის ზონდების ნაკრები, რომელიც უზრუნველყოფს MCV-ს ყველა ადამიანის ქრომოსომისთვის მე-5 ქრომოსომაზე; მე-5 ქრომოსომის მრავალფეროვანი ზოლები; მე-5 ქრომოსომის იდიოგრამა; ფტოროქრომები გამოიყენება MSV-სთვის).

მეტაფაზური ციტოგენეტიკა, რომელიც ისტორიულად წარმოიშვა უფრო ადრე, ვიდრე ინტერფაზური ციტოგენეტიკა, შესაძლებელს ხდის ქრომოსომული დარღვევების ფართო სპექტრის დადგენას, მაგრამ ამისათვის აუცილებელია, რომ შესწავლილი უჯრედები იყვნენ მეიოზის მეტაფაზის სტადიაზე.

მრავალფერიანი კარიოტიპინგი ანალიზი ტარდება ხელების ან მთლიანი ქრომოსომების უწყვეტი შეღებვის დნმ-ის ზონდების გამოყენებით (WCP ზონდები - მთლიანი ქრომოსომის საღებავი). ასეთი ზონდები ჰიბრიდირებულია მრავალი მოკლე დნმ-ის თანმიმდევრობით, რომლებიც განლაგებულია ქრომოსომის მთელ სიგრძეზე. ამრიგად, ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ დათვალიერებისას, ქრომოსომა ერთნაირად შეღებილი ჩანს გარკვეულ ფერში.

ამ ანალიზისთვის გამოყენებული დნმ-ის ზონდები შედგება ადამიანის ქრომოსომების სრული ნაკრებისთვის მყარი შეღებვის ზონდების ნარევისგან, რომლებიც ეტიკეტირებულია რამდენიმე ფტოროქრომის კომბინაციით, რომელთა თანაფარდობა ინდივიდუალურად შეირჩევა თითოეული წყვილი ქრომოსომისთვის. შესაბამისი სარეგისტრაციო მეთოდებისა და კომპიუტერული პროგრამების გამოყენება გამოსახულების ანალიზისთვის, რომელიც აფასებს ყველა ფტოროქრომის ლუმინესცენციის ინტენსივობას გამოსახულების თითოეული წერტილისთვის, შესაძლებელს ხდის კარიოტიპის ჩატარებას, რომელშიც ქრომოსომების თითოეულ წყვილს აქვს თავისი უნიკალური "ფსევდოფერი". ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor ან multiplex. FISH) არის ტრადიციული მრავალფეროვანი FISH-ის ზოგადი სახელწოდება ფტოროქრომის სპეციფიკური ფილტრების ნაკრების გამოყენებით. M-FISH პრინციპი მოიცავს ყველა გამოყენებული ფტოროქრომის სიგნალის ცალკეულ ციფრულ ჩაწერას, რაც მიიღწევა ფილტრების ნაკრების თანმიმდევრული შეცვლით. ყველა სურათი ჩაწერილია ცალკეულ ფაილებში, რაც საშუალებას იძლევა მათი ეფექტური დამუშავება, რომელიც დაკავშირებულია სიგნალის და ფონის გამიჯვნასთან, ასევე სიგნალის რაოდენობრივ შეფასებასთან. ყველა ჩაწერილი ინფორმაციის დამუშავება სპეციალური პროგრამული უზრუნველყოფის დახმარებით თარგმნის ინფორმაციას გამოსახულების თითოეულ წერტილში ფლუოქრომული სიგნალების დონის შესახებ ფსევდოფერებად. გამოყენებული დნმ-ის ზონდების რაოდენობის ერთ-ერთი მთავარი შეზღუდვაა ხელმისაწვდომი ფტოროქრომების რაოდენობა, არა გადახურვის აგზნებისა და ემისიის სპექტრებით და შესაბამისი ფილტრების კომპლექტების ხელმისაწვდომობა.

24 ფერის თევზი ყველაზე ფართოდ გამოყენებული M-FISH არის 24 ფერის FISH ადამიანის ყველა ქრომოსომის მასალის ერთდროული იდენტიფიკაციისთვის. ის ძალზე ეფექტურია ქრომოსომული გადაადგილების გამოსავლენად, მაგრამ არ არის შექმნილი წაშლისა და ინვერსიების გამოსავლენად. თუმცა, ეს პრობლემა ნაწილობრივ შეიძლება მოგვარდეს ქრომოსომების ერთდროული შეღებვით DAPI-ით, რაც შესაძლებელს ხდის ქრომოსომების დიფერენციალური ზოლის ანალიზის საშუალებას, რომელთა ქრომოსომული მასალა უკვე გამოვლენილია. სამწუხაროდ, უნდა აღინიშნოს, რომ M-FISH-ის შემდეგ ქრომოსომის DAPI ზოლის ხარისხი მნიშვნელოვნად ჩამოუვარდება GTG დიფერენციალურ შეღებვას და DAPI ზოლირებასაც კი ჩვეულებრივი in situ ჰიბრიდიზაციის შემდეგ.

Rx. FISH M-FISH პრინციპი გამოიყენებოდა ადამიანის ქრომოსომების მრავალფეროვანი შტრიხ-კოდის გენერირებისთვის და მრავალფერადი ქრომოსომის ზოლის მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია სახეობებს შორის in situ ჰიბრიდიზაციაზე. 24 ფერის FISH-ისგან განსხვავებით, ეს მეთოდი შესაძლებელს ხდის უშუალოდ გამოავლინოს ინტრაქრომოსომული გადანაწილების ნაწილი. Rx-ში გამოყენებული დნმ-ის ზონდები. FISH ეტიკეტირებულია 3 ფტოროქრომის კომბინაციით, რომელიც უზრუნველყოფს 7 ფსევდო ფერს. ისინი სპეციალურად აფერადებენ ქრომოსომების ცალკეულ რეგიონებს, ქმნიან მათ ფერთა ზოლებს. დნმ-ის ნიმუშების ეს თვისება Rx-ისთვის. FISH განისაზღვრება მათი მიღების გზით. ისინი წარმოადგენენ გიბონის ორი სახეობის ქრომოსომისთვის სპეციფიკურ დნმ ბიბლიოთეკას: Hylobates concolor და Hylobates syndactylus.

გიბონების თანამედროვე სახეობების ფორმირებისას მომხდარი ინტენსიური ქრომოსომული გადაწყობის შედეგად, მათი ქრომოსომების მასალა ძლიერ შერეული აღმოჩნდა ადამიანებში ქრომოსომების ორგანიზაციასთან შედარებით, რომელთა ქრომოსომები ცნობილია კონსერვატიულობით. ადამიანის 1 ქრომოსომის თანაფარდობა გიბონის ქრომოსომებთან ნაჩვენებია სურათზე 1,

სურათი 2 გვიჩვენებს Rx-ის შედეგად მიღებული ადამიანის ქრომოსომების ზოგად ხედს. თევზი. ა) მეტაფაზური ფირფიტა ბ) ქრომოსომების განლაგება.

თუმცა, RXFISH-ს აქვს სერიოზული შეზღუდვები - ქრომოსომის გადანაწილება, რომელიც მოხდა ერთი ფერის RX ზოლში, ვერ იქნება გამოვლენილი ამ მეთოდის გამოყენებით, თუ ისინი არ გამოიწვევს ამ ზოლის ზომაში მნიშვნელოვან და ადვილად შესამჩნევ ცვლილებებს. - ზონდები აფერადებენ სხვადასხვა ქრომოსომის რამდენიმე ქრომოსომულ რეგიონს ერთ ფსევდოფერში. თუმცა, როგორც იზრდება გამოყენებული ფტოროქრომების რაოდენობა, RXFISH მეთოდი უდავოდ უფრო ინფორმატიული იქნება, ვიდრე რუტინული 24 ფერის FISH.

ამჟამად RXFISH-ის უპირატესობებში შედის შემდეგი პუნქტები: მეთოდი იძლევა ადამიანის მთელი გენომის ანალიზის საშუალებას ერთ მრავალფეროვან FISH ექსპერიმენტში. ხელმისაწვდომია კომერციულად ხელმისაწვდომი დნმ-ის ეტიკეტირებული ზონდების ნაკრები და საჭირო გამოვლენის სისტემები. მეთოდი საშუალებას იძლევა სწრაფად იდენტიფიცირდეს ინტრა- და ინტერქრომოსომული გადაწყობების მნიშვნელოვანი ნაწილი. შესაძლებელია „ფერადი ზოლის“ მეტაფაზური ქრომოსომების ავტომატური იდენტიფიკაცია. ადამიანის თითოეულ ქრომოსომას აქვს უნიკალური ფერის შტრიხ კოდი. RXFISH ინტეგრირებულია Cyto სამუშაო სადგურში. მხედველობის და სტანდარტული ფლუორესცენტული მიკროსკოპის სისტემები.

სპექტრული კარიოტიპინგი (SKY-სპექტრულიკარიოტიპინგი) სპექტრული კარიოტიპის მიკროსკოპული გამოსახულების ანალიზის ძირითადი პრინციპები პრაქტიკულად იგივეა, რაც გამოიყენება M-FISH-ში. განსხვავებები დაკავშირებულია გამოსახულების რეგისტრირების გზასთან. SKY ტექნოლოგია საშუალებას გაძლევთ მიიღოთ სპექტრული მრუდები გამოსახულების ყველა წერტილისთვის ერთი გაზომვის დროს, მიუხედავად იმისა, ასოცირდება ეს ეპიფლუორესცენციასთან თუ ტრადიციულ სინათლის მიკროსკოპასთან. ადამიანის ყველა ქრომოსომის სპექტრალური კარიოტიპისთვის გამოიყენება ხუთი ფტოროქრომი, ერთი მწვანე სპექტრში, ორი წითელი და ორი ინფრაწითელი. დნმ-ის ზონდების მარკირებაში გამოყენებული ყველა ფტოროქრომის აგზნება და ემისია ხდება ფილტრების ერთი ნაკრებით, რაც შესაძლებელს ხდის თავიდან აიცილოს მათი თანმიმდევრული ცვლილება, შუალედური ფოკუსირება და, შესაბამისად, დაკავშირებული პრობლემები, როგორიცაა გამოსახულების სივრცითი ცვლა, ზღვრული მნიშვნელობების განსაზღვრა. და სეგმენტაციის ნიღბები. სპექტრული მრუდების ანალიზის საფუძველზე განისაზღვრება კონკრეტული ფტოროქრომების არსებობა ან არარსებობა მოცემულ წერტილში.

შემდეგი ნაბიჯი არის კლასიფიკაციის პროცედურა, რომელიც საშუალებას გაძლევთ პირდაპირ და ცალსახად განსაზღვროთ გაანალიზებული მასალის ქრომოსომული კუთვნილება. ეს უზრუნველყოფს მარკერის ქრომოსომული მასალის საიმედო იდენტიფიკაციას (ქრომოსომამდე), ისევე როგორც ქრომოსომის წარმოებულებს, რომლებიც წარმოიქმნება სხვადასხვა გადაწყობის შედეგად. SKY-ის დიდი უპირატესობა ის არის, რომ DAPI შეღებვა რეგისტრირებულია სპექტრალური გამოსახულების პარალელურად. DAPI ზოლის პროგრამული გაუმჯობესება საშუალებას გაძლევთ მიაღწიოთ დიფერენციალურ ზოლებს ხარისხში GTG ზოლთან ახლოს. სპექტრული გამოსახულების პარალელური ანალიზისა და ქრომოსომების ხარისხობრივი დიფერენციალური შეღებვის შესაძლებლობა მნიშვნელოვნად ამარტივებს SKY-ის შედეგების ინტერპრეტაციას და საშუალებას იძლევა უფრო ზუსტად განსაზღვროს ქრომოსომის რღვევის წერტილები. SKY-ის უდავო უპირატესობებში შედის ფტოროქრომების გამოყენების შესაძლებლობა გადახურვის აგზნებისა და ემისიის სპექტრით, რაც მნიშვნელოვნად აფართოებს გამოსაყენებელი ფტორქრომების ჩამონათვალს და ასევე ზრდის ფტოროქრომების რაოდენობას, რომლებიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ერთდროულად. ახალი ფტოროქრომის ჩამონათვალს არ საჭიროებს ფილტრების ახალი ნაკრების შეძენა, რადგან ერთი ფილტრის ერთეული სპექტრალური FISH-ისთვის და ერთი ფილტრის ერთეული DAPI-სთვის საკმარისია SKY-სთვის.

SKY-ის უარყოფითი მხარე მოიცავს: - ხანგრძლივი ექსპოზიციის დროს, რომელიც აუცილებელია მიკროსკოპული სურათების ჩასაწერად. - SKY გარკვეულწილად ნაკლებად ეფექტურია ვიდრე M-FISH, როდესაც საქმე ეხება შედარებით მცირე დნმ-ის ზონდებს კვლევას.

ფერის შეცვლის კარიოტიპირება (CCKs ფერის შეცვლის კარიოტიპინგი) ეს მეთოდი ეფუძნება სიგნალის სიგრძის სხვაობის ანალიზს დნმ-ის ნიმუშებს შორის, რომლებიც ჰიბრიდირებულია ფტოროქრომებთან ასოცირებულ დნმ-ის ზონდებთან და ანტისხეულების მატარებელ დნმ-ის ზონდებთან. მეთოდი შესაძლებელია მხოლოდ 3 ფილტრით და არ საჭიროებს სპეციალურ კამერებსა და პროგრამულ უზრუნველყოფას. ქრომოსომების იდენტიფიცირებისთვის ტარდება ერთი ჰიბრიდიზაცია და მიიღება ორი გამოსახულება. მეთოდი ემყარება ფლუორესცენტური სიგნალის სიგრძის განსხვავებას, რადგან ანტისხეულებთან დაკავშირებული დნმ-ის ნიმუშების ექსპოზიციის დრო 80-90%-ით ნაკლებია, ვიდრე ფტოროქრომებთან დაკავშირებული ნიმუშები. ჰიბრიდიზაციის რეაქციის შემდეგ, ნაცხი ექვემდებარება შესაბამის პირველად ანტისხეულებს და შემდეგ ვიზუალიზაცია ხდება პირველი სურათის მისაღებად. შემდეგ სლაიდები ექვემდებარება მეორად ანტისხეულებს და ავიდინს უკავშირდება იმავე ფტოროქრომებს. შტრიხების გადაღება შესაძლებელია DAPI-ის გამოყენებით.

მომავალში, პრეპარატების სურათები კვლავ მიიღება 3 ფილტრის გამოყენებით. ამ სურათების შედარება ხდება სპეციალური პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით და მიიღება მეორე სურათი, რომელშიც მხოლოდ გარკვეულ ანტისხეულებთან დაკავშირებული ქრომოსომა იქნება ხილული. ამრიგად, ზოგიერთი ქრომოსომა მხოლოდ პირველ ან მეორე სკანირებაზე ფლუორესცირდება, ზოგი კი ფერს შეიცვლის სხვადასხვა სკანირებისას.

შედარებითი გენომის ჰიბრიდიზაცია (CGH) მეთოდი შეიქმნა გენომში რაოდენობრივი დარღვევების გამოსავლენად. იგი ეფუძნება in situ ჰიბრიდიზაციის რეაქციის განხორციელებას მთელი გენომის გამოყენებით, როგორც დნმ-ის ზონდი. იზოლირებული და ნორმალური დონორი დნმ იწერება სხვადასხვა ფერის ფტოროქრომებით, რაც მათ დნმ-ის ზონდებად აქცევს. ამ ზონდების ექვივალენტური რაოდენობა შერეულია და გამოიყენება საკონტროლო ციტოგენეტიკურ პრეპარატთან ჰიბრიდიზაციისას. FISH-ის შემდეგ მეტაფაზები გაანალიზებულია ფლუორესცენტურ მიკროსკოპზე, სპეციალიზებული კომპიუტერული გამოსახულების ანალიზის პროგრამის გამოყენებით, რათა დადგინდეს ორი ფტოროქრომის ფლუორესცენციის ინტენსივობა თითოეული ქრომოსომის მთელ სიგრძეზე.

ტესტის ნიმუშის კარიოტიპში რაოდენობრივი ცვლილებების არარსებობის შემთხვევაში, შეინიშნება ორი ფტოროქრომის ლუმინესცენციის ინტენსივობის გარკვეული თანაფარდობა. გენის გაძლიერების შემთხვევაში შესაბამისი ფტოროქრომის სიგნალის ინტენსივობა გაიზრდება, გენეტიკური მასალის ნაწილის დაკარგვის შემთხვევაში კი პირიქით, დასუსტდება. ამრიგად, CGH შესაძლებელს ხდის გენომიური დისბალანსის გამოვლენას, მაგრამ ეს მეთოდი არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას დაბალანსებული გადაადგილებისა და ინვერსიების გამოსავლენად, ხოლო ტრისომიები და წაშლა შეიძლება გამოვლინდეს მხოლოდ იმ შემთხვევაში, თუ გაუწონასწორებელი რეგიონის ზომა არის მინიმუმ 10 მილიონი ბაზის წყვილი.

სატესტო ნიმუშში ქრომოსომული დისბალანსი შეფასებულია ორი განსხვავებული ფტოროქრომის ფლუორესცენტის ინტენსივობის სხვაობიდან ფლუორესცენტური თანაფარდობის (FR) გაანგარიშებით.

CGH მეთოდს აქვს მრავალი უპირატესობა გენომის ცვლილებების ანალიზის სხვა მეთოდებთან შედარებით: პირველი, ის არ არის დამოკიდებული ტესტის მასალის წყაროზე და წარმატებით შეიძლება შესრულდეს მცირე რაოდენობით დნმ-ის ტესტირებით, საარქივო მასალის ჩათვლით. მეორეც, ის საშუალებას იძლევა მიიღოთ დეტალური ინფორმაცია გენეტიკური მასალის დაკარგვის ან რაოდენობის გაზრდის შესახებ გენომში ერთ ექსპერიმენტში. მესამე, CGH მეთოდი არ საჭიროებს შესწავლილი ქსოვილისგან მეტაფაზის ქრომოსომის პრეპარატების მომზადებას, ანუ ის არ არის დამოკიდებული უჯრედის კულტურის პროცესზე და მასთან დაკავშირებულ არტეფაქტებზე.

გენომის situ ჰიბრიდიზაცია (genomicin situ hybridization in, GISH) არის situ ჰიბრიდიზაციის მეთოდის ვარიანტი, რომელიც მდგომარეობს იმაში, რომ ფიქსირებული ნიმუშებით ჰიბრიდიზაციისთვის გამოიყენება ორგანიზმის ერთი სახეობის გენომის მთლიანი დნმ, როგორც ფლუორესცენტურად მარკირებული ზონდი. რომელსაც კონკურენციას უწევს ორგანიზმის სხვა სახეობის მთლიანი გენომიური დნმ; გამოიყენება გენომებში სახეობათაშორისი და შიდასახეობრივი განსხვავებების დასადგენად, ქრომოსომული გადაწყობა, წაშლა და ჩანაცვლება.

FISH ვარიაციები 1) Q-FISH - რაოდენობრივი FISH: შემუშავებული Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward და P. M. Lansdorp. 1998. მოკლე ტელომერები ადამიანის ქრომოსომაზე 17 გვ. ნატ. გენეტი. 18:76-80. რაოდენობრივი მეთოდი. შექმნილია ნაკადის ციტომეტრიით მუშაობისთვის. თავდაპირველად გამოიყენებოდა ქრომოსომის სიგრძის გასაზომად (გარჩევადობა: 200 bp) ტელომერული გამეორებების რაოდენობის დათვლით. გამოიყენება PNA-კონიუგირებული ზონდები. თავდაპირველად მეტაფაზური ქრომოსომები შეისწავლეს (QFISH proper), ახლა ეს მეთოდი გამოიყენება ინტერფაზურ ქრომოსომებზეც (IQ-FISH). Q-FISH ტარდება უჯრედის კულტურაზე, ქსოვილის მონაკვეთებზე (ორივე სათვალეებზე). ამ დროისთვის Q-FISH არის მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი ტელომერების როლის შესწავლაში დაბერების და კიბოს ფორმირების პროცესებში.

PNA-FISH - პეპტიდური ნუკლეინის მჟავები FISH: პეპტიდური ნუკლეინის მჟავები (PNA) არის დნმ-ის სინთეზური ანალოგები, რომლებშიც დეზოქსირიბოზა ფოსფატის შაქრის ხერხემალი, რომელიც მხარს უჭერს აზოტოვან ბაზას, ჩანაცვლებულია დაუმუხტი პეპტიდის ხერხემლით. ამ სტრუქტურის შედეგად: როდესაც PNA-ოლიგომერული ზონდი ჰიბრიდდება დამატებით დნმ/რნმ-თან, ელექტროსტატიკური მოგერიება არ ხდება. PNA-DNA (PNA-RNA) დუპლექსები ბევრად უფრო სტაბილურია, ვიდრე ბუნებრივი ჰომო/ჰეტეროდუპლექსები. PNA-დნმ-ის შეკავშირების მაღალი სპეციფიკა: PNA-დნმ ჰიბრიდიზაცია ბევრად უფრო მგრძნობიარეა ბაზის წყვილის შეუსაბამობის მიმართ, ვიდრე დნმ-დნმ ჰიბრიდიზაცია. ამრიგად, PNA ზონდის გამოყენებით, შეიძლება განვასხვავოთ ორი ცენტრომერული გამეორება, რომლებიც განსხვავდება მხოლოდ ერთი ბაზის წყვილში. PNA-ს აქვს შედარებითი ჰიდროფობიურობა (დნმ-თან შედარებით), რის შედეგადაც PNA უკეთესად ვრცელდება უჯრედის კედლებში => ფართო გამოყენება მიკრობიოლოგიაში. მაღალი შებოჭვის სპეციფიკაზე დაყრდნობით: ითვლება, რომ PNA ტექნოლოგია მალე გახდება ალელური სპეციფიური ზონდების შექმნის საფუძველი in situ ჰიბრიდიზაციისთვის. გამოიყენება გენეტიკაში, ციტოგენეტიკაში, ეპიგენეტიკაში, მიკრობიოლოგიაში და ა.შ.

3) Flow-FISH - FISH ნაკადის ციტომეტრიისთვის: შემოთავაზებული 1998 წელს: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM ტელომერის სიგრძის დინამიკა ადამიანის ლიმფოციტების ქვეპოპულაციებში ნაკადის გაზომვით. . ბუნების ბიოტექნოლოგია. 16, 743–747 (1998). Q-FISH და ნაკადის ციტომეტრიის კომბინაცია, რომელიც იძლევა სიგნალის ანალიზის (გაზომვის) და დახარისხების საშუალებას. Flow-FISH-ისთვის გამოიყენება უჯრედის სუსპენზია (ქრომოსომის ტელომერების სიგრძის გასაზომად), ქრომოსომის გავრცელებისა და იზოლირებული ქრომოსომების (შემდგომი რუკების გასაზომად). როგორც Q-FISH-ში, PNA-ით მონიშნული ტელომერული ზონდები გამოიყენება (მაგალითად, ტელომერული გამეორებების გამოსახულების და სიგრძის გასაზომად) მთავარი უპირატესობა არის უფრო სწრაფი მეთოდი (დიდი რაოდენობის უჯრედების/ქრომოსომების ანალიზი/დახარისხება). ფართოდ გამოიყენება სხვადასხვა პრობლემის შესასწავლად: დაბერების, ტელომერების შენარჩუნების, სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების სუსპენზიების ex vivo, ბაქტერიების შესწავლა.

მულტიპარამეტრული ანალიზი იძლევა უჯრედების ტიპების დიფერენცირების საშუალებას ერთი ნიმუშის ფარგლებში, რაც საშუალებას იძლევა შიდა კონტროლი და ლეიკოციტების ქვეტიპების ანალიზი.

flow-FISH-ის უპირატესობები: ადვილად რეპროდუცირებადი შედეგები პოპულაციის უჯრედების ქვეჯგუფების ანალიზის უნარი ფიზიკური იმუნოფლუორესცენციისა და მარკერების გამოყენებით Q-FISH-ზე უკეთესი შესრულება ათასობით უჯრედის ფლუორესცენტის რაოდენობრივი განსაზღვრის უნარი.

იზოლირებული ქრომოსომების გამოკვლევა ნაკადის ციტომეტრიით 1. ქრომოსომის დახარისხება ნაკადის ციტომეტრიით - კარიოტიპირება ნაკადის ციტომეტრიით გამოიყენება გენების შემდგომი რუქაზე და ქრომოსომის ბიბლიოთეკების შესაქმნელად. - დახარისხებულ ქრომოსომებზე გენების იდენტიფიკაცია და ლოკალიზაცია ხორციელდება FISH მეთოდების/PRINS მეთოდის (primed in situ labeling) ან მისი ვარიაციების და ქრომოსომისთვის სპეციფიკური PCR-ის შემდგომი გამოყენებით. - 2011 წლისთვის ამ დროისთვის წარმატებით დახარისხებულია მხოლოდ 17 სახეობის კულტივირებული მცენარის ქრომოსომა. - მეტაფაზის ან პაქიტენური ქრომოსომების დახარისხება მაღალი გაყოფის ინდექსით.

ფლუორესცენტური ეტიკეტი: - ქრომოსომები იარლიყება ნუკლეინის მჟავას სპეციფიკური ფტოროქრომებით. - ფტოროქრომები შეირჩევა 1) აზოტოვანი ბაზების სპეციფიკის, 2) ექსპერიმენტული პირობების მიხედვით (მათ შორის ხელმისაწვდომი ლაზერების ტალღის სიგრძის გათვალისწინებით). 1. მონოვარიანტული ანალიზისთვის გამოიყენეთ საღებავები, რომლებიც არ არის სპეციფიკური AT ან GC ორთქლისთვის: პროპიდიუმის იოდიდი (აგზნების პიკი: 535 ნმ, ემისიები: 617 ნმ, საჭიროა ლაზერი: 488 ნმ არგონის ლაზერი ან ნათურა + გრძელგამტარი ფილტრი) ეთიდიუმის ბრომიდი ( აგზნების პიკები: : 300 და 520 ნმ, ემისია: 600 ნმ, საჭირო ლაზერი: 488 ნმ არგონის ლაზერი ან ნათურა + გრძელგამტარი ფილტრი) ეს ეტიკეტები აფერადებენ დნმ-ს A, G, T ან აზოტოვანი ბაზების შემცველობის მიუხედავად. 2. ბივარიანტული ანალიზისთვის გამოიყენება: ქრომომიცინი (სპეციფიკური G-C ბაზის წყვილებისთვის), პიკი A 3 აგზნება: 458 ნმ, ემისია 580 ნმ. ლაზერი: , 458 ნმ მინიმალური 400 მ. ვ სიმძლავრე. Hoechst 33258 (A-T bp სპეციფიკური), აგზნება: 351-364 ნმ, ემისია: 470 ნმ. ლაზერი: 351 -364 ნმ (ძლიერი). ლაზერები დროში და სივრცეში უნდა იყოს გამიჯნული ფტოროქრომული სპექტრების ნაწილობრივი გადახურვის გამო.

2. ქრომოსომების/ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების შესწავლა დახარისხების შემდეგ (ფიზიკური და გენეტიკური რუკების შესაქმნელად და ა.შ.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS დიდი გენომის შესწავლა გრძელი ქრომოსომებით. თანმიმდევრობების რუკტი გამეორებების დიდი რაოდენობით (მაგ: ტელომერული და ცენტრომერული რეგიონები). მოკლე ზონდების გამოყენება. გამეორებების დიდი რაოდენობის გამო, სიგნალი ძლიერია. ზონდის სტანდარტული ზომა: 15 - 30 ნუკლეოტიდი. თევზი

FISH-ის პრობლემები: ძნელია ერთადგილიანი დნმ-ის თანმიმდევრობების ლოკალიზაცია (ანუ არაგანმეორებადი უნიკალური დნმ-ის თანმიმდევრობები), რადგან სიგნალი ძალიან სუსტი იქნება სტანდარტული მოკლე ზონდების გამოყენებისას. სიგნალის გასაძლიერებლად ზონდის სიგრძის რამდენიმე კილობაზამდე გაზრდა გამოიწვევს მგრძნობელობის დაქვეითებას და => არასპეციფიკურ დაკავშირებას. გამოსავალი: BAC-FISH -BAC-FISH არის FISH მეთოდის კომბინაცია და გენომიური დნმ-ის კლონების გამოყენება, რომლებიც ინტეგრირებულია ბაქტერიულ ხელოვნურ ქრომოსომებში (BAC), რაც იძლევა დიდი დნმ-ის თანმიმდევრობების ჩასმის საშუალებას. - ეფექტური მეთოდი მცირე გენომის მქონე ორგანიზმების ცალკეული ქრომოსომების იდენტიფიკაციისა და რუკის გამოსავლენად. ზონდად გამოიყენება BAC ზონდები, overgos (გადახურული ოლიგონუკლეოტიდები).

FISH-ის ალტერნატივა: PRINS PRINS (პრიმირებული in situ მარკირება) არის ქრომოსომების მარკირების მეთოდი ოლიგონუკლეოტიდური დნმ პრაიმერის ანეილირების გზით დენატურირებული ქრომოსომული დნმ-ის ჰომოლოგიური თანმიმდევრობით და პრაიმერის შემდგომი ფერმენტული გაფართოება in situ მარკირებული ნუკლეოტიდებით. პირველად აღწერილი Koch et al. 1989 წელს (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) ოლიგონუკლეოტიდის პრაიმინგის მეთოდები ალფა სატელიტური დნმ-ის ქრომოსომისთვის სპეციფიკური მარკირების in situ. Chromosoma 98, 25 -265). PRINS არის FISH-ის ალტერნატივა. იგი გამოიყენება ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების ლოკალიზაციისთვის, მეტაფაზური ან ინტერფაზური ქრომოსომების ან ქრომოსომული წყვილების (ქრომოსომული ანევპლოიდიის ჩათვლით) ამოცნობისა და დათვლისთვის. არალეგირებული პრაიმერის (პრაიმერი-პრაიმერი) დნმ-ით ადუღება; პრაიმერის გახანგრძლივება თერმომდგრადი დნმ-პოლიმერაზის და მარკირებული ნუკლეოტიდების დახმარებით; რეაქციის შეწყვეტა (მაბლოკირებელი მოლეკულის მიმაგრება 3'-ბოლოზე) პრაიმერზე. : PCR შეზღუდვის ფრაგმენტი; - არაპირდაპირი (ბიოტინი/დიგ ფტოროქრომ-კონიუგირებული ავიდინი/ანტი-დიგ) - მხოლოდ ერთი წყვილი ჰომოლოგიური ქრომოსომა (ერთი ქრომოსომა) შეიძლება გამოვლინდეს თითოეული PRINS რეაქციის შედეგებში. შემდეგი PRINS რეაქცია იმავე სლაიდზე შეიძლება განხორციელდეს მხოლოდ წინა დაბლოკვის შემდეგ. - გამოიყენება დნმ-ის თანმიმდევრობებისთვის გამეორებების დიდი რაოდენობით.

PRINS-ის უპირატესობები: 1. მოითხოვს მინიმალური თანმიმდევრობის ინფორმაციას, რომელიც საჭიროა ოლიგონუკლეოტიდური პრაიმერის სინთეზისთვის. 2. უსწრაფესი და მარტივი მეთოდი ქრომოსომაზე ინტერესის თანმიმდევრობის გამოსავლენად (შედარებით მძიმე FISH ზონდებთან, რომლებიც ჰიბრიდებენ ძალიან დიდი ხნის განმავლობაში). 3. ზონდის მარკირების ეტაპის გამორიცხვა. 4. პრაიმერის გახანგრძლივების შესაძლებლობა მონიშნული ნუკლეოტიდებით c-PRINS სიგნალის გასაძლიერებლად მოკლე უნიკალური მიმდევრობების გამოვლენისას. დაბალი ასლის გამეორებების ან მოკლე უნიკალური თანმიმდევრობების იდენტიფიცირებისთვის გამოიყენება უფრო მგრძნობიარე მეთოდი - ველოსიპედით PRINS (c-PRINS). C-PRINS შემოთავაზებული იყო Gosden et al. 1991 წელს გაუმჯობესებული ფართოდ გამოყენებული პროტოკოლი Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). დნმ-ის თანმიმდევრობების ლოკალიზაცია მცენარეთა ქრომოსომებზე PRINS-ისა და C-PRINS-ის გამოყენებით. მეთოდები Cell Science 23: 71-82). C-PRINS მოიცავს PCR-ის მსგავსი თერმული ციკლების სერიას.

გარსის სითხე თევზისთვის: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. ნაკადის ციტომეტრია და FISH ტელომერების საშუალო სიგრძის გასაზომად (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 მ. M KCl + 10 მ. მ ნა. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. მიტოზური ქრომოსომების ნაკადის დახარისხება ჩვეულებრივ ხორბალში (Triticum aestivum L.). გენეტიკა. 2000; 156(4): 2033-41) . ასე რომ, 4 ბუფერი დითიოთრეიტოლის გარეშე (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Flow-sorted chromosomes: fine material for მცენარეთა გენის ფიზიკური რუკების შესასრულებლად. Caryologia. 2006, ტ. 59, No. 2: 99 -103 ) -ავტოკლავირებული 0,1% (წონა/მოც.) Na. Cl-50მ. მ ნა. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. ქრომოსომის დახარისხება ტეტრაპლოიდურ ხორბალში და მისი პოტენციალი გენომის ანალიზისთვის. გენეტიკა: 52,120. 823–829) -ქრომოსომის სტაბილიზატორი პოლიამინის ბუფერი (ცილის შემცველი გარსის სითხე) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

ფლუორესცენციის in situ ჰიბრიდიზაცია

ფლუორესცენტური ჰიბრიდიზაცია ადგილზე , ან FISH მეთოდი (ინგლ. ფლუორესცენცია ადგილზე ჰიბრიდიზაცია - FISH ) - ციტოგენეტიკური მეთოდი, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის კონკრეტული თანმიმდევრობის პოზიციის გამოსავლენად და განსაზღვრისათვის მეტაფაზას ქრომოსომებზე ან ინტერფაზურ ბირთვებში. ადგილზე. გარდა ამისა, FISH გამოიყენება ქსოვილის ნიმუშში კონკრეტული mRNA-ების გამოსავლენად. ამ უკანასკნელ შემთხვევაში, FISH მეთოდი შესაძლებელს ხდის უჯრედებსა და ქსოვილებში გენის ექსპრესიის სივრცითი-დროითი მახასიათებლების დადგენას.

ზონდები

ფლუორესცენტური ჰიბრიდიზაციით ადგილზეგამოიყენეთ დნმ-ის ზონდები (დნმ ზონდები), რომლებიც უკავშირდებიან ნიმუშში არსებულ დამატებით სამიზნეებს. დნმ-ის ზონდები შეიცავს ნუკლეოზიდებს, რომლებიც მონიშნულია ფტორფორებით (პირდაპირი მარკირება) ან კონიუგატებით, როგორიცაა ბიოტინი ან დიგოქსიგენინი (არაპირდაპირი მარკირება). პირდაპირი მარკირებით, დნმ-ის ზონდი, რომელიც მიბმულია სამიზნეზე, შეიძლება დაფიქსირდეს ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით ჰიბრიდიზაციის დასრულებისთანავე. არაპირდაპირი მარკირების შემთხვევაში საჭიროა დამატებითი შეღებვის პროცედურა, რომლის დროსაც ბიოტინი ვლინდება ფლუორესცენტურად მარკირებული ავიდინის ან სტეავიდინის გამოყენებით, ხოლო დიგოქსიგენინი ფლუორესცენტურად მარკირებული ანტისხეულების გამოყენებით. მიუხედავად იმისა, რომ დნმ-ის ნიმუშების მარკირების არაპირდაპირი ვარიანტი მოითხოვს დამატებით რეაგენტებს და დროის ხარჯებს, ეს მეთოდი ჩვეულებრივ აღწევს სიგნალის უფრო მაღალ დონეს ანტისხეულზე ან ავიდინის მოლეკულაზე 3-4 ფტოროქრომის მოლეკულის არსებობის გამო. გარდა ამისა, არაპირდაპირი მარკირების შემთხვევაში შესაძლებელია სიგნალის კასკადური გაძლიერება.

დნმ-ის ნიმუშების შესაქმნელად გამოიყენება კლონირებული დნმ-ის თანმიმდევრობები, გენომიური დნმ, PCR რეაქციის პროდუქტები, მარკირებული ოლიგონუკლეოტიდები და მიკროდისექციის შედეგად მიღებული დნმ.

ზონდის მარკირება შეიძლება განხორციელდეს სხვადასხვა გზით, მაგალითად, ნიკ-ტრანსლაციით ან PCR-ით მარკირებული ნუკლეოტიდებით.

ჰიბრიდიზაციის პროცედურა

ფლუორესცენტური ჰიბრიდიზაციის ექსპერიმენტის სქემა ადგილზებირთვში გენის პოზიციის ლოკალიზაციისთვის

პირველი ნაბიჯი არის ზონდების დიზაინი. ზონდის ზომა უნდა იყოს საკმარისად დიდი იმისთვის, რომ ჰიბრიდიზაცია მოხდეს კონკრეტულ ადგილზე, მაგრამ არც ისე დიდი (არაუმეტეს 1 კბ), რათა ხელი არ შეუშალოს ჰიბრიდიზაციის პროცესს. სპეციფიკური ლოკების იდენტიფიცირებისას ან მთელი ქრომოსომების შეღებვისას, აუცილებელია დნმ-ის ზონდების ჰიბრიდიზაციის დაბლოკვა არაუნიკალური განმეორებადი დნმ-ის თანმიმდევრობით, ჰიბრიდიზაციის ნარევში არალეგირებული დნმ-ის გამეორებების დამატებით (მაგალითად, Cot-1 დნმ). თუ დნმ-ის ზონდი არის ორჯაჭვიანი დნმ, ის უნდა იყოს დენატურირებული ჰიბრიდიზაციამდე.

შემდეგ ეტაპზე მზადდება ინტერფაზური ბირთვების ან მეტაფაზური ქრომოსომების პრეპარატები. უჯრედები ფიქსირდება სუბსტრატზე, ჩვეულებრივ, შუშის სლაიდზე, რასაც მოჰყვება დნმ-ის დენატურაცია. ქრომოსომების ან ბირთვების მორფოლოგიის შესანარჩუნებლად, დენატურაცია ტარდება ფორმამიდის თანდასწრებით, რაც შესაძლებელს ხდის დენატურაციის ტემპერატურის შემცირებას 70°-მდე.

შეკრული დნმ-ის ზონდების ვიზუალიზაცია ხორციელდება ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით. ფლუორესცენტური სიგნალის ინტენსივობა დამოკიდებულია ბევრ ფაქტორზე - ზონდის მარკირების ეფექტურობაზე, ზონდის ტიპზე და ფლუორესცენტური საღებავის ტიპზე.

ლიტერატურა

რუბცოვი ნ.ბ. ძუძუმწოვრების ქრომოსომებთან მუშაობის მეთოდები: პროკ. შემწეობა / Novosib. სახელმწიფო უნ-ტ. Novosibirsk, 2006. 152 გვ.

რუბცოვი ნ.ბ. ნუკლეინის მჟავების ჰიბრიდიზაცია ადგილზექრომოსომული დარღვევების ანალიზში. თავი წიგნში „შესავალი მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში“ ტ.2. „მოლეკულური გენეტიკური მეთოდები მემკვიდრეობითი და ონკოლოგიური დაავადებების დიაგნოსტიკაში“ / რედ. მ.ა. პალცევა, დ.ვ. ზალეტაევი. საგანმანათლებლო ლიტერატურა სამედიცინო უნივერსიტეტების სტუდენტებისთვის. M.: მედიცინა, 2011. T. 2. S. 100–136.

შენიშვნები

ფონდი ვიკიმედია. 2010 წ.

ნახეთ, რა არის "ფლუორესცენტური in situ ჰიბრიდიზაცია" სხვა ლექსიკონებში:

ამ ტერმინს სხვა მნიშვნელობა აქვს, იხილეთ ჰიბრიდიზაცია. დნმ-ის ჰიბრიდიზაცია, ნუკლეინის მჟავების ჰიბრიდიზაცია in vitro დამატებითი ერთჯაჭვიანი ნუკლეინის მჟავების კომბინაცია ერთ მოლეკულად. სრული კომპლემენტარობით ... ... ვიკიპედია

განსაზღვრის მეთოდი fluorescent in situ ჰიბრიდიზაცია.

შესასწავლი მასალა იხილეთ აღწერაში

შესაძლებელია სახლში ვიზიტი

კვლევა გამოიყენება ძუძუს კიბოს ან კუჭის კიბოს ინდივიდუალური დამხმარე ქიმიოთერაპიის შესარჩევად.

ძუძუს კიბო (ძვ. წ.) ქალებში ონკოლოგიურ დაავადებებს შორის პირველ ადგილზეა. სარძევე ჯირკვლის სიმსივნური უჯრედები შეიძლება შეიცავდეს სხვადასხვა ტიპის რეცეპტორებს, რომლებიც მგრძნობიარეა გარკვეული ნივთიერებების მიმართ (ჰორმონები ან სხვა ბიოლოგიურად აქტიური მოლეკულები). ჰორმონის რეცეპტორების (ესტროგენი და პროგესტერონი) ან ადამიანის ეპიდერმული ზრდის ფაქტორის რეცეპტორის ტიპი 2 (ადამიანის ეპიდერმული ზრდის ფაქტორი 2, HER2) არსებობის მიხედვით სიმსივნურ უჯრედებში იზოლირებულია ჰორმონ-რეცეპტორ-დადებითი, HER2-დადებითი და სამჯერ უარყოფითი სარძევე ჯირკვლის კიბო. . ეს მნიშვნელოვანია გასათვალისწინებელი თერაპიის ინდივიდუალური შერჩევისას და მკურნალობის წარმატების პროგნოზირებისთვის.

HER2 არის რეცეპტორი, რომელიც იმყოფება ქსოვილებში და ჩვეულებრივ, მონაწილეობს უჯრედების გაყოფისა და დიფერენციაციის რეგულირებაში. სიმსივნის უჯრედების ზედაპირზე მისი სიჭარბე (ჰიპერექსპრესია) წინასწარ განსაზღვრავს სიმსივნის სწრაფ უკონტროლო ზრდას, მეტასტაზების მაღალ რისკს და ზოგიერთი სახის მკურნალობის დაბალ ეფექტურობას. ძუძუს კიბოს ზოგიერთ ქვეტიპში HER2-ის ჰიპერექსპრესია იწვევს პროლიფერაციისა და ანგიოგენეზის გაზრდას, ასევე აპოპტოზის დისრეგულაციას (უჯრედების გენეტიკურად დაპროგრამებული თვითგანადგურება). ამჟამად, არსებობს წამლები, რომლებიც მიზნად ისახავს HER2 რეცეპტორს. ეს, კერძოდ, არის ჰერცეპტინი (ტრასტუზუმაბი), რომელიც წარმოადგენს მონოკლონურ ანტისხეულს HER2/neu რეცეპტორების წინააღმდეგ.

HER2 ონკოგენის (ErbB-2) გაძლიერება და გადაჭარბებული გამოხატვა მკერდის კარცინომის შედარებით სპეციფიკური მოვლენაა და პრაქტიკულად არ გვხვდება სხვა ლოკალიზაციის სიმსივნეებში. კუჭის კიბო (GC) ერთ-ერთი გამონაკლისია: HER2-ის გააქტიურება აღინიშნება ამ ორგანოს ავთვისებიანი ნეოპლაზმების შემთხვევების დაახლოებით 10-15%-ში და დაკავშირებულია დაავადების აგრესიულ მიმდინარეობასთან. HER2-დადებითი სარძევე ჯირკვლის კიბოს დროს, HER2 რეცეპტორების ჭარბი რაოდენობა შეიძლება იყოს სიმსივნური უჯრედების ზედაპირზე (მოხსენიებული, როგორც HER2 დადებითი ან Hercept დადებითი). ეს ფენომენი შეინიშნება ძუძუს კიბოთი დაავადებული ქალების 15-20%-ში. HER2 სტატუსის შეფასება მნიშვნელოვანია მკურნალობის ტაქტიკის დასადგენად.

ძირითადი სტანდარტიზებული მეთოდები HER2/neu გადაჭარბებული გამოხატვის და/ან HER2/neu გენის ამპლიფიკაციის გამოსავლენად არის იმუნოჰისტოქიმიური (IHC) მეთოდი და fluorescence in situ ჰიბრიდიზაცია (FISH). ორივე კვლევა ტარდება ჰისტოლოგიურ პრეპარატებზე (პარაფინში ჩაშენებული სიმსივნური მასალის მონაკვეთები) პოლიკლონური ანტისხეულების (IHC), ფლუორესცენტური ზონდების (FISH) და სხვადასხვა გამოსახულების სისტემების გამოყენებით.

IHC რეაქციის შედეგების შეფასებისას ექსპრესია მხედველობაში მიიღება მხოლოდ სიმსივნის ინვაზიურ კომპონენტში. რეაქციის შედეგები ფასდება ქულების სკალის გამოყენებით: 0, 1+, 2+, 3+, შემუშავებული ტესტის მწარმოებლის მიერ და დამტკიცებული ექსპერტების მიერ. ჰერცეპტის სტატუსი, შეფასებული, როგორც 0 და 1+, უნდა ჩაითვალოს უარყოფითად - არ არის ცილის გადაჭარბებული გამოხატვა, რაც დაკავშირებულია მისი გენის გაძლიერების არარსებობასთან. ჰერცეპტის სტატუსი, რეიტინგული 3+, დადებითია, ანუ ცილის ჭარბი გამოხატვა არსებობს, რაც შეესაბამება გენის ამპლიფიკაციის არსებობას. ჰერცეპტის სტატუსი 2+ განიხილება განუსაზღვრელი, ანუ იმუნოჰისტოქიმიური რეაქციის საფუძველზე განსაზღვრული ცილის ექსპრესია არ შეიძლება დამაჯერებლად შეფასდეს გენის გაძლიერებაზე, ამიტომ საჭიროა კვლევა, რომელიც პირდაპირ ავლენს ამპლიფიკაციის არსებობას ან არარსებობას. FISH მეთოდი გამოიყენება იმავე ნიმუშის (ბლოკის) მონაკვეთებზე, რომელზეც ჩატარდა იმუნოჰისტოქიმიური კვლევა. FISH ჰიბრიდიზაციისას, HER2 გენის ამპლიფიკაციის არსებობა ფასდება წითელი ფლუორესცენტური (შეესაბამება მარკირებული HER2 გენების) და მწვანე ფლუორესცენტური სიგნალების თანაფარდობის დათვლით, რომლებიც ასახელებენ მე-17 ქრომოსომის ცენტრომერულ რეგიონს. 2-ზე მეტი თანაფარდობა მიუთითებს HER2 გაძლიერების არსებობაზე. FISH მეთოდი უფრო მგრძნობიარეა ვიდრე IHC მეთოდი, რადგან ის საშუალებას გაძლევთ პირდაპირ შეაფასოთ ამპლიფიკაციის არსებობა ან არარსებობა.

მასალა კვლევისთვის: პარაფინის ბლოკი სიმსივნის ბიოფსიით.

ყურადღება! აუცილებლად:

შუშის სლაიდი IHC-შეღებვით HER2/neu-ს ანტისხეულებით
ექიმის მიმართვა ან ამონაწერი ჰისტოლოგიური და IHC კვლევის შედეგებით ანტისხეულებით Her-2/neu-ზე

ლიტერატურა

ზავალიშინა L.E., Frank G.A. HER2 სტატუსის მორფოლოგიური კვლევა. მეთოდოლოგია და ატლასი. - მ.: ედ. მედია მედიკა. 2006:98.
ავთვისებიანი დაავადებები რუსეთში 2011 წელს (ავადობა და სიკვდილიანობა). რედ. და. ჩისოვა, ვ.ვ. სტარინსკი, გ.ვ. პეტროვა. - M.: FGBU "MNIOI მათ. პ.ა. ჰერცენი“ რუსეთის ჯანდაცვის სამინისტროს. 2013:289.
ონკოლოგია. კლინიკური გაიდლაინები. რუსეთის ონკოლოგთა ასოციაცია. რედ. და. ჩისოვა, ს.ლ. დარიალოვა. - მ.: ედ. „GEOTAR-Media“. 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. და სხვ. ტრასტუზუმაბი ქიმიოთერაპიასთან ერთად ქიმიოთერაპიასთან ერთად მარტო HER2-დადებითი კუჭის ან გასტრო-საყლაპავის შეერთების კიბოს (ToGA) სამკურნალოდ: ფაზა 3, ღია, რანდომიზებული კონტროლირებადი კვლევა. ლანცეტი. 2010; 376: 687-697.
დაბს დ.ჯ. დიაგნოსტიკური იმუნოჰისტოქიმია: თერანოსტიკური და გენომიური აპლიკაციები. Elsevier, მე-4 გამოცემა. 2013: 960 წ.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, კიბოს შემთხვევები და სიკვდილიანობა მსოფლიოში: IARC კიბოს ბაზა No. 10. ლიონი, საფრანგეთი: კიბოს კვლევის საერთაშორისო სააგენტო; 2010. ხელმისაწვდომია: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. შეხვედრის მნიშვნელოვანი პუნქტები: საერთაშორისო ექსპერტთა კონსენსუსი ადრეული სარძევე ჯირკვლის კიბოს პირველადი თერაპიის შესახებ 2005 წ. ონკოლოგიის ანალები. 2005; 16 (10): 1569-1583 წ.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. WHO ქალის რეპროდუქციული ორგანოების სიმსივნეების კლასიფიკაცია. ჯანმო პრესა, მე-4 გამოცემა. 2014; 4: 316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. და სხვ. Her2/neu ამპლიფიკაცია არის დამოუკიდებელი პროგნოზული ფაქტორი კუჭის კიბოს დროს. საჭმლის მომნელებელი დაავადებები და მეცნიერებები. 2006; 51 (8): 1371-1379 წ.
Slamon D. და სხვ. ადიუვანტური ტრასტუზუმაბი HER2-დადებითი სარძევე ჯირკვლის კიბოში. New England Journal of Medicine. 2011; 365: 1273-1283.