プログラムされた細胞死。 アレクサンダー・シュティル

検索結果を絞り込むには、検索するフィールドを指定してクエリを絞り込みます。 フィールドのリストは上に示されています。 例えば：

複数のフィールドを同時に検索できます。

論理演算子

デフォルトの演算子は次のとおりです。 そして.
オペレーター そしては、ドキュメントがグループ内のすべての要素と一致する必要があることを意味します。

研究開発

オペレーター またはドキュメントがグループ内のいずれかの値と一致する必要があることを意味します。

勉強 または発達

オペレーター ないこの要素を含むドキュメントは除外されます。

勉強 ない発達

検索タイプ

クエリを作成するときに、フレーズを検索する方法を指定できます。 形態素を考慮した検索、形態素を考慮しない検索、前方一致検索、語句検索の4つの方法に対応しています。
デフォルトでは、検索は形態学を考慮して実行されます。
形態論を使わずに検索するには、フレーズ内の単語の前に「ドル」記号を付けます。

$ 勉強 $ 発達

プレフィックスを検索するには、クエリの後にアスタリスクを置く必要があります。

勉強 *

語句を検索するには、クエリを二重引用符で囲む必要があります。

" 研究開発 "

同義語で検索する

検索結果に単語の同義語を含めるには、ハッシュを入れる必要があります。 # " 単語の前、または括弧内の式の前。
1 つの単語に適用すると、最大 3 つの同義語が見つかります。
括弧内の表現に適用すると、同義語が見つかった場合は各単語に追加されます。
形態素フリー検索、前方一致検索、フレーズ検索には対応していません。

# 勉強

グループ化

検索フレーズをグループ化するには、括弧を使用する必要があります。 これにより、リクエストのブール ロジックを制御できるようになります。
たとえば、著者が Ivanov または Petrov で、タイトルに Research または Development という単語が含まれる文書を検索するというリクエストを行う必要があります。

おおよその単語検索

おおよその検索を行うには、チルダを入れる必要があります。 ~ " はフレーズの単語の末尾にあります。例:

臭素 ~

検索すると「臭素」「ラム」「工業用」などのワードが出てきます。
さらに、編集可能な最大数を 0、1、または 2 に指定できます。次に例を示します。

臭素 ~1

デフォルトでは、2 つの編集が許可されています。

近接性の基準

近接性基準で検索するには、チルダ「」を入力する必要があります。 ~ たとえば、「研究と開発」という単語が 2 単語以内に含まれるドキュメントを検索するには、次のクエリを使用します。

" 研究開発 "~2

表現の関連性

検索内の個々の表現の関連性を変更するには、「」記号を使用します ^ 式の最後に「」が続き、他の式との関係におけるこの式の関連性のレベルが続きます。
レベルが高いほど、表現の関連性が高くなります。
たとえば、次の表現では、「研究」という単語は「開発」という単語よりも 4 倍関連性が高くなります。

勉強 ^4 発達

デフォルトでは、レベルは 1 です。有効な値は正の実数です。

間隔内の検索

フィールドの値が配置される間隔を示すには、境界値を演算子で区切って括弧内に指定する必要があります。 に.
辞書順ソートが実行されます。

このようなクエリでは、Ivanov から始まり Petrov で終わる著者の結果が返されますが、Ivanov と Petrov は結果に含まれません。
範囲に値を含めるには、角括弧を使用します。 値を除外するには、中括弧を使用します。

学位論文の要旨P-糖タンパク質を介した腫瘍細胞の薬剤耐性：緊急形成のメカニズムと克服へのアプローチをテーマとした医学

原稿としては

シュティル・アレクサンダー・アルベルトヴィッチ

P-糖タンパク質を介した腫瘍細胞の薬剤耐性：緊急メカニズムと克服するアプローチ

モスクワ 2003

この研究は、モスクワにあるN・N・ブロヒン・ロシア医学アカデミーにちなんで名付けられた国立機関ロシア腫瘍学研究センターで実施された。

公式対戦相手:

医学博士、A.M.教授 ガリン、

生物科学博士、教授、ロシア連邦名誉科学者 A.N. サーリン

生物科学博士、N.S.教授 セルゲイワ

主導機関: ロシア連邦保健省のロシア医学大学院教育アカデミー。

論文の弁論は、2003 年 12 月 25 日に、次の専門学術評議会 D.001.017.01 の会議で行われます。

RONCにちなんで名付けられました。 N.N.Blokhin ロシア医学アカデミー、住所：115478、モスクワ、カシルスコエ高速道路、24。

この論文は、ロシアがん研究センターの図書館に所蔵されている。 N.N. ブロヒン・ラムズ。

専門学術会議の科学事務局長

医学博士

Yu.V. シシキン

作品の一般的な特徴 トピックの関連性

I. 腫瘍細胞の多剤耐性: 腫瘍学における生物学的メカニズムと重要性。

期待される特性を備えた薬剤を作成する技術の開発など、薬理学は大幅に進歩しているにもかかわらず、腫瘍に対する化学療法の成功は、生体システムの最も重要な特徴である外部環境の変化に応答する能力によって制限されています。 このような弾性の現れの 1 つは、[化学療法で使用される薬剤に対する腫瘍細胞の耐性の発現です。 外部影響に対する細胞の適応の広範な蔓延と長期にわたる持続的な性質は、薬剤耐性の克服がより効果的な薬剤の探索だけではない可能性を示唆しています。細胞が耐性を獲得できない薬剤はおそらく存在しないのです。 さまざまな種類のストレスに対する耐性の生物学的メカニズムを解明することのみが、がん患者の治療効果を高めるために必要な条件である薬剤耐性を克服するための戦略を開発するのに役立ちます。

腫瘍の多剤耐性 (MDR) - さまざまな薬剤の影響に反応して腫瘍細胞が生存能力を維持すること - は、病気の進行の主な理由の 1 つです。腫瘍は、異なる薬剤の組み合わせに関係なく、化学療法に対して非感受性です。薬物。 MDR 現象は長期にわたって安定した性質を持ち、耐性メカニズムは細胞の世代を超えて受け継がれます。 したがって、MDR は腫瘍の進行における重要な要因の 1 つです。

毒素に対する細胞の耐性には主に 2 つのタイプがあります。 プライマリージー 化学療法を受ける前に観察される耐性）は、腫瘍の進行中に防御機構が発現することによるものです。 はい、アクティベーションします

免疫エフェクターに対する耐性を与える抗アポトーシス機構は、薬剤耐性に関連している可能性があります。 ストレスにさらされた細胞では二次（後天的）耐性が発生します。 これらの影響を受ける前は、そのような細胞の駆動機構は発現が不十分であるか、存在しません。 1 つの毒素による治​​療後に生き残った細胞は、多くの物質に対する耐性を獲得します - MDR (Riordan、Ling、1985)。 さらなる選択により、細胞の世代にわたって獲得された表現型が強化されます。

MDR の最も重要なメカニズムは、細胞間環境への物質の排出による細胞内の毒素の蓄積の減少です。 この輸送は、ATP 加水分解のエネルギーにより、原形質膜内在性タンパク質である P 糖タンパク質 (Pgp) によって実行されます (Juliano、Ling、1984)。MDRI および Pgp mRNA の増加が耐性の要因であることが多いことを、多くのデータが示しています。複数の腫瘍タイプを治療に適用する（Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998）。

II. 腫瘍細胞におけるMDRの発生：予防の標的としての生物学的メカニズム

MDRI mRNA の量の増加は、この遺伝子の増幅によるものと考えるのが合理的です。 この MDR メカニズムは、毒素の存在下で生存するために選択された培養細胞株で確認されています (Roninson、1991)。 しかし、ヒト腫瘍を分析した場合、原発腫瘍でも治療後の新生物でもMDRI遺伝子の増幅は検出されませんでした。 臨床的 MDR の考えられる原因は、遺伝子構造が変化していない (コピー数とヌクレオチド配列が保存されている) MDRI と Pgp の過剰発現です。 エピジェネティックな資産！ 表現型。 ヒト腫瘍細胞の培養物では、化学療法薬による 1 回の治療後に MDRI mRNA レベルと Pgp 量の増加が認められました。

化学構造と作用機序が異なります (Chaillon and Erwin、1993)。 ドキソルビシンの術中肺注入開始からすでに２０〜５０分後に肺組織の癌転移におけるＭＯＩ１ ｍＲＮＡの蓄積の証拠が得られた（Abolhoda et al., 1999）。 これらの結果は、実験および臨床状況における MDR のエピジェネティックな活性化の可能性を示唆しています。つまり、腫瘍における MDR1 および Pgp mRNA の増加は、MDR1 遺伝子の増幅なしに起こり得るということです。

このタイプの生物学的調節（表現型の緊急活性化）には、対応する表現型をコードする遺伝子の転写の誘導、および/または移行後の制御（NKの安定化、タンパク質の合成および機能の調節）が含まれます。 MDR にとって、このタイプの調節は、MYR 遺伝子の誘導 (細胞融合およびストレスに応答した耳細胞の比較的急速な耐性の発達) の可能性を意味します。MYR 1 遺伝子の誘導性は、細胞からのシグナル伝達経路の発達を示唆しています。このような経路は、プロテインキナーゼ C KS)、ホスホリパーゼおよび細胞内 Ca2+、マイトジェン活性化ニューロプシナーゼ、核因子カッパ B (NkB) などのストレスを実行するシグナル伝達機構である可能性があります。KYR の調節領域へのシグナル伝達\ 遺伝子と転写産物により、遺伝子圧縮が確実に活性化されます。

MDR 規制の研究には、基本的な実践的な側面もあります。 薬理学的および/または治療的介入を通じてこれらのメカニズムを阻害すると、筋療法中のMDRの発症が防止されます。

Ⅲ． 形成された腫瘍細胞の MDR を克服します。

MYR 遺伝子活性化シグナルをブロックすることで、一次感受性細胞における MDR の形成を防ぐことができるのであれば、

このアプローチは、すでに形成されている抵抗を克服するためには適用できません。 続発性 MDR と戦う伝統的な方法は、細胞増殖抑制剤と組み合わせて Pgp モジュレーターを使用することです (Lehne、2000)。 ただし、Pgp 阻害剤の使用は副作用 (心拍リズム障害、免疫学的不均衡) によって制限されます。 同様に重要なことは、MDR 選択中に少なくとも一部の細胞死メカニズムがブロックされるため、モジュレーターと細胞増殖抑制剤の組み合わせの有効性が低下する可能性があることです。

形成された MDR の克服は、2 つの条件が満たされた場合に達成可能です。1) 薬剤の濃度は、細胞死のエフェクター機構を活性化するのに十分でなければなりません。2) これらの機構の機能は、MDR を有する細胞内で保存されていなければなりません。 薬物が Pgp バリアを克服すれば、最初の条件が満たされます。 ただし、多くの影響に耐性のある細胞の死を活性化するには、薬剤の臨界細胞内濃度を達成するだけで十分であることを証明する必要があります。 耐性細胞内で機能する生存機構は、耐性細胞を排除するための標的として機能するはずである。

2 番目の条件を実行するには、細胞死を誘導するメカニズムとして耐性細胞の溶解を目的としたアプローチが有望であると思われます。 特定のサイトカインのcDNAをトランスフェクトした同系骨髄腫細胞をマウスにワクチン接種すると、免疫動物において細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を介した免疫応答が発生し、接種された腫瘍の拒絶反応が引き起こされる（Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. .、1996）。 CTL はグランザイム B とパーフォリンを使用して細胞を溶解します。 グランザイム B はアポトーシスの遠位エフェクターの 1 つであるカスパーゼ 3 を活性化し、パーフォリンは細胞膜に一次損傷 (壊死) を引き起こすため、近位の死のメカニズムがブロックされれば CTL が効果を発揮することが期待できます。 壊死と組み合わせたアポトーシスの遠位リンクの誘発

プログラムされた細胞死を誘導する抗腫瘍薬に耐性のある細胞の死につながります。

問題の定式化

MDR は臨床的に好ましくない現象であり、これを克服するにはその発生メカニズムと細胞死がどのように起こるかについての知識が必要であり、問​​題の両方の側面を研究する必要があります。 まず、MDR1/Pgp 陰性ヒト細胞における MDR 形成のメカニズムを研究する必要がある；これらのメカニズムの研究は、主に感受性のある細胞における耐性の発現を防ぐのに役立つであろう。 第二に、MDR 細胞内で機能する死のプロセスの分析は、二次 MDR が形成された状況で耐性を克服するための基礎を作成します。

研究の目的は、ヒトの腫瘍細胞におけるリンパ節の緊急形成のメカニズムを確立し、この抵抗の地獄を克服するためのアプローチを開発することです。

1. 化学療法薬およびシグナル伝達機構の実験的アゴニストおよびアンタゴニストの効果に応答した、ヒト腫瘍細胞培養における MDR の発生モデルを最適化する。

2. 細胞を抗腫瘍剤で処理した場合に MDR が緊急に発症する主なメカニズム、つまり MDR 遺伝子の増幅、Pgp 陽性細胞の選択、または MDR の新規誘導を決定します。

3. MDR (プロテインキナーゼ C、ホスホリパーゼ C、細胞内 Ca2+、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、NFkB) の活性化を制御する細胞内シグナル伝達の経路を探索します。

4. 化学療法の効果に応じた MDR の急性発症における MDR 遺伝子発現の転写活性化および転写後制御 (mRNA 安定性) の役割を特定する。

5. 化学療法薬と CR 活性化シグナル伝達経路の遮断薬および遺伝子転写阻害薬を組み合わせることにより、腫瘍細胞における MDR の発症を防ぐ方法を開発する

6. 開始カスプとエフェクターカスプの活性化の動態、ミトコンドリアの膜貫通電位の変化、ポリ(ADP)リボースポリメラーゼのタンパク質分解的切断、ヌクレオソーム間DNA断片化、親細胞およびMDRを有する変異体における治療時の原形質膜の完全性を研究する。 P-糖タンパク質によって輸送されない薬物を使用します。

7. を発現する腫瘍細胞によるワクチン接種を使用する

サイトカインは、MDR 細胞に対する免疫応答を生成します。 »

防御のために提出された条項。

1. Pgp 媒介 MDR の形成 (多くの影響に対する緊急の細胞反応) は、MDR 1 遺伝子のエピジェネティックな活性化によって媒介されます。この活性化は、細胞内シグナル伝達、遺伝子プロモーターの誘導、mRNA の安定化などの多数のメカニズムによるものです。これらのシグナルの阻害剤によって防ぐことができます。

2. Pgp 媒介 MDR の克服は、耐性細胞の原形質膜に対する標的効果と関連している可能性があります。 Pgp は細胞膜の完全性の破壊、つまり壊死から細胞を保護しません。

科学的知識

1. 外因性刺激に対する緊急の細胞反応としての MDR の形成という考えが初めて実証されました。

2. 特異的な薬剤耐性表現型である P£p 媒介 MDR の発生メカニズムが初めて詳細に研究されました。このタンパク質をコードする MYR 1 遺伝子のエピジェネティックな活性化です。

3. MHS 遺伝子の緊急活性化モデルが初めて開発されました。

培養ヒト腫瘍細胞におけるPgp媒介MDRの安定した表現型の獲得を伴う。 1. 抗腫瘍薬に曝露された細胞における MOK 1 遺伝子のシグナル伝達経路、転写活性化のメカニズム、および転写後制御が特定されています。 5. 細胞内シグナル伝達のブロッカーである薬理学的物質のクラスが、腫瘍細胞における RCR 媒介 MDR の形成を防ぐことが初めて明らかになりました。 5. PgP 媒介 MDR を持つ細胞で働く死のメカニズムが初めて研究され、細胞膜の完全性に対する一次損傷を含む、耐性を克服するアプローチが開発されました。

実用的な価値。

1. 化学療法薬に曝露された場合の培養腫瘍細胞における Pgp 媒介 MDR の緊急発生を防ぐ方法の開発。

2. MDR を克服するための改変遺伝子組み換えワクチンの前臨床試験。

仕事の承認。

この論文は、2003年6月30日に、腫瘍細胞遺伝学、細胞遺伝学の部門と、分子遺伝学、ウイルスおよび細胞の癌遺伝子、分子内分泌学、抗腫瘍免疫、生化学薬理学、医学研究、実験診断および生物療法のグループとの合同会議で議論された。腫瘍の。 ロシアがん研究センターの動物学、血液学、化学療法、臨床薬理学、高度な治療法の部門にちなんで命名されました。 N.N.ブロクシャ・ラムズ。

論文の主な資料は以下の会議で発表されました。第 2 回国際シンポジウム「サイロスタティック薬剤耐性」（K ドイツ、1991 年）。 ゴードン会議「化学療法の進歩」（ニューヨーク、ロンドン、米国、1994年）。 「分子毒性学」（コッパーマウンテン、米国、1995年）。 「誘導可能なゲノム応答」(スティーブンソン、米国、1996); 「核酸 - 分子診断と治療の統合」(サンディエゴ、米国、1996); 米国癌研究協会の年次会議（1994～2001年）：第6回および第7回会議「腫瘍学の進歩」（ギリシャ、ヘルソニソス、2001年、2002年）。 「細胞核の構造と機能」（サンクトペテルブルク、2002 年）、および Oncotech, Inc. でのセミナー。 （アーバイン、米国、1996年）、ソーク研究所（ラホーヤ、米国、1997年）、リー・モフィットがんセンター（米国、タンパ、1997年）、ジャクソン・ラボラティ（バーハーバー、米国、1997年）、スローン・ケトゲリングがんセンター、ニューヨーク] アメリカ、1999年）、コペンハーゲン大学（2002年）、インスブルック大学（2002年）、フローニングス大学！ (2003)、モスクワ州立大学。 M.V. Lomonosov (2002)、実験病理学・腫瘍学・放射線生物学研究所にちなんで名付けられました。 R.E. カヴェツキー (キエフ、2002)。

出版物。

論文の構造と範囲。

論文はタイプスクリプト 181 ページで提示され、「文献レビュー」、「研究の材料と方法」、「研究結果」(2 部) の章の導入、考察と結論で構成されています。 この作品には 44 個の図と 6 個の表が含まれています。 書誌事項には 270 の文献情報源へのリンクが含まれています。

研究の材料と方法。

実験動物および細胞株。 Balb/c マウスを使用しました。 MDR 活性化の実験には、ヒト細胞株 H9 (T 細胞白血病)、K562 (前骨髄性白血病)、SW を使用しました。<

(結腸癌)、および毒素に対する耐性について細胞を選択せず​​に Pgp が発現されるサブリニゴ K562Í/S9 も同様です (Mechetner et al., 1997)。 抗腫瘍免疫を作り出す実験には、骨髄腫株 MPC11、J558、および S194 が使用されました。 ＭＤＲを有する亜系統を得るために、ドキソルビシンに対する耐性に関するＭＰＣ１１細胞の段階的選択を実施した。 独立したMPC1サブシステム1Dox10-1およびMPC11Dox10-2は、100nMのドキソルビン酸の存在下で増殖した。

MDR 研究: MDRI 遺伝子 RNA、Pgp の量と機能。

MDRを活性化するために、リガゴシン-1P-アラビノフラノシド（サイトソサル、ARA C）、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ノコダゾール、ブルソマイシン、スフィンゴミエリナーゼ、Ca2+イオノフォアA23187、タプシゴルギン、トリコース、トロコース、トロコース、トロコース、トロコース、トロコース、トロコース、トリコース、 13 -アセテート(TPA)。 MDR の活性化を阻害するには、アクチノマイシン D、α-アマニチン、エクテイナサイジン 743 (ET743)、ケレリトリン、ビス-インドリルマレイミド I、カルフォスチン C、BARTA/AM、TMB-8、ピロリジンドプチオカルバメート (PDTC)、トシル-L-フェニルクロロメチル ケトン ( TPCMK)、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸、PD98095。 阻害剤を 30 分間かけて細胞に添加しました。 活性剤を加える前に。 細胞内のＭＤＲ１ ｍＲＮＡのレベルは、プライマー：ＭＤＲＶを使用した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000）によって研究された。 ストレート: 5"-ССС ATS ATT GCA ATA GCA GG-3"; リバース: 5"-GTT CAA ACT TCT GCT SCT GA-3"。 産物の長さは 167 bp。 p2-ミクログロブリン: 直接: 5"-ASS CCC ACT GAA AAA GAT GA-3"; 逆: 5 インチ-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3"。 産物の長さは 120 bp。

Ｐｇｐの量およびその輸送機能は、独占抗体ＵＩＣ２を用いたフローサイトメトリーによって決定された（Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒら、１９９７）。 フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウスIgG抗体を二次抗体として使用しました。 PGPを教えるために-

依存性輸送、蛍光基質 Pgp-ローダミン 123 (MDR 誘導に関する実験) (Neyfakh, 1988) およびカルセイン アセトキシメチル エステル (骨髄腫細胞を用いた実験) (Holló et al., 1996; Shtü et al., 1999) を使用しました。

細胞死アッセイ。 毒素の存在下での細胞生存は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2P-テトラゾリウムの還元によって研究されました (MTT テスト) (Mossman、1983 ; Sidorova et al.、2002)。 V-FITC 付属はアポトーシス細胞の数を決定するために使用されました。 壊死細胞はヨウ化プロピジウム (PI) で検出されました。 ミトコンドリアの膜貫通電位は、JC-1 プローブの蛍光によって測定されました (Zamzair et al., 1997)。 ゲノム DNA の断片化を確認するために、クエン酸ナトリウム、NP-40、RNase A、および PI を含むバッファーで細胞を溶解しました。 懸濁液をフローサイトメーターで分析した (Shtil et al., 1999; 断片化した DNA がサブ G1 領域で検出された。細胞内の遊離型酸素の形成を研究するために、ジクロロフルオレセイン 二酢酸エステル (DCFDA) が使用されました。細胞質は、細胞内代謝産物による酸化後に蛍光を発します。

サイトゾルおよび粒子画分におけるＰＫＣ活性は、細胞溶解および遠心分離による画分の分離後のミエリン塩基性タンパク質のリン酸化による放射性法によって測定した（Shtil et al. 2000）。

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ ERK1/2 および JNK1 の活性は、細胞溶解およびキナーゼの免疫沈降後の特定の基質 (ミエリン塩基性タンパク質および c-Jun) のリン酸化によって測定されました (et al., 1996)。

レポータープラスミド、発現ベクター、トランスフェクション。

K562細胞およびB\Y620細胞を、MOL 1遺伝子のトロキシマルプロモーターの領域-1202/+118ntを有するプラスミドでトリフェクトした。 転写開始部位と比較して、pOB2b ベクターにクローン化されます。 レポータータンパク質は Pge/1y ルシフェラーゼでした。 NaκBのトランス活性化ナイーブ性を試験するために、細胞を、OTkBの結合部位を含むプロモーター-レポーター構築物(5xNOκB-Igocyferase)でトリフェクトした。 ルシフェラーゼ活性を抑制するために、SIV40 プロモーターの制御下でレンタル ルシフェラーゼを保持するサクミドを細胞に同時に注入しました。 いくつかの実験では、ルシフェラーゼ Pnejly の活性は、トランスフェクトされた細胞内の総 SEL の濃度に関連していました。 トランスフェクションには、スポフェクンシュまたはリポフェクタミン、および「遺伝子銃」(骨髄腫細胞用) を使用しました (Nabillevich et al., 1996)。BU​​40 プロモーターの制御下で p50 および p65 IκB サブユニットを発現するベクターを、寄生虫 - 1202/+118-ルシフェラーゼ セル 1 細胞におけるルシフェラーゼの活性をケモポミネッセンス法によって研究しました。

マウスの免疫化。 MPC11細胞およびMDRを有する亜系を放射線照射（40μr）し、顆粒球マクロファージ塩分刺激因子（GM-CSF）cDNAを保有するプラスミドでトリフェクトし、マウスに皮下注射した（1匹あたり1.5×105歳）。 対照マウスには、インサートのないベクターをトランスフェクトした同数の照射細胞を注射した。 7日後、新鮮な細胞を放射線照射し、インターロイキン-12 (IL-12) DNAを含むプラスミドでトリフェクトするか、またはインサートのないカスミドでトランスフェクトした放射線照射細胞(対照)を使用しました。 さらに 7 日後 (最初のワクチン接種から合計 14 日後)、動物に新鮮な細胞を皮下接種しました (週に 10 回) (Tisher et al., 1998)。

骨髄腫細胞との混合培養におけるCTL活性。 IL-2をトランスフェクトした骨髄腫細胞をマウスに注射してから11日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を37℃、5%で5日間培養しました。

免疫化に使用した系統の新鮮な照射細胞を含む COg。 次いで、新鮮な骨髄腫細胞に 51 Cr (CTL 標的細胞) をロードしました。 CTL活性は、標的とのインキュベーション後の培地へのmSGの放出によって評価した。 パーフォリンプロセシングを阻害するために、脾細胞をコンカナマイシンAとインキュベートし、次に標的とインキュベートした(Kataok et al., 1996)。

研究結果

Pgp 媒介 MDR の緊急活性化。

MDRI mRNA は、抗腫瘍薬の効果に反応して細胞内に蓄積します (Chaudhary および Roninson、1993)。 この効果が Pgp 陽性細胞の選択に関連しているのか、それとも MDR の誘導に関連しているのかを明らかにするために、MES/Pgp 陰性 H9 細胞に対して実験を実施しました。 細胞は、乳がんや血液悪性腫瘍の患者に使用される非Pgp輸送薬であるAra Cで処理されました。 未処理細胞におけるＭＤＲＩの発現は、２５サイクルのＰＣＲ後に検出されないが、Ａｒａ Ｃ処理細胞においては、３〜６時間後にＭＤＲＩ ｍＲＮＡの増加が観察される。 衝撃（図1、A）。 サイトザー濃度が 75 μM に増加すると、わずか 1 時間の曝露後、MDRI mRNA の増加がさらに早く観察されます。 MDRI mRNA の増加は、Ara C への 1 回の曝露に少なくとも 6 週間生存する細胞で持続します。

次に、MDRI mRNAの蓄積と並行してPgpの量が増加するかどうかを調べました。 図では、 図１Ｂは、Ａｒａ Ｃ処理細胞がＰｇｐを発現することを示す。 Ara C への曝露により集団全体の右へのシフトが引き起こされることが重要であり、これは培養中のほとんどすべての細胞が Pgp を蓄積できることを示しています。 Ara C 処理細胞は機能的に活性な Pgp を発現します。これらの細胞では、

ローダミン 123 は、無傷の細胞よりも強力です。 この影響は、Pgp 依存性輸送のブロッカーであるベラパミルによって除去されます。

O 1 3 6 10 16 24 時間。

蛍光 (Ig) -

図1。 Ara C への単回曝露後の MDRX および Pgp mRNA の増加。A: 10 μM Ara C で処理した H9 細胞。MDR1 および p2-ミクログロブリン (B2M) mRNA は、逆転写後の PCR によって測定しました。 B: 10 μM Ara C で 24 時間処理した細胞（無処理）<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых

Pgp によって輸送されない病原体への asy 曝露。 だということだ

この効果の最も可能性の高いメカニズムは、表現型の誘導です。

「既存の」耐性細胞の選択ではありません。

図では、 図 2 は、Pgp によって輸送される化学療法薬であるビンクリスチンの濃度に対する細胞生存の依存性を示しています。 生き残った細胞

米。 2. cptozar への 1 回の曝露により、安定した Pgp 輸送薬物が形成されます。

H9 細胞を 10 μM Ara C で 24 時間処理し、新鮮な培地に再懸濁して 12 日間インキュベートしました。 対数細胞増殖が回復した後、ビンクリスチンに対する細胞の感受性を、サイトサーで処理しなかった細胞（対照）と比較して研究した。 4つの実験結果（MTTテスト）

したがって、Pgp 陰性細胞を非 Pgp 輸送化学療法薬に 1 回曝露すると、1 細胞周期以内に MDRI 遺伝子の mRNA、機能的に適格な Pgp が蓄積され、最も重要なことに、Pgp に対する耐性が発現します。 Pgp 輸送因子: 一次感受性細胞は Pgp 媒介 MDR を獲得します。 この現象のメカニズムは、Pgp 陽性細胞の選択ではなく、de novo 表現型の活性化です。 Pgp を介した形成はどのように起こるのでしょうか? MDR: MDRX 遺伝子転写の活性化または mRNA の安定化により、両方のメカニズムが機能しますか?

図 3 に示す実験では、H9 細胞を Ara C の存在下で処理しました。 転写阻害剤 - アクチノマイシン D、α-アマニチン、エクテイナサイジン 743 (ET743)。 試験したすべての阻害剤は、Ara C によって誘導される MDRI mRNA レベルの増加を防止しました。

米。 3. 転写阻害剤は、MDR1 RNA の蓄積を防ぎます。 H9細胞を10μM Ara Cで24時間処理した。 アクチノマイシン D、α-アマニチン、または ET743 の有無にかかわらず。 3 つの実験の結果がまとめられています。

mRNA の半減期 (安定性) を研究するために、細胞を Ara C で 10 時間処理しました。 新鮮な培地またはアクチノマイシン D を含む培地に移し、さらに 36 時間インキュベートしました。 未処理の細胞では、MDRI mRNA の寿命が短いことが判明し、その半減期は約 30 分でした。 Ara C による処理により、mRNA の半減期が 6 時間に延長されました。 したがって、MDRI mRNA の蓄積、およびその結果としての細胞傷害性ストレスに応答した Pgp 媒介 MDR の発生は、MDR1 転写の活性化だけでなく、この遺伝子の mRNA の安定化によっても引き起こされます。

MDR 活性化における細胞内シグナル伝達のメカニズム 図 4 は、PKC アゴニストである TFA による H9 細胞の単一処理が MDRI 遺伝子の誘導をもたらしたことを示しています。 特定の PKC 阻害剤 (ケレリトリン、カルフォスチン C、ビス-インドリルマレイミド I) は、ホルボール エステルや化学療法による MDR 活性化を防止しました。 似ている

データは、示された PKC 阻害剤の存在下で Ara C、ドキソルビシン、または TFA で処理された K562 細胞で得られました。

米。 4. PKC 阻害剤は MDRI の誘導を防ぎます。 H9細胞を10μM Ara Cで16時間処理した。 PKC阻害剤の有無にかかわらず。 3 つの実験の結果がまとめられています。

要約すると、PKC は MDRI (したがって MJI 表現型) の調節にとって重要です。この遺伝子は PKC アゴニストによって誘導され、PKC 阻害剤は抗がん剤による MDRI の活性化を防ぎます。

PKC の生理学的アゴニストはジアシルグリセロール (DAT) であり、これはホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ C によるホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (PIg) の加水分解中、および/またはホスホリパーゼ C の作用によるホスファチジルコリンの分解中に形成されます。このリン脂質については (Berridge、Irvine、1984)。 Ara C またはドキソルビシンによって誘導される MDRI の活性化は、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ C の阻害剤である硫酸ネオマイシンおよび U73122 によってブロックできます (図 5)。 TFA は直接 PKC アゴニストであり、このキナーゼはホスホリパーゼ C の遠位で機能するため、ホルボール エステルによる MDRI の活性化は硫酸ネオマイシンおよび U73122 に対して非感受性です。

ユスフォリパーゼ C (薬剤 B609) は、MYR 1 の発現に変化を引き起こしませんでした (図 5)。 これらの結果は、MYA 1 の活性化におけるユスファチジルイノセンゴール特異的ホスホリパゾン C の PI2 加水分解の重要性を示しています。

米。 5. MDRIの誘導におけるホスホリパーゼC阻害剤。

H9細胞を10μM Ara Cで16時間処理した。 硫酸ネオマイシン、U73122 または D609 の有無にかかわらず。 3 つの実験の結果がまとめられています。

ホスホリパーゼ C は、PI2 を DAT と FI に分解します。 最初の生成物は PKC を活性化し、2 番目の生成物は外小胞体からの動員により細胞内 Ca2+ レベルを増加させます。 MDRI の誘導における細胞内 Ca2+ の役割は、Ca2+ 特異的イオノフォア A23187 および Ca2+-ATPase 阻害剤であるタプシガルギンがこの遺伝子を活性化する能力によって証明されています。 特異的Ｃａ ２＋ キレーターであるＢＡＲＴＡ／ＡＭは、化学療法とＴＦＡの両方によるＭＤＲＩの誘導を防止した（図６）。

1 2 3 4 5 in 7 8 E 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Rns. b. A) R1の誘導における細胞内Ca2+の役割。

H9 細胞を MOI インデューサーで 16 時間処理しました。 単独またはカルシウムキレート剤 BARTA/AM の存在下で。 トラック: 1-未処理細胞、2,3-A23187; 4.5-

タプシガルギン。 6,7-AgaC; 8,9-ドキソルビシン; 10,11-ブレオマイシン;12,13-2-デオキシ-グルコース;14,15-ノコダゾール;16,17-スフィンゴミエリナーゼ;18,19-TFA。 偶数トラック: 奇数インダクタ (1 を除く): インダクタ -5 µM VARTA/AM。

MDR の活性化における細胞内および細胞外の Ca2+ の関与を明らかにするために、2 つの一連の実験を実施しました。 まず、Ca2+を含まない培地中での細胞インキュベーション条件下で遺伝子活性化を研究した。 細胞外 Ca2+ の除去は、化学療法および TPA による MDRI の活性化を妨げませんでした。 第二に、細胞への Ca2+ の侵入を防ぎ、細胞内 Ca2+ 濃度を変化させない薬剤 TMB-8 は、MDRI の誘導に影響を与えませんでした。 したがって、MDRX の活性化には細胞内カルシウムは必要ですが、細胞外カルシウムは必要ありません。 上記の実験は、化学療法薬を含むさまざまな物質による MDRX 遺伝子の活性化におけるホスホリパーゼ C→DAG-*PKS および PI3→Ca2+ シグナル伝達経路の基本的な役割を証明しています。

ただし、PKC は MDR を活性化するための普遍的なメカニズムではありません。 PKC 活性は、個々の MDRX インデューサーで処理された細胞によって異なります。 T< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).

「表 1. PKC 活性に対する MDRI 遺伝子誘導物質の影響。

治療 PKC 活性、pmol/mg タンパク質/分。

サイトゾル粒子画分

コントロール 119±13 59+9

TFA、YuONM 47+10* 153+14*

Ara C、25 μM 143+16 65+10

セラミド、1 µM 138+15 27+8*

セラミド、YumkM 83+15* 15+7*

*R<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.

PKC阻害剤のチェレリグリンおよびビス-インドール-マレイミドIは、MDR\Ara C、ドセオルビシンおよびTFAの活性化を阻害しましたが、セラミドの活性化は阻害しませんでした（図7）。 したがって、PKC の活性化は MDRX 遺伝子の誘導の前提条件ではありません。 いくつかの薬剤（例えば、ceramvd）は、ACL非依存性シグナル伝達機構を活性化するか、またはACLの遠位で作用する。

米。 7. Ceramnd は、ACL 介入に関係なく、MDR\ をアクティブにします。

H9 細胞を 25 μM C​​2-セラミドで 24 時間処理しました。 単独またはPKC阻害剤の存在下で。 阻害剤の有効性の制御は、10 μM サイトザーに曝露されたときの MDR 活性化の阻害です。

このようなメチャンガムは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼである可能性があります。 ＭＤＲ１を活性化する濃度のドキソルビシンおよびＡｒａ Ｃは、ＪＮＫ１の活性を増加させたが、ＥＲＫ１／２は増加させなかったが、一方、ＴＦＡはＥＲＫ１／２を活性化したが、ＪＮＫ１活性は変化しなかった（図８）。 これらのデータと一致して、ERKI/2 阻害剤 PD98059 は、化学療法ではなく、TFA による MDRI 活性化を無効にしました。 したがって、マイトジェン活性化プロテインキナーゼは、さまざまな物質によって生成される MDR1 活性化シグナルの分岐レベルとして機能します。

ドキソルビシンとTPAによるMAPキナーゼの活性化

米。 8. MDR1 誘導物質による MAP キナーゼの示差的活性化。 H9細胞をドキソルビシンおよびTFAで処理した。 ERK1/2 および JNK1 活性は、免疫沈降および基質のリン酸化後に測定されました。 インデューサーの効果は、活性を 1 に設定した未処理細胞と比較した各キナーゼの活性化レベルとして表されます。3 回の実験からのデータが合計されます。

転写因子 NFkB は、外部刺激に対する細胞の迅速な応答のメカニズムです (Karin、1995)。 休止細胞では、このタンパク質は抑制性サブユニットと複合体を形成して細胞質に存在します。 曝露に応答して、NFkB は複合体から解離し、核内に輸送され、NFkB 結合部位を持つ遺伝子調節領域を活性化します。 NFkB阻害剤であるPDTC、TPCMC、およびサリチル酸は、サイトサール、ドキソルビシン、およびTFAによるMDRX活性化を防止しました（図9）。 臨床で広く使用されている薬剤であるサリチラップが、緊急のMDRI活性化を効果的に阻害することが判明したことは特に重要である。 さらに、サリチル酸ナトリウムは、サイトサーによるMDRXの長期（最長7日間）の活性化をキャンセルし（図10）、これを裏付けた。 MDR活性化のメカニズムとしてのNFkBの重要性。

米。 9. NFkB阻害剤によるMDR1誘導の防止。 H9細胞を10μM Ara C、5μMドキソルビシン、または10nM TFAで16時間処理しました。 単独で、またはNFkB活性化の阻害剤の存在下で。 4つの実験結果をまとめました。

4、洗います

LはS - + +----

サリチル酸 - - + \s 5 7

AGASのない日々

米。 10. MDRI誘導の阻害剤としてのサルシン酸ナトリウムの長期効果。

H9細胞を10μM Ara Cで48時間処理した。 単独で、またはサリチル酸ナトリウムの存在下で、新鮮な培地に再懸濁し、さらに 1 ～ 7 日間インキュベートします。

NκB の役割を確立することの重要性は、この機構が MYR 1 遺伝子の活性化における細胞質と核の現象を「結び付ける」という事実にもあり、この関連性は遺伝子プロモーターの活性化に関する実験によって確認されています。 AYUSH 外因性 No.kV。 OTkV サブユニット p50 および p65 の同時トランスフェクションにより、-1202/+118 nt の領域が活性化されました。 プロモーターAYUSH（図11）。 しかし、示された領域では、NaκB との相互作用のための標準配列 5"-COOIM^YUSS-3" (R-任意のプリン塩基、aL-任意のピリミジン塩基) または相同配列は見つかりませんでした。 以下の仮定が考えられます。 1) NokV は、領域 -1202/+118 i.i. 内のまだ同定されていない配列と相互作用します。 2) NkB は中間遺伝子 (遺伝子) を活性化し、その産物は領域 -1202/+118 nt に結合します。 そしてMDR1プロモーターを誘導します。

米。 11. NFkB - MDR プロモーターの活性化因子。

K562細胞を、示された構築物およびSV40プロモーター下でウミシイタケルシフェラーゼreiを有するプラスミドでトランスフェクトした。 MDRX プロモーターの -1202/+118 nt 領域の誘導を反映するホタル ルシフェラーゼ活性 (ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化された MDF として示されます)。

MDR1 遺伝子プロモーターの制御。

L1活性化シグナルを伝達する経路には、共通の「収束点」、つまり遺伝子とmRNAの調節領域がなければなりません。 MDRIプロモーターを研究するために、我々はクロマチンの物理化学的状態を調節する薬剤、つまり遺伝子転写を直接制御する化学療法薬の代表であるヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンAと酪酸ナトリウムを使用した。 これらの薬剤による MDR 活性化のメカニズムを、クロマチンが直接の標的ではない薬剤である Ara C およびドキソルビシンと比較することが重要です。 トリコスタチン A と酪酸ナトリウムは、H9、K562、SW620 細胞の内因性 MDRX 遺伝子を活性化します。 mRNAの増加（図12、左パネル）は、-1202M18 nt部位から転写されたルシフェラーゼの活性化を伴った。 MDRIプロモーター(図12、右パネル)。

米。 12. ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、内因性 MDRX 遺伝子およびプロモーターを誘導します (一過性トランスフェクション)。

Slash、H9、K562、SW620 細胞を指定の薬剤で 24 時間処理しました。 MDRX mRNA のレベルは GTCR で研究されました。 右: K562 細胞に -1202/+P8 n.o.-ルシフェラーゼ構築物をトランスフェクトしました。 24時間以内に。 細胞を指定の薬剤で 16 時間刺激しました。 ３つの実験の結果を示した。

トリコスタチン A と酪酸は、転写因子 NF-Y と反転 HAAT ボックスとの相互作用により MDRI を活性化することが確立されており (Jin および Scolto、1998)、これは「誘導因子 - クロマチン修飾 -> クロマチンの活性化」という一連の事象を裏付けるものである。 MDRIプロモーターです。」 ただし、ベルトトランスフェクションの条件下では、プラスミド上のクロマチンは「不完全」なままです。

MDRI誘導におけるクロマチンの役割を研究するために、SW620細胞に-1202/+118ntのホタルルシフェラーゼ構築物とneo遺伝子を保有するプラスミドをトランスフェクトしました。 次に、ネオマイシンの存在下で生存する細胞が選択されました。 選択体中および一時的なトランスフェクション中、トリコスタチン A および酪酸ナトリウムは内因性 MDRI mRNA の蓄積を引き起こし、領域 -1202/+118 i.i. からの転写を誘導しました。 この遺伝子のプロモーター。 ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤による MDRI の活性化は、転写ブロッカーである ET743 によって無効になりました。 これは、MDRI mRNA の量の増加と、クロマチンのアセチル化を介したこの遺伝子のプロモーターの活性化との間の直接的な関係を示しています。

これらのデータは、細胞がクロマチンの物理化学的状態を直接変化させる薬剤に曝露されたときに得られました。 すべての化学療法薬 (およびその他の外因性刺激) がクロマチンの直接制御因子であるわけではないので、そのメカニズムは常に特定されているのでしょうか? 我々は、Ara C および TFA で処理した細胞では、MDRI mRNA の半減期が増加することに注目しました。 図 1 は、TFA とトリコスタチン A が MDRI プロモーター活性 (転写) の強力な誘導物質であるのに対し、Ara C、ドキソルビシン、セラミドのいずれもプロモーターを活性化しないか、弱い効果しか引き起こさないことを示しています。

米。 13. MDRIプロモーター誘導に対するMDRアクチベーターの効果。 K562細胞を-1202/+118 ntのホタルルシフェラーゼ構築物でトランスフェクトし、等しい部分に分割し、16時間刺激しました。 指示された薬。

未処理細胞のルシフェラーゼ活性は、細胞溶解物中の総タンパク質含有量に対して正規化して 1 に設定されました。結果は 3 回の実験で再現されました。

これらの結果は、A/III1 mRNA レベルの増加が、転写活性化 (TFA、トリコスタチン A) の結果として、およびプロモーターの直接誘導なし (サイトサール、ドキソルビシン、セラミド) の両方によって起こることを示唆しています。 後者の場合、mRNAの安定化のメカニズム、または中間遺伝子の活性化（その産物がMIEXプロモーターを誘導するか転写物を安定化する）のいずれかを認識する必要があります（外因性NaκBを使った実験を参照）。

表 2. MF1 遺伝子 tsntozprom の緊急活性化を妨げるシグナル伝達機構の阻害剤。

薬剤 細胞内標的 阻害濃度

ケレリトリン PKS 10 μM

カルフォスチン S PKS 1 μM

ビス-インドリル-

マレイミド I PKS 5 μM

VARTA/AM Ca2+ 5 μM

PDTK No.kV 5μM

GFKhMK No.kV 25 μM

サリチル酸ナトリウム No.kV 20 mM

ユティリン №kV 10 mM

ジースターのより高いプラズマ性

脂肪酸膜？ ヤムキロ/ml

1KTSHGOMISHSH B 転写産物の伸長? 500～1000ng/ml

x-アマニチン RNA ポリメラーゼ II 9 μg/ml

zhgeinascischsh 743 がインストールされていません 100 nM

表 2 は、H9 および K562 白血病細胞におけるサイゴサールまたはドキソルビシンによる MDR 活性化を防止するシグナル伝達阻害剤のグループを代表する薬理学的薬物を示しています。

Pgp 媒介 MDR の克服: 細胞膜標的

細胞毒性作用。

したがって、Pgp 媒介 MDR は 1 回の細胞分裂中に非常に迅速に形成され、生き残った細胞の世代にわたって存続します。 さまざまな化学グループの抗腫瘍薬の臨床使用を含め、多くの刺激が MDR を誘発します。 Pgp は、プログラムされた死 (アポプト) の活性化を防ぐメカニズムの特徴です (Johnstone et al., 1999)。したがって、主にアポトーシス誘発性の刺激に耐性があり、治療に反応して急速に MDR を獲得する腫瘍は、治療にとって特別な課題となります。 . 多因性抵抗を克服する戦略は何ですか?

免疫エフェクターの影響下でのそのような細胞の死が研究されています。 このアプローチの前提条件は、マウスのワクチン接種中に蓄積する脾細胞によるワクチン接種された骨髄腫の拒絶反応に関するデータでした。 同じ腫瘍をサイトカインを発現するように改変したものである(Turner et al., 1996)。 MPC1 IDox10-1 および MPC1 1Dox10-2 サブラインの特性が類似していることが判明したため、以下では MPC11Dox10-1 細胞を分析します。

選択株における MDR 表現型は、mdrVo 遺伝子の過剰発現、カルセイン輸送の減少、およびドキソルビシンおよびビンクリスチン、Pgp 基質に対する耐性によって特徴付けられました。 ミエロール接種に対する免疫を作り出すために、MPC11およびMPCI IDox10-1細胞にGM-KS IL-12サイトカインのcDNAをトランスフェクトした。 接種された細胞の数は、最小 100% 腫瘍殺傷用量の 5 倍でした。

表 3. 対照群および対照群における腫瘍拒絶率

免疫化された動物。

マウスの移植

MPC11 MPCllDoxlO-1

無傷 0/15* 0/10

MPC11細胞による免疫:

照射細胞 1/15 0/10

■M-CSF/IL-12導入細胞 15/15** 9/10**

MPC1 Xox10-1 細胞による免疫化:

照射された細胞 0/15 0/10

「M-CSF/IL-12 トランスフェクト細胞 9/10** 10/10**

腫瘍拒絶率：分子は腫瘍を発症しなかったマウスの数。 1 置換 - ワクチン接種されたマウスの総数、**P<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.

表３は、ＭＰＣ１１およびＭＰＣ１ ＩＤｏｘ１０細胞が腫瘍を生成することを示している：非免疫動物の１００％において、対応する細胞の接種後８〜１０日で腫瘍が出現した。 しかし、サイトカイン発現細胞で免疫したマウスでは、腫瘍は出現しないか（MPC11によるワクチン接種）、またはまれでした（耐性亜株によるワクチン接種）。 抗腫瘍免疫は長期間持続し、新鮮な細胞の接種後 5 週間以内に腫瘍は出現しませんでした。 移植片拒絶反応の発生率は、MPC 11 細胞で免疫した群と耐性亜系統の間で同様でした。 これらの結果は、生体内実験で検出された因子に曝露された場合、悪性耐性細胞が死滅する可能性を示しています。

このような因子は、細胞溶解性発現細胞による免疫化に応答して脾臓で生成されるCTLである。 図では、 図１４は、ＧＭ−ＣＳＦ発現およびＩＬ−１２発現ＭＰＣ１１細胞で免疫化したマウスからの脾細胞が、ほぼ同一の効率でＭＰＣ１１およびＭＰＣ１１Ｄｏｘ１０−１標的細胞を溶解したことを示す（図１４）。

-er-MPCU/MPCJlDoilO

MRS11/MRSI

エフェクター.ターゲット

米。 14. 親細胞およびPgp陽性細胞のCTL溶解。

分子: 免疫化する細胞、分母: 移植される細胞。

その結果、サイトカイン発現細胞ワクチンをワクチン接種された動物における抗腫瘍免疫は、CTL の論理的作用に対する MDR 細胞の感受性と関連しています。

CTLの殺傷活性は、これらの細胞によるCD95/Fasリガンドおよび/またはグランザイムB-パーフォリンタンデムの分泌によるものである(Vetke、1994)。 研究対象のシステムでこれらのメカニズムのどちらが機能するかという問題を解決するために、Fas リガンドの存在下で細胞の生存を研究したところ、MPC11 細胞および MPC1 ShoxY-1 細胞は、比較的高濃度の Fas リガンドに対しても耐性があることが判明しました。 したがって、グランザイム B/パーフォリンは、免疫性 UTJ の細胞傷害作用の候補メカニズムと考えられるべきです。 実際、パーフォリンプロセシングの阻害剤であるコンカナマイシンAとの免疫CTLのプレインキュベーションは、標的細胞MPC11Dox10-1の溶解を減少させた(図15)。

MDRを克服する方法を見つけるためには、MJBを有する亜系統が、パーフォリンによる原形質膜の完全性の破壊による細胞毒性効果に対する感受性を保持していることが重要である。 パーフォリンによって形成された原形質膜の細孔を通ってグランザイム B が細胞内に浸透すると、エフェグリン カスパーゼが活性化されます。 ダックスフント

キラータンデム（外膜に細孔を形成する薬剤とプロテアーゼの同時作用）により、さまざまな外部影響に耐性のある細胞を死滅させることが可能になります。 したがって、原形質膜は、耐性細胞の排除を目的とした治療の重要なターゲットです。

T; k) o o o

ン（オンニィ）オーオー

エフェクター:ターゲット

米。 15. Granznm B/psrforin - CTL媒介死のメカニズム。 コンカナマイシン A (白抜きバー) は、MPC1 XoxI-1 細胞の CTL 媒介溶解を減少させます。 濃い色のカラムは、コンカナマイシン A とのプレインキュベーションを行わない CTL 標的の溶解を示します。3 つの代表的な実験のうちの 1 つを示します。

MDR を克服するためのゼルシードとフリー酸素ラジカル。 原形質膜が望ましいターゲットである場合、どのようにしてその損傷を引き起こすのでしょうか? このような効果が、多くの抗癌剤に共通の作用物質によって発揮されることが特に望ましい。 これらの「仲介者」の 1 つが ceramvd です。 セラミドが MDR のトレオドール化に効果的であるためには、少なくとも 2 つの要件を満たさなければなりません: ;) Pgp によって細胞外に輸送されないこと。 2) 耐性細胞で機能する死経路を誘発します。 多くの影響に耐性のある細胞を死滅させるには、MDR の主要なメカニズムである膜トランスポーターを「バイパス」するだけで十分でしょうか?

セラミドは P-gピコタンパク質によって輸送されません。

セラミドはさまざまな化学療法薬に反応して蓄積するため、この代謝物がこれらの条件を満たすかどうかを調べました。 親細胞であるK562細胞とそのPgp陽性サブラインK5621/89におけるセラミド蓄積の動態はほぼ同じであることが判明した(図16)。 同時に、K562^B9細胞は、K562細胞よりも有意に少ないローダミン123を蓄積した(Pgp媒介輸送の制御)。 したがって、セラミドは Pgp の輸送基質ではありません。

8000 6000 4000 2000 0

0 0.05 0.2 1 5 C5-BOO!RU-セラミド

米。 16. Pgp は短鎖セラミドを輸送しません。 K562 細胞と K5621/59 細胞を 30 分間インキュベートしました。 蛍光色素 VSY1RU (上のパネル) またはローダミン (III)123 (下のパネル) と結合した C5 セラミドを使用します。 細胞の発光はフローサイトメトリーを使用して研究されました。 3 つの実験からのデータ。

K562 細胞と K5621/89 細胞、およびそのペアについては、合成 (C2) セラミドと天然 (Ci) セラミドの細胞毒性に差はありませんでした。

親細胞および選択細胞: MCP-7 および MCP-7Ac1g、KV-3-1 および KV-8-5-11。 したがって、セラミドは同じ効率で Pgp 陰性細胞と Pgp 陽性細胞の死を引き起こします。

細胞膜の完全性の破壊を防ぐことはできません。

セラミドの影響下での K5621/59 細胞の死のメカニズムを特定するために、次のパラメーターが研究されました: カスパーゼ 9 および 3 の活性化、ポリ ADP リボース ポリメラーゼ (PAKP) の切断、ヌクレオソーム間 DNA 分解、ホスファチジルセリンの膜内移行（アネキシン V 結合による）、膜貫通ミトコンドリア電位および原形質膜の完全性（細胞への PI の取り込みによる）。 図では、 17 は 24 時間ごとにそれを示しています。 セラミドに曝露すると、死滅する細胞の割合は 37+4% に達しました。 特に重要なのは、「二重陽性」(アネキシン-PI4) 細胞の出現でした。これは、K562LB9 細胞において、セラミドが非常に早い段階で細胞膜の透過性の破壊 (壊死または後期アポトーシス) を引き起こすことを意味します。 同時に、古典的なアポトーシスの特徴であるカスパーゼ 3 の活性化は検出されませんでした。 PAS のタンパク質分解は遅い事象であることが判明しました (48 時間の曝露)。

K5621/B9 細胞に対するセラミドの効果は、ミトコンドリアの膜内外電位差の変化を実質的に伴わなかった。死にかけた細胞におけるこの指標は、未処理細胞の対応する値と異ならなかった。 ヌクレオソーム間 DNA 断片化も死の主要な兆候ではありませんでした。サブ 01 領域 (低二倍体細胞) で発生した事象はわずか約 11% でしたが、死亡細胞の割合 (アネキシン +/PI、アネキシン 7PI+ および二重陽性の合計) は、同じ期間の曝露は 64 + 4% でした。したがって、セラミドの影響下での K562LB9 細胞死の最も重要な兆候は、細胞膜の完全性の早期違反、つまり壊死です。

セラミド使用時間（時間）

■ K562,アネキシン+ □ K562,アネキシン+PI+ BK562i/S9,nH+

IK562.PI+ V K562i/S9,AHHeKCHH+ ■ K562|789,アネキシン+PI+

米。 17. セラミドの影響下でのK562およびK562L/S9細胞の死の指標。 細胞を 25 μM C​​2 セラミドで指定の期間処理し、V 陽性、ヨウ化プロピジウム (PI+) 陽性、および「二重陽性」(アネキシン + PI+) 細胞の併合の割合をフローサイトメトリーで測定しました。

K562細胞では、p53は機能せず、キメラプロテインキナーゼBr/Ab1が発現します。 これらの細胞には、アポトーシスに対する耐性の分子決定因子が含まれています。 したがって、K562i/S9 サブラインは、Pgp がメカニズムの 1 つである多面的抵抗性のモデルと考えることができます。 セラミドが死を引き起こす能力に関するデータはさらに重要です。 そのような細胞は壊死のメカニズムによって破壊されます。

壊死を引き起こす可能性のある代謝産物は、フリー酸素ラジカルである可能性があります。 K562/iS9 細胞のセラミド誘導性死におけるセラミドの役割を確立するために、酸素ラジカルキレート剤である N アセチルシステイン (NAC) の存在下でのセラミドの細胞毒性と、N アセチルシステイン (NAC) で処理された細胞における酸素ラジカルの形成速度が研究されました。セラミドについて調べてみました。 b 図18は、NACがセラミドの細胞毒性を消失させたことを示しています。 したがって、遊離酸素は、セラミドにさらされたときの耐性細胞の死滅において決定的な役割を果たします。 図 19 は依存関係を示しています

セラミドの作用時間に応じたOCPOAを負荷した細胞の蛍光

「制御剤 - 過酸化水素、O2 供与体」 H2O2 が急速に引き起こした

20分後も同様。 - 細胞の蛍光の増加。 セラミドによるもの

逆効果：15分後。 影響は1.5倍と鋭いことが観察されました。

行 - グローの減少。 24時間までに限ります。 処理強度

細胞の蛍光がこのインジケーターのレベルに戻った

処理された細胞は 48 ～ 72 時間増加しました。 金額が影響する場合

すでに多くの細胞が成長しています (図 17)。 したがって、加工されたものでは、

ラミド細胞は最初に還元を受け、その後酸化を受けます

おそらく子宮細胞基質の修復のための資源の枯渇の結果として、後に起こります。

図18。 NAC は K562i/S9 細胞死をブロックします。 細胞を、5 mM NACの有無にかかわらず、Cr-セラミドで処理しました。 NAC単独では細胞生存率に影響はありませんでした。

米。 19. セラミドの影響下での K562|/89 細胞の酸化。 細胞を25μM C2-セラミドで指定の時間間隔で処理しました。 細胞内酸化は、E>SGOAを負荷した細胞の蛍光の変化によって研究されました。 H2Og は「酸素爆発」の対照として使用されました。 3 つの実験の結果がまとめられています。

結果についての議論

MOI1 遺伝子の活性化機構を分析すると、次のことが言えます。 1) AUM 遺伝子と MDR 表現型は、細胞を多くの物質に短期間曝露することによって誘導されます。 終了後に生き残った細胞では、MBJ\の過剰発現とPgpの蓄積が検出されます。 生体異物の影響。 したがって、MYR\遺伝子のエピジェネティックな活性化により、安定したMDR表現型が提供されます。

2) MDR の緊急形成は、一般的な細胞シグナル伝達機構によって制御されます。 実際、ホスホリパーゼの活性化、細胞内 Ca2+ の動員、NaκB の誘導、およびストレス活性化プロテインキナーゼのカスケードは、ストレスに対する細胞応答を確実にするメカニズムです。 さらに、転写因子と機能活性部位は、

MDR の活性化に重要な MDR1 遺伝子の ipoMOTope は、この遺伝子に特有のものではありません。 ■ JF-Y、CCAAT ボックス、およびクロマチン調節シグナルは、ほとんどの真核生物遺伝子の転写制御に重要です。 これは明らかに、MDRX 遺伝子の高い誘導性を説明しています。この遺伝子は、さまざまな組織形成の細胞において足の刺激によって活性化されます。 同様に、一般的なストレス実行機構による MDRX の制御は、外因性の影響に対する細胞の他の応答とともに、MDR 活性化の生物学的重要性を強調します。

3) MDR shs.20) の活性化メカニズムの多重性と互換性は、この表現型の制御の多レベルの性質によって決定されます。 そして、これらの各レベルは、細胞に MDR を活性化するかどうかを「選択」する機会を与えます。 まず、選択は刺激の性質によって決まります (異なる昆虫は異なるメカニズムを通じて作用します)。 第 2 に、特定のメカニズムは、このタイプのネットワークにおける特定のシグナル伝達分子の存在とその相互作用に依存し、第 3 に、選択は実際の転写メカニズム (DRI プロモーター領域のクロマチンの状態) のレベルで行われます。 、MDRXでの高い誘導性の理由（シグナル伝達と転写機構の幅広い互換性と重複により、多くの刺激によるさまざまな種類の細胞での誘導が確実に行われます）、誘導の欠如のケースはすべての刺激によって誘導されるわけではなく、すべての実験で誘導されるわけではありません。システム）。

MDRX 遺伝子の緊急活性化のスキーム (サイトサールと TFA の例を使用) を図 20 に示します。

トロ MDRX の誘導に必要なタンパク質の活性化が最初に関与する遅延事象としての MDRX 誘導の概念は、MDR のエピジェネティックな活性化の状況をさらに複雑にします。<ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,

化学療法とTPAによるMY1の調節

ネオマイシン、1173122

転写の活性化、mRNAの安定化

米。 20. MY1遺伝子の緊急活性化のメカニズム。

転写速度を強化または維持する。 細胞が直接的（中間遺伝子の活性化なし）および/または他の遺伝子の誘導を介してMDRを誘導するさまざまな方法を選択する可能性があるため、MDRの発症を防ぐことはさらに困難になります。

遺伝子L)/?の転写の活性化 MDR の開発メカニズムは 1 だけではありません。 エピジェネティック制御のもう 1 つの重要な要素は MOK 1 nRNA の安定化である可能性があり、転写誘導と MOK 1 mRNA の安定化のバランスに関連して、さまざまな誘導因子の影響下および異なる細胞における MDR 活性化のメカニズムが変化する可能性があります。種類も違います。 この仮定は、MyACh遺伝子の発現の多段階調節の概念と一致する(図19)。

４）ＭＤＲの標的予防は、Ｍ）Ｌ１活性化シグナルの伝達機構を確立することによって可能である。 臨床における MDR の発症を防ぐ必要性は、MDR の発症と薬剤の細胞毒性との関係によって確認されます。 実際、毒素で処理された細胞における mRNA/εγ1 のレベルは、毒素の濃度が増加するにつれて増加します。 その結果、（治療の有効性を高めるために正当化された）高用量の化学療法レジメンの使用は、生存細胞での MDR の発症につながる可能性があります。 腫瘍を完全に吸収するために必要な薬剤の濃度は患者が許容できる濃度よりも高くなる可能性があり、これが化学療法における用量漸増の限界を決定します。 上記で同定された細胞内シグナル伝達アンタゴニストは、従来の抗がん剤と組み合わせて使用​​される将来の薬剤 MDR ブロッカーのプロトタイプとして機能する可能性があります。 したがって、MDR の緊急の発症を防ぐことにより、この臨床的に好ましくない現象を克服できる可能性が広がります。

確立されたMDRを克服するためのアプローチは何ですか? 耐性細胞の「脆弱な」標的の 1 つは細胞膜である可能性があります。 その完全性の違反は、耐性細胞の死を引き起こします。Pgp は、壊死を誘発する影響による細胞死を防ぎません。 治療上重要な細胞構造が特定されており、標的とすべきである。 明らかに、単なる膜溶解剤は、非腫瘍組織を含む組織に対する毒性が制御されていないため、不適切である。 Pgp バリアを克服し、細胞膜に損傷を与える薬剤を見つける必要があります。 この条件を満たす物質は、抗腫瘍薬を含む多くの刺激に反応して細胞内に蓄積するスフィンゴ脂質であるセラミドである可能性があります。 セラミドは Pgp によって輸送されないため、耐性細胞内のこの代謝産物の濃度が死を誘発するのに十分であることが保証されます。

耐性細胞に対するセラミドの毒性は、これらの細胞におけるセラミド蓄積の遠位にあるシグナル伝達経路が、Pgp または MDR 選択に関連する他の機構によってブロックされないことを意味します。 したがって、耐性を克服するには、耐性細胞にセラミド（および場合によっては他の有毒な代謝物）を蓄積する方法を見つける必要があります。 セラミドの細胞毒性には、カベオラまたはその類似体、つまりリン脂質とタンパク質が豊富な膜下層が必要であり、MDR の選択中に蓄積されます (La\ et al., 1998)。 重要なのは、MDR の選択には、抗がん療法の細胞分子標的の増加が伴う可能性があることです。

遊離型の酸素は、セラミド誘発性の死の重要なメカニズムであると考えられます。 これは、MDR 細胞の生存におけるミトコンドリアの重要性に関する疑問を引き起こします。 ミトコンドリア経路

エフェクターカスパーゼを活性化するために追加のシグナルを送信します。 ■リトコンドリアの「ループ」は、そのようなシグナルの増強における強力な要因である;「ミトコンドリアの電位の低下、特に血漿中へのチトクロムCの放出は、死の過程の不可逆性を保証する。」 耐性の選択がいずれかの死経路の不活化に関連するかどうかを予測することは不可能であるため、MDR 細胞では「信頼できる」カスケードのみが機能し続けることが重要です。

我々の結果は、Pgp媒介MDRを有する細胞株における酸素アジカルに対する感受性を示している。 一次耐性と薬剤耐性の選択は多くのメカニズムによって決定されますが、細胞内酸化を増加させることによって多因子耐性を克服することは依然として可能であると想定できます。 遊離酸素はすぐにさまざまな酸化反応を起こし、細胞の生命にとって重要な構造である DNA や膜に損傷を与えます。 上記の実験では、酸素ラジカルにさらされた場合、壊死が白化の主要な方法であることが判明しました。 それは、壊死が遊離型の酸素によって誘発される死の唯一の方法であるという意味ではありません。 特定の状況では、このタイプの死または別のタイプの死が優勢であることが確立される必要があります。 アポトーシスと壊死の標準的な区別は、死のさまざまなメカニズムを特徴付けるものではありません。 この評価は、膜への損傷が初期のものなのか、それともこのプロセスが遅れているのかを判断するのに役立ちます。 しかしながら、いかなる状況においても原形質膜の透過性を評価することが重要であると考えられる: 膜の完全性の侵害は不可逆性を引き起こす. したがって、Pgp は細胞を病原体から保護できるため、死の壊死要素は MDR 細胞の生成にとって重要であるアポトーシスを誘導する物質ではなく、アポトーシスを誘導し、壊死を引き起こします。

最後の状況は驚くべきことではありません。 細胞膜のこのタンパク質が機能するには、その完全性により、特定の物理化学的状態が必要です。 壊死が起こると、主に水とイオンの輸送の中断により、細胞に深刻な損傷が発生します。 これらの損傷は、基質の連続的な切断で発現されるアポトーシス カスケードとは対照的に、ほぼすべての細胞構造に影響を及ぼします。アポトーシス カスケードは、細胞内での多成分タンパク質 - 脂質複合体の形成と相互作用の厳密な特異性を伴うエネルギー依存的なプロセスです。カスパーゼと基質の関係。 このようなカスケードの 1 つ以上のリンクを遮断すると (たとえば、MNA MS の細胞における脂質輸送障害の結果、「正しく」局在化されたシグナル伝達複合体が形成されない)、基礎となる機構へのシグナル伝達が中断され、その結果、細胞がまた、この理由から、MDR と戦うためには、死のメカニズムが複数であり、カスパーゼだけでなく、他のプロテアーゼファミリー (リソソーム、プロテアソーム、核) の活性化が含まれることが望ましい。シグナルの増強（ミトコンドリア経路）や細胞膜の透過性の破壊も同様です。 耐性細胞においてより多くの死メカニズムを活性化できるほど、MDR を克服する最終結果の信頼性が高まります。

1. MYR\ 遺伝子と P 糖タンパク質媒介 MDR 表現型は、MN 細胞への 1 回の短期曝露によって誘導され得る< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в

曝露後に生き残った細胞の数。 MOT におけるエピジェネティックな活性化により、安定した MDR 表現型が生成されます。

2) MDR の緊急形成は、ER1 遺伝子の発現の活性化、つまり転写の誘導と mRNA の安定化によって確実に行われます。

3) MDR の活性化には、ストレスに対する細胞の応答の一般的なメカソーム、つまりスファチジルイノシトール経路、プロテインキナーゼ C、細胞内 2+ の動員、NaκB の活性化、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、およびクロマチンの物理的状態の制御が関与します。 これらのメカニズムを阻害すると、これらの腫瘍薬による治療を生き延びた細胞における MDR の発症が防止されます。

4) PgP バリアを克服し、MDR を有する細胞で機能する細胞死メカニズムを誘導することは、そのような細胞を破壊するための必要十分条件です。

5) 個々の Pgp および全体としての MDR 表現型は、卵膜の完全性の一次違反を引き起こす影響下での pgp の生存を保証しません。 したがって、原形質膜は急性の標的であり、壊死の誘発は動脈抵抗を克服するための戦略の 1 つです。

6) 酵素膜の完全性の侵害 (穿孔媒介溶解) によって引き起こされる MDR を有する細胞の死は、サイトカインを発現するように修飾された胆汁細胞による免疫化に応答して生成される聴毒性 T リンパ球によって引き起こされます。

7) 酵素膜を損傷し、MDR を伴う細胞死を引き起こす可能性がある細胞内代謝産物は、遊離酸素分子です。 抗腫瘍ガラートの影響下でのそれらの生成は、MDR を克服するための効果的なメカニズムです。

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州立科学研究センターのコピー機器サービスにちなんで名付けられました。 H.H. Blokhin RAMS 出版のために署名 14 。 II.03 注文番号 24"/。発行部数 100 部。

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480こする。 | 150UAH | $7.5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> 論文、 - 480 ルーブル、配達は 1 ～ 3 時間、10 時から 19 時 (モスクワ時間)、日曜日を除く

シュティル、アレクサンダー・アルベルトヴィッチ。 P-糖タンパク質を介した腫瘍細胞の薬剤耐性：緊急形成のメカニズムと克服へのアプローチ：論文の要約。 ... 医学博士: 14.00.14.- モスクワ、2003.- 46 ページ: 病気。

作品紹介

トピックの関連性

I. 腫瘍細胞の多剤耐性:

腫瘍学における生物学的メカニズムと重要性。

期待される特性を備えた薬剤を作成する技術の開発など、薬理学は大幅に進歩しているにもかかわらず、腫瘍に対する化学療法の成功は、生体システムの最も重要な特徴である外部環境の変化に応答する能力によって制限されています。 このような卑劣さの現れの 1 つは、[化学療法で使用される薬剤に対する腫瘍細胞の耐性の発現です。 外部影響に対する細胞の適応の広範囲な分布と長期にわたる持続的な性質は、薬剤耐性の克服がより効果的な薬剤の探索だけではない可能性を示唆しています。細胞が耐性を獲得できない薬剤はおそらく存在しないのです。 さまざまな種類のストレスに対する耐性の非論理的メカニズムの解明のみが、がん患者の治療効果を高めるための必要条件である薬剤耐性を克服するための戦略開発の基礎となるでしょう。

新生物の多剤耐性（MDR）、つまりさまざまな薬剤の効果に反応した腫瘍細胞の生存能力の維持は、進行の主な理由の 1 つです。 疾患: 使用される薬剤の組み合わせに関係なく、腫瘍は化学療法に対して非感受性です。 MDR 現象は長期にわたって安定した性質を持ち、耐性メカニズムは細胞の世代を超えて受け継がれます。 したがって、MDR は腫瘍の進行における重要な要因の 1 つです。

毒素に対する細胞の耐性には主に 2 つのタイプがあります。 プライマリージー 化学療法薬への曝露前に観察される耐性は、腫瘍進行中の防御機構の発現によるものです。 はい、アクティベーションします

免疫エフェクターに対する耐性を与える抗アポトーシス機構は、薬剤耐性に関連している可能性があります。 ストレスにさらされた細胞では二次（後天的）耐性が発生します。 これらの効果が起こる前は、そのような細胞の保護機構は発現が不十分であるか、存在しません。 1 つの毒素による治​​療後に生き残った細胞は、多くの物質に対する耐性を獲得します - MDR (Riordan、Ling、1985)。 さらなる選択により、細胞の世代にわたって獲得された表現型が強化されます。

MDR の最も重要なメカニズムは、細胞間環境への物質の排出による細胞内の毒素の蓄積の減少です。 このような輸送は、ATP 加水分解のエネルギーにより、原形質膜内在性タンパク質 P 糖タンパク質 (Pgp) によって行われます (Juliano、Ling、1984)。ヒト Pgp は遺伝子によってコードされています。 MDRI(多剤耐性 1)、染色体 7 に局在します (Chen et al., 1986)。 多くのデータは、mRNA の増加を示しています。 MDRIそしてＰｇｐは、多くの場合、複数の腫瘍タイプの治療に対する抵抗性の要因として機能する（Ｌｉｎｎら、１９９５；Ｓｔａｖｒｏｖｓｋａｙａら、１９９８）。

II. 腫瘍細胞におけるMDRの発生：生物学的 ターゲットとしてのメカニズムのために 防止

mRNAの量が増加すると考えるのが合理的です。 MDRIこの遺伝子の増幅によって引き起こされます。 この MDR メカニズムは、毒素の存在下で生存するために選択された培養細胞株で確認されています (Roninson、1991)。 ただし、ヒトの腫瘍を分析する場合、遺伝子増幅は MDR1原発腫瘍でも治療後の新生物でも検出されませんでした。 臨床的 MDR の原因として考えられるのは過剰発現です MDRI遺伝子構造が変化していない（コピー数とヌクレオチド配列が保存されている）Pgp、すなわち 表現型のエピジェネティックな活性。 ヒト腫瘍細胞の培養では、mRNA レベルの増加 MDRIおよび化学療法の 1 回の治療中に記録された Pgp の量

化学構造と作用機序が異なります (Chaudhary、Aninson、1993)。 mRNA蓄積の証拠が得られている MDR\ドキソルビシンの術中肺注入開始からすでに 20 ～ 50 分後に肺組織への癌の転移がみられる (Abolhoda et al., 1999)。 これらの結果（実験およびその他の状況における MDR のエピジェネティックな活性化の可能性を確認：mRNA の増加） MDR\腫瘍内の Pgp は遺伝子増幅なしで発生する可能性があります MDRI。

このタイプの生物学的調節（表現型の緊急活性化）には、対応する表現型をコードする遺伝子の転写の誘導、および/または転写後の制御（NKの安定化、タンパク質の合成と機能の調節）が含まれます。 MDR にとって、この種の規制は遺伝子誘導の可能性を意味します。 MDR\細胞刺激と、ストレスに応答したr/コレステロール細胞の比較的急速な耐性の発達。 遺伝子誘導性 MDRI細胞周縁部から核までのシグナル伝達経路の発達を示唆しています。 このような経路には、プロテインキナーゼ C (ІКС)、ホスホリパーゼおよび細胞内 Ca 2+、マイトジェン活性化尿キナーゼ、核因子カッパ B (NFkB) などのストレスをもたらすシグナル伝達機構が含まれる可能性があります。 遺伝子の調節領域へのシグナル伝達 MDRIそして転写物は遺伝子圧縮の活性化を確実にします。

MDR 規制の研究には、基本的な実践的な側面もあります。 薬理学的および/または遺伝的影響を使用してこれらのメカニズムを阻害すると、その過程での MDR の発症が防止されます [myteragash.

Ⅲ． 形成された腫瘍細胞の MDR を克服します。

活性化遺伝子をブロックする場合 MDR\シグナルは一次感覚細胞における MDR の形成を防ぐことができます。

このアプローチは、すでに形成されている抵抗を克服するためには適用できません。 続発性 MDR と戦う伝統的な方法は、細胞増殖抑制剤と組み合わせて Pgp モジュレーターを使用することです (Lehne、2000)。 ただし、Pgp 阻害剤の使用は副作用 (心拍リズム障害、免疫学的不均衡) によって制限されます。 同様に重要なことは、MDR の選択中に少なくとも一部の細胞死機構が遮断されるため、モジュレーターとホルモン静的な組み合わせの有効性が低下する可能性があることです。

形成された MDR の克服は、2 つの条件が満たされた場合に達成可能です。1) 薬剤の濃度は、細胞死のエフェクター機構を活性化するのに十分でなければなりません。2) これらの機構の機能は、MDR を有する細胞内で保存されていなければなりません。 薬物が Pgp バリアを克服すれば、最初の条件が満たされます。 ただし、多くの影響に耐性のある細胞の死を活性化するには、薬剤の臨界細胞内濃度を達成するだけで十分であることを証明する必要があります。 耐性細胞内で機能する生存機構は、耐性細胞を排除するための標的として機能するはずである。

2 番目の条件を実行するには、細胞死を誘導するメカニズムとして耐性細胞の溶解を目的としたアプローチが有望であると思われます。 特定のサイトカインのcDNAをトランスフェクトした同系骨髄腫細胞をマウスにワクチン接種すると、免疫動物において細胞傷害性Tリンパ球（CTL）媒介免疫反応が発生し、移植された腫瘍が拒絶反応を起こす（Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. .、1996）。 CTL はグランザイム B とパーフォリンを使用して細胞を溶解します。 グランザイム B はアポトーシスの遠位エフェクターの 1 つであるカスパーゼ 3 を活性化し、パーフォリンは細胞膜に一次損傷 (壊死) を引き起こすため、近位の死のメカニズムがブロックされれば SL が有効であることが期待できます。 壊死と組み合わせたアポトーシスの遠位リンクの誘発

抗腫瘍薬に耐性のある細胞の死につながり、プログラムされた細胞死を促進します。

問題の定式化

MDR は臨床的に好ましくない現象であり、これを克服するにはその発生メカニズムと細胞死がどのように起こるかについての知識が必要であり、問​​題の両方の側面を研究する必要があります。 まず、MD/?におけるMDRの発症メカニズムを研究する必要があります。 l/Pgp 陰性ヒト細胞、これらのメカニズムの研究は、主に感受性のある細胞における耐性の発生を防ぐのに役立ちます。 第二に、MDR を有する細胞内で機能する死のプロセスを分析することで、二次 MDR が形成された状況で耐性を克服するための基礎が作成されます。

研究の目的は、ヒト腫瘍細胞におけるリンパ節の緊急形成のメカニズムを確立し、この抵抗性を克服するアプローチを開発することです。

化学療法およびシグナル伝達機構の実験的アゴニストおよびアンタゴニストの効果に応答した、ヒト腫瘍細胞培養物におけるMDRの発生モデルを最適化する。

メインを決めよう！ 細胞を抗腫瘍剤で治療した場合のMDRの緊急発生のメカニズム：遺伝子増幅 MDRI、 Pgp陽性細胞の選択または新たなMDR抑制。

MDR (プロテインキナーゼ C、ホスホリパーゼ C、細胞 Ca+、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、NFkB) の活性化を制御する細胞内シグナル伝達の経路を調査します。

遺伝子発現の侵入活性化と侵入後制御（mRNA安定性）の役割を特定する MDRI化学療法への曝露に応じたMDRの即時発症において。

化学療法薬とブロッカーを組み合わせた場合に、腫瘍細胞におけるMDRの発症を防ぐ方法を開発すること MDR\-シグナル伝達経路と遺伝子転写阻害剤の活性化

分泌カスプとエフェクターカスプの活性化の動態、ミトコンドリアの膜貫通電位の変化、ポリ(ADP)リボースポリメラーゼのタンパク質分解的切断、ヌクレオソーム間DNA断片化と親細胞およびMDR変異体における原形質膜の完全性を研究する。 P-糖タンパク質によって輸送されない薬物。

サイトカインを発現する腫瘍細胞によるワクチン接種を使用して、MDR 細胞に対する免疫応答を生成します。

防御のために提出された条項。

Pgp 媒介 MDR (多くの影響に対する緊急の細胞反応) の形成は、遺伝子のエピジェネティックな活性化によって媒介されます。 MDRI。この活性化は、細胞内シグナル伝達、遺伝子プロモーター誘導、mRNA 安定化などの複数の機構によるものであり、これらのシグナルの阻害剤によって防ぐことができます。

Pgp 媒介 MDR の克服は、耐性細胞の原形質膜の標的化と関連している可能性があります。 Pgp は細胞膜の完全性の破壊、つまり壊死から細胞を保護しません。

科学的背景 外因性刺激に対する細胞の緊急反応としての MDR の形成という考えが初めて実証されました。

特定の薬剤耐性表現型（Pgp 媒介 MDR）の発生メカニズムが初めて詳細に研究されました：このタンパク質をコードする遺伝子のエピジェネティックな活性化 MDRI。

3. 緊急遺伝子活性化モデルを初めて開発 MDRI、

培養ヒト腫瘍細胞におけるPgp媒介MDRの安定した表現型の獲得を伴う。 \. シグナル伝達経路、転写活性化および転写後の遺伝子制御のメカニズムが特定されている MDRX抗腫瘍剤に曝露された細胞内。 5. 細胞内シグナル伝達のブロッカーである薬理学的物質のクラスが、腫瘍細胞における Pgp 媒介 MDR の形成を防ぐことが初めて明らかになりました。 5. Pgp 媒介 MDR を持つ細胞で働く死のメカニズムが初めて研究され、原形質膜の完全性に対する一次損傷を含む、耐性を克服するアプローチが開発されました。

実用的な価値。

化学療法薬に曝露された場合の培養腫瘍細胞における Pgp 媒介 MDR の緊急発生を防ぐ方法の開発。

MDRを克服するための遺伝子組み換えワクチンの前臨床試験。

仕事の承認。

この論文は、2003 年 6 月 30 日に、腫瘍細胞遺伝学、細胞遺伝学の研究室と分子遺伝学、ウイルスおよび細胞の癌遺伝子、分子内分泌学、抗腫瘍免疫、生化学薬理学、医学研究、実験診断および医学研究のグループとの共同会議で議論されました。腫瘍の生物学的療法。 ロシアがん研究センターの動物学、血液学、化学療法、臨床薬理学、高度な治療法の部門にちなんで名付けられました。 N.N. ブロヒン・ラムズ。

論文の主な資料は以下の会議で発表されました。第 2 回国際シンポジウム「細胞増殖抑制性薬剤耐性」（ドイツ、1991 年）。 ゴードン会議「化学療法の進歩」（ニューヨーク、ロンドン、米国、1994年）。 「分子毒物学」（コプラーマウンテン、米国、1995年）。 「誘導可能なゲノム応答」(スティーブンソン、米国、1996); 「核酸 - 分子診断と治療の統合」(サンディエゴ、米国、1996); 米国癌研究協会年次会議 (1994 ～ 2001 年): 第 6 回 そして第7回会議「腫瘍学の進歩」（ギリシャ、ヘルソニソス、2001年、2002年）。 「細胞核の構造と機能」（サンクトペテルブルク、2002 年）、および Oncotech, Inc. でのセミナー。 （米国アーバイン、1996年）、ソーク研究所（米国ラホーヤ、1997年）、リー・モフィットがんセンター（米国タンパ、1997年）、ジャクソン研究所（米国バーハーバー、1997年）、スローン・ケタリングがんセンター、ニューヨーク] 米国、1999 年）、コペンハーゲン大学（2002 年）、インスブルック大学（2002 年）、フローニンゲイ大学（2003 年）、モスクワ州立大学。 M.V. Lomonosov (2002)、実験病理学・腫瘍学・放射線生物学研究所にちなんで名付けられました。 R.E. カヴェツキー (キエフ、2002)。

出版物。

論文の構造と範囲。

プログラムされた細胞死 - アポトーシスの研究（ギリシャ語から。 αποπτωσις - 落葉） - 過去10年間に、いくつかの重要な科学的発見が伴いました：この現象を実現するための全体的なシステムが発見されました - それを制御する遺伝子、ならびに細胞死を媒介する表面細胞受容体とそのリガンドが同定されました。
科学者たちは数多くの実験で、プログラムされた死は、あらゆる多細胞系のあらゆる細胞に必須かつ不可欠な特性であることを証明しました。 (毎日、体の細胞の約 5% がアポトーシスを起こし、新しい細胞が置き換わります。細胞が跡形もなく消えるまでには 15 分から 2 時間かかります)。
2002 年、分子生物学者のシドニー ブレナー ( シドニー・ブレナー、ロバート・ホーウィッツ（ H.ロバート・ホーヴィッツ) とジョン・スルストン ( ジョン・エドワード・サルストン）「生物発生の遺伝子制御とプログラムされた細胞死」の分野での発見により、ノーベル生理学・医学賞を受賞しました。
専門家らは、アポトーシスに関するさらなる研究が、がん、脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、パーキンソン病などの危険な病気に対する治療薬の開発に貢献できる可能性があると考えている。

アレクサンダー・アルベルトヴィッチ・スティール– 医学博士、ロシア癌研究センター発がん研究所腫瘍細胞死のメカニズム研究室長にちなんで名付けられました。 N.N. ブロヒンロシア医学アカデミー。

細胞腫瘍学および分子腫瘍学分野の専門家。

科学的関心: プログラムされた細胞死のメカニズム (細菌および真核生物、特に腫瘍細胞)。

質問_エレナ・ヴェトロワ
3月、4月
モスクワ、2009 年

アレクサンダー・アルベルトヴィッチによれば、アポトーシスは、生涯を通して体内で起こる重要な生物学的プロセスの1つです。 体の胚発生（形態形成）、器官や組織の動的なバランスの維持（恒常性）、腫瘍の発生と発生の過程において重要な役割を果たします。（発がん性）。
他にどのような場合に体内で細胞自殺プログラムが作動するのでしょうか? そして、このプログラムはどのようにして体に何が良くて何が悪いのかを「知る」のでしょうか？

プログラムされた死は、特定の環境条件（栄養素、温度）に最適な細胞集団のサイズを維持するために、細菌などの最も単純な生物の生理学的プロセス中に活性化されます。 この効果は、自己調節する細菌群集であるバイオフィルムで観察されます。
高等生物の組織や器官の胚発生や成体生物では、プログラムされた死は、老化して機能を失った細胞集団を若い細胞集団に置き換える役割を果たします。
プログラムは身体に何が良くて何が悪いのかを知りません。それはただ人生がどのように機能するかだけです - 死は人生の側面です...

つまり、進化の副作用とは、アウグスト・ワイズマンは何を話しているのでしょうか？ドイツの動物学者および進化論者は、19 世紀末に次のように書きました。

...したがって、化学療法中の非腫瘍細胞の死は悪いものです。ここでは正常細胞のアポトーシスは望ましくありませんが、プログラムは「悪い細胞」と「良い細胞」の間で分配されるのではなく、生き残ることができる細胞が生き残ることを可能にし、より多くの細胞を破壊します。脆弱で、より敏感です...人間の理解における正義はここでは機能せず、この絶望と「無原則」の代償を払わなければなりません。

科学者たちがアポトーシスの存在を知ったのは、それほど昔ではない、約半世紀前です。 この発見は科学の発展にどのような影響を与えましたか?

この発見により、約15年という短期間で、細胞内シグナルの伝達、タンパク質分解の制御、体内のタンパク質とペプチドの分解プロセス、タンパク質分解の制御など、最も重要な生物学的プロセスに関するアイデアを形成することが可能になりました。核、細胞小器官、膜の形状。

遺伝子発現におけるクロマチンタンパク質の役割の研究が強化されています。

細胞増殖抑制剤、主に抗腫瘍剤と電離放射線の腫瘍細胞と正常細胞に対する作用機序に関するアイデアが実証されています。

今日の細胞死のメカニズムの発見は、生物学や化学から人間、動物、植物の病気の治療に至るまで、多くの科学的方向に焦点を当てています。

はい、この方向は分子生物学において最も有望なものの 1 つと考えられています。 それは、依然として不治の変性疾患、癌、さらには老化を克服する可能性さえも治療するための根本的に新しい薬の開発と楽観的に関連付けられています。
いくつかの報告によると、今日世界中で 400 以上の研究室が何らかの形でこのテーマに関与しているとのことです。

分子生物学におけるアポトーシスの研究の有望性は、この現象 (そしてより広義には細胞死) が多くの科学的考え方と方向性の組み合わせをカバーしているという事実によるものです。 細胞は、単純であろうと複雑であろうと、常に複雑なシステムであり、死は生物の不可欠な特性です。 したがって、死の研究は一般に、人生の本質を理解するのに有望です。
そして実際、死のメカニズムを研究することで、多くの薬物の効果を特定することが可能になります。

比較的最近になってこの現象が発見された 傍観者効果 (« 傍観者効果"): 何らかの理由で細胞が死滅すると、隣接する健康な細胞に特定の信号が送信され、細胞は自己破壊します。 何が彼らを動機づけているのでしょうか？ これについて何か仮説はありますか？

これは、複雑なシステムにおける生物学的調節の一例です。このようにして、細胞は隣接する細胞に信号を送信することで互いに殺し合います。 シグナル (通常は水溶性タンパク質) は、それ自体の細胞には有害ではありませんが、同じ集団内に存在する異なる起源の細胞には破壊的です。ゲームはこの感度の違いに基づいています。

アポトーシスの過程における酸素と過酸化水素の役割は何ですか?

非常に重要 - 酸素ラジカルは化学的に非常に活性です。 これらは、タンパク質、核酸、脂質に損傷を与える反応を引き起こします。

電離放射線とアントラサイクリン系抗生物質の治療効果はこの特性に基づいています。 光による特殊な化合物 (光増感剤) の励起は、酸素爆発と重大な細胞損傷を引き起こします。 このような光増感剤が腫瘍内に蓄積し、腫瘍が照射されると、腫瘍細胞の死が起こります。 腫瘍学では、このような治療法は光力学と呼ばれ、光が届きやすくサイズがそれほど大きくない腫瘍に広く使用されています。

アポトーシスの原理は、組織や器官の細胞レベルと細胞内レベルの両方で観察されます。 ロシア科学アカデミーの学者ウラジミール・スクラチョフは、この現象をフェノプトーシスと呼ぶことを提案した。 自然界では、なぜ一部の動植物（開花後の竹、産卵後のサケ）が、壮年期に自己破壊プログラムを開始するのでしょうか? これは不可逆的な遺伝子変異が原因である可能性は低いです。

おそらく関係はありませんが、これが自然のメカニズムです - 色あせた竹は枯れるという言葉... このメカニズムはエピジェネティックです - 突然変異はありませんが、クロマチンの物理化学的特性には急速な変化があります、そして重要な遺伝子（遺伝子）が働くことをやめます。 このような言語は破壊を必要としません。化学基 (メチル、リン酸、アセチル) をあるタンパク質から別のタンパク質に結合または分離するだけで十分です。
ヒントは十分です...

ガンは、修復不可能な損傷を含む（したがって進化にとって危険な）遺伝的に不安定な生物のプログラムされた死でもあるという仮説があります。 完全に形質転換した細胞が出現するのは時間の問題だという腫瘍学者の声が増えています。 もしそうなら、がんは老化のような病気ではなく、生命システムの発達の特定の結果であることになります。 しかし科学者たちは、将来的には癌に勝利すると想定し、未来学者も予測している。 そして実際、結局のところ、人間は進化に慈悲を期待しなくなって久しいのです。 癌を克服することは可能でしょうか？

おそらく、それを打ち負かすことはできません - 癌は、炎症、アレルギーなどの他の典型的な病理学的プロセスとともに、生存不可能な個人を除去するためのメカニズムの1つです。 有機生命は生物の入れ替わりによって構築されており、死は避けられず、その実現のためのメカニズムが必要です。 がんもそのようなメカニズムの 1 つです。 科学者の仕事は死を回避することではなく、死を遅らせることです。

老化と癌の発症の間に強い関連性があり、明らかにこれを疑う人がいないのであれば、おそらく老化との闘いの戦線を老化との闘いの規模まで拡大する必要があるだろうか？

老化との闘いは、腫瘍との闘いの一環として、また他の側面でも必要であることは疑いの余地がありません。

体の抗がん防御はアポトーシスに基づいています。 一連の突然変異の後、なぜアポトーシスが機能しなくなるのでしょうか? なぜ、ある時点で体が抵抗をやめ、腫瘍（免疫系など）を助け始めるのでしょうか?

それは、他の生物学的プロセスと同様に、アポトーシスは突然変異によって中断されるためであり、またアポトーシスは突然変異がなくても簡単に中断できるためです。

発がん過程におけるチトクロム P450 酵素群の役割は何ですか?

3.サー・ジョン・サルストン- 英国の生物学者、英国王立協会の会員。 彼の研究室は、線虫 Caenorhabditis elegans の胚細胞の分裂順序の完全な説明をまとめ、発生中の 959 個の細胞すべての運命を追跡しました。

疑いなく。 このようなタンパク質の存在は、生物学におけるアポトーシスの本質的な重要性を裏付けています。この現象のメカニズムはランダムではなく、細胞の DNA にコード化されており、適切なシグナルが存在すると作用します。 それらがなければ死はありません。

最近、アルバート・アインシュタイン医学研究所のアメリカの研究者らは、細胞内タンパク質 p115 の小さな断片がアポトーシスを活性化することを発見しました。
アポトーシスの前に、p115 は 2 つの断片に分解され、小さい方の断片は 205 アミノ酸で構成されます。 科学者によれば、その発現によりミトコンドリアから細胞の細胞質へシトクロムCが放出され、細胞死につながるため、細胞死の過程で重要な役割を果たしているとのことです。 科学者らは、この発見ががんや過剰な細胞増殖を特徴とするその他の病状と闘うための新薬の開発につながる可能性があると期待している。
アポトーシスの分野における最新の発見のうち、医学と生物学にとって鍵となるのはどれだと思いますか?

増殖性疾患の治療に対する新しいアプローチは、同様の現象に基づいており、細胞自身のタンパク質がキラーとして機能する条件を作り出すことです。 したがって、アポトーシスの誘導中に起こるタンパク質ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼのタンパク質分解的切断により、DNAに結合する断片が形成され、その損傷の修復が妨げられます。 DNA損傷の治癒に必要な通常のタンパク質ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼは、細胞に対して破壊的になります。

現在、細胞死の制御に重要な実用化が進んでいる最新の発見には、いわゆるショートヘアピンアンチセンスRNAの導入によって細胞および生物全体の特定の遺伝子を抑制できる可能性の証拠が含まれています。

サイレント遺伝子技術 ( 沈黙する遺伝子）、短い二本鎖 RNA 分子が標的遺伝子の調節配列に結合すると、この遺伝子の合成プロセスを停止することが可能になります。
有望なベクター（ウイルス）遺伝子治療。

これらのツールは、化学者と生物学者の長年にわたる協力の成果であり、長期にわたる遺伝子のシャットダウンを可能にします。 このような遺伝子の産物が細胞の生存にとって重要である場合、最小限の副作用で細胞死を誘導します。 後者は腫瘍クリニックでは特に重要です。多くの場合、化学放射線療法は病気そのものよりも患者に耐えられます...標準的な薬物療法では、どの細胞をどのように破壊するのかはまだ十分に理解されていません。 遺伝子治療はより効果的であり、治療の副作用が軽減される可能性があります。

多くの困難に直面しているものの、間違いなく有益なのは、ターゲット指向 - ターゲット - (英語より) という概念です。 目標 - 目標、目標）腫瘍治療。

図では、 d ハーセプチンという薬の効果 - (スイス/Roshe社製)。 HER2 受容体タンパク質をブロックできる抗体に基づいて作成されます。
腫瘍の発生を抑制します。
患者の状態を安定させます。
化学療法の期間を短縮します。

（図はカーソルでクリックすると拡大します）

腫瘍細胞内の特定の標的（タンパク質）を不活化するために作られた個々の薬剤は非常に有効であり、長期の治療期間にわたって忍容性が良好です（例 - Gleevec、Iressa）。

あなたの研究室は、腫瘍細胞死の開始と実行の経路を標的とする戦略の研究に取り組んでいます。 これらの問題の解決はどこまで進んでいますか?

私たちの研究室の専門家は、ロシアで作られた新薬の影響下での腫瘍細胞死のメカニズムを確立しました。 特に、腫瘍細胞の薬剤耐性を回避できるメカニズムが特定されています。つまり、新しい化合物が薬剤の細胞への侵入を妨げる障壁を克服します。

あなたは、がん細胞への細胞の再プログラミングとがん細胞の死における化合物の役割の研究に加えて、細胞死の分子機構の解明にも取り組んでいます。 これらのメカニズムについて不明な点は何ですか? 科学者がまだ答えなければならない質問は何ですか?

非腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発を回避する方法を見つけることが重要です。 細胞を殺すことは問題ではありません、問題は健康な細胞をどのように保護するかです...

あなたの研究室では、がん細胞のキラー機能のメカニズムの研究に取り組んでいますか? 原理的に、癌細胞の身体破壊活動と正常組織への影響を阻止することは可能でしょうか?

可能であり、必要です。 がん細胞によって分泌され、正常細胞の破壊を引き起こす毒素である腫瘍壊死因子（一種の傍観者効果）を不活化する手段が登場している。 これらの製品は初期臨床試験中です。

あなたはアメリカで8年間働いていましたね。 がんと闘うロシアと西洋のアプローチの違いは何ですか? 米国では、がんと闘い、がんを予防するために多額の資金が割り当てられていることが知られています。 そして、これらの対策の最も重要な結果は、がんによる死亡率が徐々に減少していることです。
ロシアでは、がんの発生状況は依然として厳しい。 不利な状況を逆転できる対策は何でしょうか？

西洋の科学スタイルは、現象だけでなくメカニズムの徹底的な研究への欲求、幅広い学際的なつながりによる表現の完全性、重要な科学情報の作成に対する激しい競争によって特徴付けられます。

がんによる死亡率は依然として世界的な問題ですが、一部の地域では状況が改善されています。 例えば、胃がんの症例は減少しました - 食生活の状況が変化し、冷凍産業の発展により食品の長期保存が安全になり、反タバコの宣伝が組織されました - これらの公的措置は確かに良い結果をもたらしています。
におけるイノベーションについて 健康管理（主にがん治療分野）予定 100億ドル– 現在の会計年度に規定されている額の 2 倍。

そして、ロシアの状況は、多くの社会階層の共同の努力と、もちろん、そのような複雑で重要な任務に十分な資金を結集することによって改善することができる。