Ibridazione fluorescente in situ. Ibridazione in situ fluorescente (FISH)

In alcuni casi, la ricerca citogenetica non è sufficiente per emettere una conclusione sul cariotipo; in questi casi vengono utilizzati metodi citogenetici molecolari, in particolare, l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH).

L'emergere di nuove tecnologie di citogenetica molecolare, basate principalmente sull'ibridazione in situ degli acidi nucleici, ha notevolmente ampliato le possibilità della diagnostica cromosomica. Il metodo di ibridazione in situ è stato sviluppato per localizzare specifiche sequenze di DNA direttamente su preparati citologici. C'è stato un passaggio nell'identificazione dei cromosomi e delle regioni cromosomiche dall'analisi dell'organizzazione citologica del cromosoma all'analisi delle sequenze di DNA che li compongono. Il confronto dell'efficacia dei metodi citologici classici per la rilevazione e l'analisi dei riarrangiamenti cromosomici, come la colorazione differenziale dei cromosomi, con le moderne tecnologie citogenetiche molecolari ha dimostrato che nelle malattie ematologiche, l'analisi citologica dei cromosomi rileva e identifica correttamente solo circa un terzo dei cromosomi riarrangiamenti rilevati utilizzando il cariotipo spettrale (SKY) ... Circa un terzo dei riarrangiamenti viene identificato in modo errato con metodi citologici e un terzo rimane completamente inosservato. I metodi classici di analisi citogenetica possono rivelare solo il 15% circa dei riarrangiamenti cromosomici identificati utilizzando SKY.

Il metodo FISH utilizza molecole fluorescenti per colorare geni o cromosomi in vivo. Il metodo viene utilizzato per mappare i geni e identificare le aberrazioni cromosomiche.

La tecnica inizia con la preparazione di brevi sequenze di DNA, dette sonde, che sono complementari alle sequenze di DNA dell'oggetto di studio. Le sonde ibridano (si legano) a regioni complementari del DNA e, grazie al fatto che sono etichettate con un'etichetta fluorescente, consentono di vedere la localizzazione dei geni di interesse all'interno del DNA o dei cromosomi. A differenza di altri metodi di studio dei cromosomi che richiedono una divisione cellulare attiva, FISH può essere eseguito su cellule non in divisione, il che rende il metodo flessibile.

FISH può essere utilizzato per una varietà di scopi utilizzando tre diversi tipi di sonde:

* sonde locus-specifiche che si legano a specifiche regioni dei cromosomi. Queste sonde vengono utilizzate per identificare la breve sequenza disponibile di DNA isolato, che viene utilizzata per preparare una sonda marcata e la sua successiva ibridazione con un set di cromosomi;
* Le sonde ripetute alfoidi o centromeriche sono sequenze ripetute di regioni centromeriche dei cromosomi. Con il loro aiuto, ogni cromosoma può essere colorato in un colore diverso, il che consente di determinare rapidamente il numero di cromosomi e le deviazioni dal loro numero normale;
* le sonde per l'intero cromosoma sono un insieme di piccole sonde che sono complementari alle singole regioni del cromosoma, ma generalmente ne coprono l'intera lunghezza. Utilizzando una libreria di tali sonde, è possibile "colorare" l'intero cromosoma e ottenere il cariotipo spettrale differenziale di un individuo. Questo tipo di analisi viene utilizzato per analizzare le aberrazioni cromosomiche, ad esempio le traslocazioni, quando un pezzo di un cromosoma viene trasferito sulla spalla di un altro.

Ibridazione fluorescente in situ (FISH)

Il materiale per la ricerca è sangue, midollo osseo, biopsia tumorale, placenta, tessuto embrionale o liquido amniotico. I campioni per la ricerca devono essere consegnati al laboratorio freschi. I vetrini (vetrini) vengono preparati direttamente da campioni di tessuto o dopo la coltura. Possono essere utilizzate sia preparazioni cellulari metafase che interfase. Sonde di DNA specifiche marcate con fluorescenza si ibridano al DNA cromosomico e più sonde possono essere utilizzate contemporaneamente in diversi loci.

FISH è un metodo utile e sensibile di analisi citogenetica per la rilevazione di aberrazioni cromosomiche quantitative e qualitative, come delezioni (comprese le microdelezioni), traslocazioni, sdoppiamento e aneuploidia. La FISH sui cromosomi in interfase è un metodo rapido per la diagnosi prenatale delle trisomie 21, 18 o 13 cromosomi o delle aberrazioni dei cromosomi sessuali. In oncologia, FISH può rilevare una varietà di traslocazioni (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1) associate a neoplasie ematologiche maligne. Il metodo può essere utilizzato anche per monitorare gli effetti residui del cancro dopo chemioterapia e trapianto di midollo osseo e per identificare oncogeni potenziati (c-myc / n-myc) associati a una prognosi infausta per alcuni tumori. FISH viene anche utilizzato per monitorare il tasso di sopravvivenza di un allotrapianto di midollo osseo ottenuto da un individuo del sesso opposto.

FISH è un metodo sensibile per identificare le aberrazioni cromosomiche e per l'analisi rapida in un unico passaggio di grandi numeri di cellule (> 500). Il metodo è estremamente accurato nell'identificazione della natura dei cromosomi e dei frammenti sconosciuti del DNA cromosomico.

Citogenetica tradizionale quando si studiava il cariotipo, era sempre limitato dal livello di risoluzione della banda. Anche con l'uso di metodi di colorazione differenziale cromosomica ad alta risoluzione, abbiamo rilevato solo più bande sul cromosoma, ma non eravamo sicuri di arrivare al livello molecolare di risoluzione. I recenti progressi nella tecnologia del DNA e nella citogenetica hanno permesso di utilizzare i metodi FISH per analizzare i cambiamenti nel DNA cromosomico a livello molecolare. La citogenetica molecolare ha fornito una svolta rivoluzionaria nella citogenetica, consentendo:

Analizzare la struttura dei cromosomi del DNA nell'intervallo 10-100 kilobasi;
per eseguire la diagnostica delle cellule interfase non in divisione, che ha avuto un enorme impatto sulla diagnostica prenatale e sulla diagnostica genetica preimpianto (PGD).

Tecnologia FISH utilizza una sonda di DNA che lega o riassocia sequenze di DNA specifiche all'interno di un cromosoma. La sonda denaturata viene incubata con il DNA nativo della cellula, anch'esso denaturato in uno stato a singolo filamento. La sonda sostituisce biotina-deossiuridina trifosfato o digossigenina-uridina trifosfato con timidina. Dopo la rinaturazione della sonda di DNA nativa con una sonda, il complesso sonda-DNA può essere rilevato mediante l'aggiunta di avidina marcata con fluorocromo, che si lega alla biotina, o anti-digossigenina marcata con fluorocromo. Un'ulteriore amplificazione del segnale può essere ottenuta aggiungendo antiavidina e studiando il complesso risultante mediante microscopia a fluorescenza. Marcando diverse sonde di DNA con diversi fluorocromi diversi, è possibile visualizzare contemporaneamente diversi cromosomi o segmenti cromosomici all'interno di una cellula sotto forma di segnali multicolori.

Possibilità di determinazione segmenti genici specifici, presente o assente sui cromosomi, ha permesso di diagnosticare sindromi da sequenza genica a livello del DNA, nonché traslocazioni nei nuclei interfasici, spesso in singole cellule.

Materiale per PESCE possono essere cromosomi in metafase ottenuti da cellule in divisione o nuclei in interfase da cellule che non sono in fase di divisione. Le sezioni vengono pretrattate con RNasi e proteinasi per rimuovere l'RNA, che può ibridarsi in modo incrociato con la sonda e la cromatina. Vengono quindi riscaldati in formammide per denaturare il DNA e fissati con alcool ghiacciato. La sonda viene quindi preparata per l'ibridazione mediante riscaldamento. Successivamente, la sonda e la preparazione del cromosoma vengono miscelate e sigillate con un coprioggetto a 37 ° C per l'ibridazione. Variando la temperatura di incubazione o la composizione salina della soluzione di ibridazione, è possibile ridurre la specificità di legame e l'etichettatura di fondo.

Applicazione dell'ibridazione fluorescente in situ - tecnologia FISH

Efficienza della tecnologia FISHè stato dimostrato per la prima volta nella localizzazione dei geni su. Con l'introduzione del metodo di marcatura fluorescente, l'ibridazione in situ si è rivelata indispensabile per la diagnosi di anomalie cromosomiche che non vengono rilevate dai metodi tradizionali di banding. FISH ha anche svolto un ruolo chiave in una delle scoperte più straordinarie della genetica moderna: l'imprinting genomico.

La sua tecnologia di sviluppo PESCE ricevuto in tre forme. Le sonde centromeriche, o alfa-satellite, sono caratterizzate da una relativa specificità cromosomica; sono più spesso utilizzate nella genetica delle cellule in interfase. Queste sonde generano segnali alquanto diffusi di adeguata forza nella regione centromerica, ma non ibridano in modo incrociato con cromosomi aventi sequenze centromeriche simili. Attualmente sono state sviluppate sonde a copia singola che danno un segnale discreto da una specifica banda del cromosoma e consentono di evitare il fenomeno dell'ibridazione incrociata. Queste sonde possono essere utilizzate anche per determinare il numero di copie e regioni specifiche del cromosoma, presumibilmente associate a una particolare sindrome. Le sonde a copia singola e centromeriche progettate per i cromosomi 13, 18, 21, X e Y vengono utilizzate per la diagnosi prenatale.

È anche possibile "colorare" interi cromosomi con PESCE... Grazie alla tecnologia del cariotipo spettrale, che utilizza una miscela di diversi fluorocromi, è ora possibile creare un modello fluorescente unico per ogni singolo cromosoma con 24 colori separati. Questa tecnologia consente di determinare riarrangiamenti cromosomici complessi che non sono visibili quando si utilizzano le tecniche citogenetiche tradizionali.

Metodo PESCE nella diagnosi prenatale. Per le donne in età riproduttiva più avanzata, la gravidanza può essere causa non tanto di gioia quanto di ansia. Con l'età di una donna, è associato il rischio di sviluppare anomalie cromosomiche fetali. L'amniocentesi eseguita alla 16a settimana di gravidanza, seguita dall'analisi del cariotipo, dura 10-14 giorni. L'utilizzo della FISH nell'esame preliminare può velocizzare la diagnosi e ridurre i tempi di attesa. La maggior parte dei genetisti e dei laboratori è dell'opinione che il metodo FISH non dovrebbe essere utilizzato da solo per prendere decisioni sulla futura gestione della gravidanza. Il metodo FISH deve essere integrato da un'analisi cariotipica e i suoi risultati dovrebbero almeno essere correlati al quadro patologico dell'esame ecografico (US) o dello screening biochimico basato sul sangue della madre.

sindromi geniche sequenze note anche come sindromi da microdelezione o aneusomia segmentale. Si tratta di delezioni di frammenti cromosomici adiacenti, che di solito coinvolgono molti geni. Le sindromi da sequenza genica sono state descritte per la prima volta nel 1986 utilizzando tecniche citogenetiche classiche. Ora, grazie alla FISH, è possibile identificare delezioni submicroscopiche a livello del DNA, che hanno permesso di identificare la più piccola regione deleta associata allo sviluppo di una particolare sindrome, chiamata regione critica. Una volta individuata la regione critica per una sindrome, è spesso possibile identificare geni specifici, la cui assenza viene riconosciuta come associata alla sindrome. In un manuale pubblicato di recente sulle sindromi da sequenza genica, sono riportate 18 delezioni e sindromi da microdelezione associate a 14 cromosomi. Alcune delle sindromi da sequenza genica più comuni e le loro manifestazioni cliniche sono mostrate nella Tabella. 5-2.

telomeri- formazioni che coprono le estremità dei bracci lunghi e corti dei cromosomi. Sono costituiti da sequenze TTAGGG ripetitive e impediscono la fusione delle estremità dei cromosomi tra loro. Le sonde telomeriche svolgono un ruolo importante nel riconoscere traslocazioni complesse che non possono essere rilevate con i metodi citogenetici tradizionali. Inoltre, una delle scoperte dello Human Genome Project è stata il fatto che le regioni dei cromosomi adiacenti ai telomeri sono ricche di geni. È stato ora dimostrato che le delezioni subtelomeriche submicroscopiche sono responsabili dell'insorgenza di molte malattie geneticamente determinate.

Ibridazione in situ di acidi nucleici Il metodo si basa sulla possibilità di formare ibridi a doppio filamento tra sonde marcate create artificialmente sulla base di sequenze a filamento singolo (ribo- o desossiribo-, oligo- o polinucleotidi) e loro sequenze complementari in target - analizzate le molecole di DNA o RNA. Per identificare le aree di ibridazione, un campione di DNA (sonda DNA) viene marcato con un gruppo reporter: ü un isotopo radioattivo, ü un fluorocromo, ü un enzima che dà un prodotto colorato o luminescente, ü un aptene a cui si lega il corpo marcato, eccetera.

Rilevando un ibrido dovuto alla presenza di un gruppo reporter nella sonda, è possibile - stimare il numero di geni che codificano un certo tipo di RNA, - determinare la proporzione di DNA non trascritto nel genoma, - stabilire il legame di alcuni geni tra loro - e la loro esatta posizione sui cromosomi. Il metodo di ibridazione molecolare ha un'elevata sensibilità (è possibile rilevare una piccola quantità di una sonda marcata (10 -15 e 10 -19 M) e, di conseguenza, una sequenza complementare nel bersaglio) e rapidità di analisi, che lo rende possibile utilizzare tale metodica sia per attività di ricerca che per la diagnosi di malattie ereditarie ed infettive in medicina, veterinaria e floricoltura.

L'emergere di nuove tecnologie di citogenetica molecolare, basate principalmente sull'ibridazione in situ degli acidi nucleici, ha notevolmente ampliato le possibilità della diagnostica cromosomica.

Citogenetica interfase: 1. Bande cromosomiche multicolori (MCB). 2. Ibridazione fluorescente in situ (FISH). 3. Combinazione di FISH con altri metodi: -citologia + FISH; -istologia + PESCE; - immunofenotipizzazione + PESCE (FANTASCIENZA); Citogenetica in metafase: 1. Quadro intero. 2. Ibridazione genomica comparativa (CGH). 3. Cariotipo a cambiamento di colore (CCK). 4. Cariotipo multicolore: cariotipo spettrale (SKY); PESCE multicolore (M - PESCE, M - FASCIA).

FISH - l'ibridazione in situ a fluorescenza è un metodo citogenetico utilizzato per rilevare e localizzare specifiche sequenze di DNA su cromosomi, m.RNA, ecc. Il metodo si basa sull'ibridazione di una sonda DNA/RNA marcata in modo fluorescente con una sequenza DNA/RNA complementare. L'identificazione dell'etichetta avviene mediante un microscopio a fluorescenza. Il metodo FISH è stato introdotto oltre 30 anni fa. È diventato ampiamente accettato come metodo per mappare fisicamente i geni sui cromosomi. Successivamente, ha iniziato ad essere applicato in altre aree di ricerca (nei campi della genetica clinica, della medicina riproduttiva, della tossicologia, della biologia evolutiva, della genomica comparata e cellulare e della biologia cromosomica). Attualmente la FISH è principalmente utilizzata per costruire mappe fisiche e genetiche dei cromosomi, per identificare riarrangiamenti strutturali, traslocazioni, microdelezioni, amplificazioni geniche nei cromosomi in interfase e metafase. Come risultato dello sviluppo della scienza (migliore comprensione delle proprietà chimiche e fisiche degli acidi nucleici e della cromatina), nonché dello sviluppo della microscopia a fluorescenza e dell'imaging digitale, il metodo è stato costantemente migliorato (migliore sensibilità, specificità, risoluzione) , e sono state sviluppate molte varianti di questo metodo.

1) Le cellule vengono fatte cadere su un vetrino causando la diffusione dei cromosomi 4) I cromosomi vengono controcolorati utilizzando DAPI 2) La sonda marcata con fluorescenza viene posizionata sui cromosomi e sigillata. 3) La sonda e i cromosomi vengono denaturati, ibridati e quindi lavati 5) Il vetrino viene visualizzato al microscopio a fluorescenza

La visione generale del protocollo per la stadiazione della FISH può essere presentata come segue: 1. Preparazione di un campione istologico o citologico. La preparazione del campione istologico viene eseguita secondo lo schema standard: taglio, marcatura, cablaggio, riempimento, microtomia, posizionamento della sezione su un vetrino e deceratura. Quando si prepara una preparazione citologica, vengono utilizzate soluzioni precipitanti speciali e centrifugazione, che consente di ottenere una sospensione concentrata di cellule. 2. Pre-elaborazione (se necessario). Il farmaco viene trattato con proteasi per eliminare la presenza di proteine che ostacolano l'ibridazione. 3. Applicazione di una sonda a DNA alla preparazione e successiva denaturazione. Per denaturare la sonda e il DNA del campione, vengono trattati con formammide e riscaldati a una temperatura di circa 85-900 C.

4. Ibridazione. Dopo la denaturazione, il preparato viene raffreddato ad una certa temperatura (370 C nel caso di studi clinici) e incubato in camera umida per diverse ore (la durata dell'incubazione è indicata in ogni protocollo specifico). Attualmente, gli ibridatori automatici vengono utilizzati per la denaturazione e l'ibridazione. 5. Lavaggio. Una volta completata l'ibridazione, è necessario lavare via le sonde non legate, che altrimenti creeranno uno sfondo che rende difficile valutare i risultati dell'analisi FISH. Per il risciacquo viene solitamente utilizzata una soluzione contenente citrato e cloruro di sodio (SSC). 6. Contro-colorazione. Usando coloranti fluorescenti (DAPI - 4, 6-diamidina-2 fenilindolo; ioduro di propidio), tutto il DNA nucleare viene colorato. 7. Analisi dei risultati al microscopio a fluorescenza Le operazioni di routine (deparaffinazione, pretrattamento, lavaggio) possono essere automatizzate.

Studio delle regioni telomeriche mediante microscopio a fluorescenza. Le immagini ottenute nella fase di interfase (nucleo) e metafase (cromosomi separati) vengono combinate. colore blu - DAPI.

Vantaggi del metodo FISH: 1. la capacità di studiare il materiale genetico nei nuclei in interfase; 2. ottenere risultati oggettivi secondo il principio "sì / no" è un metodo quantitativo; 3. interpretazione relativamente semplice dei risultati; alta risoluzione. Svantaggi del metodo FISH: 1. i coloranti fluorescenti "sbiadiscono" rapidamente; 2. alta- per analizzare i risultati sono necessari coloranti fluorescenti di qualità.

Il metodo FISH si basa su una reazione di ibridazione tra una sonda di DNA realizzata con particolari tecnologie, ovvero una sequenza nucleotidica di dimensioni limitate, e una porzione complementare del DNA nucleare del preparato citogenetico in esame. Sonda DNA - l'elemento principale per la stadiazione FISH porta un "tag", cioè contiene nucleotidi direttamente associati a un fluorocromo o aptene per un'ulteriore visualizzazione con anticorpi che trasportano un fluorocromo. Il DNA marcato non legato viene lavato via e quindi la sonda di DNA ibridata viene rilevata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

L'etichettatura del DNA è divisa in diretta e indiretta. Etichettatura diretta introduzione nel DNA di elementi reporter - - fluorocromi (rodamina, dietilamminocumarina, rosso del Texas, ecc.). Metodo di etichettatura indiretta - il campione di DNA viene pre-coniugato con ligandi intermedi (biotina, diossigenina, 2,4-dinitrofenolo), la cui presenza sul preparato citologico viene poi rilevata mediante fluorocromi. In questo caso, la sensibilità del metodo aumenta in modo significativo, poiché il ligando può contenere diversi siti per l'interazione con il fluorocromo. Per la prima volta l'ibridazione in situ con una sonda marcata con 32 P è stata descritta nel 1969. Lo sviluppo di sistemi non radioattivi per l'etichettatura e la rilevazione delle sonde del DNA ha reso il metodo di ibridazione in situ sicuro, semplice da implementare e meno laborioso nell'elaborazione dei risultati. I coloranti fluorescenti sono morbidi e facili da usare, possono essere conservati a tempo indeterminato, offrono un'alta risoluzione e consentono l'esame simultaneo di più sequenze di DNA.

Sonde: sonde marcate primarie/secondarie di DNA/RNA a singolo filamento/doppio filamento. Le sonde sono marcate: 1) direttamente: inserendo nucleotidi a cui è attaccato un fluorocromo (PCR o nick translation) 2) attraverso una molecola reporter (es: digossigenina, biotina) alla quale sono attaccati anticorpi marcati con fluorescenza. Per amplificare il segnale, è possibile utilizzare anticorpi secondari, terziari, ecc. etichettati con un'etichetta fluorescente. DNase nicks DNA Nick Translation La DNA polimerasi I aggiunge nuovi nucleotidi al 3' idrossile DNA polimerasi I rimuove le singole basi dall'estremità 5' Visualizzazione dei cromosomi: utilizzando DAPI (2 mg/ml). 4', 6-diamidino-2-fenilindolo; forte legame con regioni ricche di DNA AT; eccitazione da luce UV; emissione 461 nm (blu).

Attualmente, ci sono diversi approcci principali ampiamente utilizzati nella moderna citogenetica molecolare: Identificazione di materiale da regioni cromosomiche estese e interi cromosomi. Rilevazione di una specifica sequenza di DNA in una regione di interesse. Analisi dello squilibrio nelle singole regioni cromosomiche. Le sonde di DNA specifiche per cromosomi e regioni ("sonde per pittura") sono ampiamente utilizzate per identificare il materiale di regioni cromosomiche estese e interi cromosomi.

Caratteristiche dei vari tipi di sonde 1. Identificatori locus-specific (LSI - identificatori locus-specific, che si legano a determinate regioni dei cromosomi). Queste sonde vengono utilizzate per identificare la sequenza corta (non ripetitiva) disponibile di DNA isolato, che è utilizzato per preparare una sonda marcata e la sua successiva ibridazione con un set di cromosomi. Sono progettati per rilevare aberrazioni cromosomiche significative dal punto di vista diagnostico e prognostico in varie condizioni patologiche (monosomia e trisomia per singoli cromosomi). La più ampia distribuzione di questi campioni è stata ottenuta nella diagnostica citogenetica prenatale, in particolare negli studi sulle cellule del tessuto corionico, sui nuclei interfasici degli amniociti.

2. DNA - le sonde per le regioni telomeriche dei cromosomi (TEL telomericprobe) sono progettate per rilevare delezioni e riarrangiamenti che interessano le regioni terminali dei bracci dei cromosomi. Tali sonde sono specifiche per i bracci p o q dei cromosomi e sono complementari a una regione di circa 300 kb di lunghezza. dalla fine del cromosoma. Di norma, le sonde del DNA per i bracci corti e lunghi dei cromosomi sono associate a diversi fluorocromi, il che rende possibile identificare entrambe le regioni telomeriche del cromosoma su una preparazione citogenetica.

3. Le sonde centromeriche-ripetizioni, numeratori alfoidi o cromosomici (CEP - centromero. Enumerazione. Sonda) sono sonde di DNA cromosomiche specifiche, rappresentate da sequenze di ripetizioni satelliti tandem alfa e beta. Queste ripetizioni si trovano principalmente nelle regioni eterocromatine centromeriche o pericentromeriche dei cromosomi. Con il loro aiuto, ogni cromosoma può essere colorato in un colore diverso, il che consente di determinare rapidamente il numero di cromosomi e le deviazioni dal loro numero normale, 4. sonde per l'intero cromosoma, sonda per l'intero cromosoma (WCP - Whole-Chromosome-Painting sono un insieme) di piccole sonde, complementari alle singole parti del cromosoma, ma che generalmente ne coprono l'intera lunghezza. Utilizzando una libreria di tali sonde, è possibile "colorare" l'intero cromosoma e ottenere il cariotipo spettrale differenziale di un individuo. Questo tipo di analisi viene utilizzato per analizzare le aberrazioni cromosomiche, ad esempio le traslocazioni, quando un pezzo di un cromosoma viene trasferito sulla spalla di un altro.

Campi di applicazione FISH è ampiamente utilizzato per risolvere i seguenti compiti diagnostici clinici: 1. Perimpianto prenatale e diagnosi di anomalie cromosomiche. Viene utilizzato nelle cliniche di fecondazione in vitro (FIV) e nei centri perinatali. Consente di identificare tempestivamente (prima dell'impianto dell'embrione in caso di fecondazione in vitro o nelle prime fasi dello sviluppo fetale) i disturbi genetici nel nascituro e adottare le misure necessarie. 2. Oncoematologia. Le malattie oncoematologiche insorgono a causa di varie aberrazioni cromosomiche, pertanto vengono utilizzate sonde CEP e LSI appropriate per diagnosticarle. 3. Diagnosi di tumori solidi. Attualmente, si stabiliscono sempre più relazioni causali tra lo sviluppo di specifiche malattie oncologiche e specifici cambiamenti nel genoma. Pertanto, utilizzando sonde DNA appropriate, è possibile eseguire la diagnostica FISH oncologica.

Citogenetica interfase: Combinazione di FISH con altri metodi: - immunofenotipizzazione FISH (FICTION); + FICTION (Immunofenotipizzazione della fluorescenza e citogenetica interfase come strumento di indagine sulle neoplasie) - per lo studio delle cellule tumorali. Per questo test vengono utilizzati strisci non colorati di sangue, midollo osseo o altri preparati di tessuto. Fase 1 - le preparazioni vengono incubate con anticorpi monoclonali specifici, fase 2 - viene eseguita la coniugazione con fluorofori per la successiva visualizzazione del complesso antigene-anticorpo monoclonale. Fase 3: eseguire l'ibridazione in situ con sonde di DNA. Per rilevare gli anticorpi monoclonali e le sonde del DNA, vengono utilizzati fluorofori che differiscono nel colore. Lo studio del preparato al microscopio a fluorescenza in presenza del necessario set di filtri consente l'analisi simultanea dell'immunofenotipo dell'ibridazione e dei segnali nei nuclei in interfase.

Delezione cromosomica di TNFAIP 3 in c. HL rilevato dall'interfasecitogenetica. FICTION analisi di. rappresentante c. Casi HL che combinano. Espressione CD 30 (rosso) e sonde FISH per TNFAIP 3 e centromero del cromosoma 6 (blu [b]). Nei test a doppio colore in A – C ed E e F, la sonda TNFAIP 3 è etichettata in verde (g); nel saggio a triplo colore applicato in D, la sonda TNFAIP 3 fornisce un segnale g/arancio colocalizzato (co). Vengono utilizzate due diverse strategie per visualizzare i saggi FISH a doppio e triplo colore in combinazione con l'immunofluorescenza CD 30; io. e. , i dosaggi a doppio colore (A – C ed E e F) vengono visualizzati utilizzando un display a tre colori, mentre un falso display multicolore come ottenuto dal software Isis viene applicato per l'analisi a tre colori (D) per mostrare contemporaneamente quattro colori ( cioè, CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] e arancione e centromero del cromosoma 6 [b]).

La registrazione digitale di microimmagini ha aperto la possibilità di convertire non solo una combinazione di fluorofori in pseudocolori, ma anche il loro rapporto, intensità

Colorazione cromosomica multicolore (Muli. Color Banding - MCB) Questo metodo non è inteso per un'analisi completa di tutti i cromosomi, ma per un'analisi dettagliata di un singolo cromosoma. Le sonde del DNA specifiche per locus sono etichettate con diversi fluorofori o combinazioni di fluorofori in modo che il livello del segnale di ciascuna delle sonde del DNA vari di intensità. La sovrapposizione dei profili di intensità dei segnali dalle sonde del DNA fornisce variazioni nei rapporti delle intensità di fluorescenza di vari fluorofori lungo il cromosoma. I rapporti di intensità possono essere tradotti in pseudocolori, e, quindi, ogni punto dell'immagine, e quindi ciascuno dei loci cromosomici, avrà il proprio pseudocolore. Questa versione del metodo FISH multicolore si è dimostrata molto efficace nell'analisi non solo dei riarrangiamenti intercromosomici, ma anche intracromosomici nel cancro. Tuttavia, per la sua applicazione di successo, è necessario prima determinare il cromosoma che verrà esaminato. Questo metodo di citogenetica molecolare è adatto per l'analisi delle anomalie del cariotipo associate a determinati cromosomi.

Ad oggi, sono stati creati set di sonde di DNA che forniscono MSV per tutti i cromosomi umani Banding multicolore del quinto cromosoma umano (illustrazione Meta. Systems Gmb. H) (ibridazione in situ di librerie di DNA specifiche per regione del cromosoma 5; profili di segnale di librerie di DNA specifiche per regione sul cromosoma 5; bande multicolori del cromosoma 5; idiogramma del cromosoma 5; fluorocromi usati per MCV).

La citogenetica della metafase, storicamente emersa prima dell'interfase, consente di determinare un'ampia gamma di anomalie cromosomiche, ma per questo è necessario che le cellule oggetto di studio siano allo stadio della metafase meiotica.

Cariotipizzazione multicolore L'analisi viene eseguita utilizzando sonde a DNA per la colorazione continua delle braccia o di interi cromosomi (sonde WCP - vernice cromosomica intera). Tali sonde si ibridano a numerose brevi sequenze di DNA situate lungo l'intera lunghezza del cromosoma. Pertanto, se esaminato al microscopio a fluorescenza, il cromosoma appare uniformemente colorato in un determinato colore.

Le sonde del DNA utilizzate per questa analisi sono costituite da una miscela di sonde di colorazione solide per un set completo di cromosomi umani, etichettati utilizzando una combinazione di diversi fluorocromi, il cui rapporto è selezionato individualmente per ciascuna coppia di cromosomi. L'uso di appropriati metodi di registrazione e programmi informatici per l'analisi dell'immagine, valutando l'intensità della luminescenza di tutti i fluorocromi per ogni punto dell'immagine, consente di effettuare il cariotipo, in cui ogni coppia di cromosomi ha il suo "pseudocolore" unico .

M-FISH (multitarget multifluor multicolor o multiplex. FISH) è il nome generico del tradizionale FISH multicolore che utilizza kit di filtri specifici per fluorocromi. Il principio di M-FISH consiste nella registrazione digitale separata del segnale di tutti i fluorocromi utilizzati, che si ottiene mediante la successiva sostituzione dei set di filtri. Tutte le immagini sono registrate in file separati, il che consente la loro elaborazione efficiente associata alla separazione del segnale e dello sfondo, nonché alla valutazione quantitativa del segnale. L'elaborazione di tutte le informazioni registrate utilizzando un software speciale traduce le informazioni sul livello dei segnali del fluorocromo in ogni punto dell'immagine in pseudo colori. Uno dei principali limiti del numero di sonde di DNA utilizzate è il numero di fluorocromi disponibili, con spettri di eccitazione ed emissione non sovrapposti, e la disponibilità di set di filtri appropriati.

FISH a 24 colori M-FISH è ampiamente utilizzato come FISH a 24 colori per l'identificazione simultanea di materiale da tutti i cromosomi umani. È altamente efficace nel rilevare le traslocazioni cromosomiche, ma non è progettato per rilevare delezioni e inversioni. Tuttavia, questo problema può essere parzialmente risolto dalla colorazione simultanea dei cromosomi con DAPI, che consente di analizzare la striatura differenziale dei cromosomi, la cui affiliazione cromosomica del materiale è già stata identificata. Sfortunatamente, va notato che la qualità della banda DAPI dei cromosomi dopo M-FISH è significativamente inferiore alla colorazione differenziale GTG e persino alla banda DAPI dopo l'ibridazione in situ convenzionale.

Rx. FISH Il principio M-FISH è stato utilizzato per generare il codice a barre multicolore dei cromosomi umani e il metodo di banding cromosomico multicolore basato sull'ibridazione interspecie in situ. A differenza del FISH a 24 colori, questo metodo consente di rivelare direttamente alcuni dei riarrangiamenti intracromosomici. Sonde di DNA utilizzate in Rx. I FISH sono etichettati con una combinazione di 3 fluorocromi, risultando in 7 pseudo colori. Colorano specificamente le singole regioni dei cromosomi, creando la loro striatura di colore. Questa è una caratteristica delle sonde DNA per Rx. I FISH sono determinati dal modo in cui vengono ottenuti. Sono librerie di DNA cromosomiche specifiche di due specie di gibboni: Hylobates concolor e Hylobates syndactylus.

Come risultato degli intensi riarrangiamenti cromosomici avvenuti durante la formazione delle moderne specie di gibboni, il materiale dei loro cromosomi si è rivelato fortemente mischiato rispetto all'organizzazione dei cromosomi nell'uomo, i cui cromosomi sono noti per il loro conservatorismo. Il rapporto tra il cromosoma umano 1 e i cromosomi del gibbone è mostrato nella Figura 1,

La Figura 2 mostra una vista generale dei cromosomi umani ottenuti come risultato di Rx. PESCE. a) Piastra metafase b) Disposizione dei cromosomi.

Tuttavia, RXFISH ha limitazioni piuttosto serie: i riarrangiamenti cromosomici che hanno avuto luogo all'interno di una banda RX di un colore non possono essere rilevati utilizzando questo metodo se non portano a cambiamenti significativi e facilmente visibili nella dimensione di questa banda. - le sonde colorano diverse regioni cromosomiche di diversi cromosomi in uno pseudo colore. Tuttavia, con l'aumentare del numero di fluorocromi utilizzati, il metodo RXFISH sarà senza dubbio più informativo rispetto al normale FISH a 24 colori.

I vantaggi di RXFISH attualmente includono i seguenti punti: Il metodo consente l'analisi dell'intero genoma umano in un esperimento FISH multicolore. Sono disponibili in commercio kit di sonde di DNA etichettate e i sistemi di rilevamento richiesti. Il metodo consente una rapida identificazione di una parte significativa dei riarrangiamenti intra e intercromosomici. È possibile l'identificazione automatica dei cromosomi in metafase “color banding”. C'è un codice a barre colore univoco per ogni cromosoma umano. RXFISH è integrato nella workstation Cyto. Sistemi di visione e microscopia a fluorescenza standard.

Cariotipizzazione spettrale (SKY-spectralkaryotyping) I principi di base dell'analisi delle immagini microscopiche nel cariotipo spettrale praticamente non differiscono da quelli utilizzati in M-FISH. Le differenze sono legate al modo in cui l'immagine è registrata. La tecnologia SKY consente una misurazione per ottenere curve spettrali per tutti i punti dell'immagine, indipendentemente dal fatto che sia correlata all'epifluorescenza o alla microscopia ottica tradizionale. Per il cariotipo spettrale di tutti i cromosomi umani vengono utilizzati cinque fluorocromi, uno nello spettro verde, due nel rosso e due nell'infrarosso. L'eccitazione e l'emissione di tutti i fluorocromi utilizzati per l'etichettatura delle sonde del DNA avviene con un set di filtri, che evita il loro cambiamento sequenziale, la messa a fuoco intermedia e, di conseguenza, i problemi associati, come lo spostamento dell'immagine spaziale, la determinazione dei valori di soglia e le maschere di segmentazione ... Sulla base dell'analisi delle curve spettrali, viene determinata la presenza o l'assenza di fluorocromi specifici in un dato punto.

Il passaggio successivo è la procedura di classificazione, che consente di determinare in modo diretto e univoco l'identità cromosomica del materiale analizzato. Ciò garantisce un'identificazione affidabile (fino all'accuratezza cromosomica) del materiale dei cromosomi marcatori, nonché dei derivati cromosomici risultanti da vari riarrangiamenti. Il grande vantaggio di SKY è che il colore DAPI viene registrato parallelamente all'immagine spettrale. Il miglioramento del software di banding DAPI consente di ottenere una striatura differenziale di qualità vicina al banding GTG. La possibilità di un'analisi parallela dell'immagine spettrale e della colorazione differenziale qualitativa dei cromosomi semplifica notevolmente l'interpretazione dei risultati SKY e consente di determinare con maggiore precisione i punti di rotture cromosomiche. Gli indubbi vantaggi di SKY includono la possibilità di utilizzare fluorocromi con eccitazione e spettri di emissione sovrapposti, che amplia notevolmente l'elenco dei fluorocromi idonei e aumenta anche il numero di fluorocromi che possono essere utilizzati contemporaneamente. La quotazione di un nuovo fluorocromo non richiede l'acquisto di un nuovo set di filtri, poiché per SKY è sufficiente un blocco filtro per FISH spettrale e un blocco filtro per DAPI.

Gli svantaggi di SKY includono: - tempi di esposizione lunghi, necessari per la registrazione di immagini microscopiche. - SKY è un po' meno efficace di M-FISH quando è necessario condurre studi con sonde di DNA relativamente piccole.

Cariotipizzazione a variazione cromatica Questo metodo si basa sull'analisi della differenza di lunghezza del segnale tra campioni di DNA ibridati con sonde di DNA legate a fluorocromi e con sonde di DNA portatrici di anticorpi. Il metodo è fattibile con solo 3 filtri e non richiede fotocamere e software speciali. Per identificare i cromosomi, viene eseguita un'ibridazione e si ottengono due immagini. Il metodo si basa sulla differenza nella lunghezza del segnale fluorescente, poiché il tempo di esposizione dei campioni di DNA legati agli anticorpi è dell'80 - 90% inferiore a quello dei campioni legati ai fluorocromi. Dopo la reazione di ibridazione, gli strisci vengono esposti ai corrispondenti anticorpi primari, e quindi visualizzati, ottenendo la prima immagine. Quindi le preparazioni vengono esposte ad anticorpi secondari e avidina legata agli stessi fluorocromi. I tratti possono essere controcolorati utilizzando DAPI.

In futuro si ottengono nuovamente le immagini delle preparazioni, utilizzando a turno 3 filtri. Queste immagini vengono confrontate utilizzando un software speciale e si ottiene una seconda immagine, in cui saranno visibili solo i cromosomi associati a determinati anticorpi. Pertanto, alcuni cromosomi emetteranno fluorescenza solo nella prima o nella seconda immagine, mentre altri cambieranno colore in immagini diverse.

Ibridazione genomica comparativa (CGH) Il metodo è stato sviluppato per rilevare anomalie quantitative nel genoma. Si basa su una reazione di ibridazione in situ che utilizza l'intero genoma come sonda di DNA. Il DNA del donatore isolato e normale viene etichettato con fluorocromi di diversi colori, convertendoli così in sonde di DNA. Quantità equivalenti di queste sonde vengono miscelate e utilizzate nell'ibridazione con una preparazione citogenetica di controllo. Dopo FISH, le metafasi vengono analizzate su un microscopio a fluorescenza e l'intensità di fluorescenza di due fluorocromi lungo l'intera lunghezza di ciascun cromosoma viene determinata utilizzando un programma di analisi delle immagini del computer specializzato.

In assenza di variazioni quantitative nel cariotipo del campione in esame, si osserverà un certo rapporto dell'intensità di luminescenza dei due fluorocromi. In caso di amplificazione genica, l'intensità del segnale del corrispondente fluorocromo aumenterà, e in caso di perdita di una parte del materiale genetico, al contrario, si indebolirà. Pertanto, CGH consente di rilevare squilibri genomici, ma questo metodo non può essere utilizzato per rilevare traslocazioni e inversioni bilanciate e le trisomie e le delezioni possono essere determinate solo se la dimensione della regione sbilanciata è di almeno 10 milioni di paia di basi.

Lo squilibrio cromosomico in un campione del test viene valutato dalla differenza nell'intensità della fluorescenza di due diversi fluorocromi calcolando il rapporto di fluorescenza (FR).

Il metodo CGH presenta una serie di vantaggi rispetto ad altri metodi per analizzare i cambiamenti del genoma: in primo luogo, non dipende dalla fonte del materiale oggetto di studio e può essere eseguito con successo con una piccola quantità di DNA testato, compreso il materiale d'archivio. In secondo luogo, consente di ottenere informazioni dettagliate sulla perdita o sull'aumento del numero di copie di materiale genetico in tutto il genoma in un esperimento. In terzo luogo, il metodo CGH non richiede la preparazione di preparati di cromosomi in metafase dal tessuto in studio, cioè non dipende dal processo di coltivazione cellulare e dai relativi artefatti.

L'ibridazione in situ genomica in (GISH) è una variante del metodo di ibridazione in situ, che consiste nel fatto che per l'ibridazione con campioni fissati, il DNA genomico totale di una specie di organismo viene utilizzato come sonda fluorescente, con la quale il DNA genomico totale Il DNA di un'altra specie di organismo compete; utilizzato per determinare differenze interspecie e intraspecifiche nei genomi, riarrangiamenti cromosomici, delezioni e sostituzioni.

Variazioni FISH 1) Q-FISH - FISH quantitativo: Sviluppato da Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward e P. M. Lansdorp. 1998. Telomeri corti sul cromosoma umano 17 p. Naz. Genet. 18: 76-80. Metodo quantitativo. Progettato per applicazioni di citometria a flusso. Originariamente era usato per misurare la lunghezza dei cromosomi (risoluzione: 200 bp) contando il numero di ripetizioni telomeriche. Vengono utilizzate sonde coniugate con PNA. Inizialmente, abbiamo studiato i cromosomi in metafase (QFISH stesso), ora questo metodo è applicabile ai cromosomi in interfase (IQ-FISH). Q-FISH viene eseguito su colture cellulari, sezioni di tessuto (entrambe su vetrini). Attualmente, Q-FISH è uno strumento importante nello studio del ruolo dei telomeri nell'invecchiamento e nel cancro.

PNA-FISH - Acidi peptide nucleici FISH: Gli acidi peptidico nucleici (PNA) sono analoghi sintetici del DNA in cui la struttura zuccherina del desossiribosio fosfato che supporta la base azotata è sostituita con una struttura peptidica non caricata. Come risultato di questa struttura: quando la sonda oligomerica del PNA si ibrida con il DNA/RNA complementare, non si verifica la repulsione elettrostatica. I duplex PNA-DNA (PNA-RNA) sono molto più stabili degli omo/eteroduplex naturali. Elevata specificità del legame PNA-DNA: l'ibridazione PNA-DNA è molto più sensibile per il disadattamento della coppia di basi rispetto all'ibridazione DNA-DNA. Pertanto, utilizzando una sonda PNA, è possibile distinguere tra due ripetizioni centromeriche che differiscono solo per una coppia di basi. Il PNA è relativamente idrofobo (rispetto al DNA), il che significa che il PNA si diffonde meglio attraverso le pareti cellulari => uso diffuso in microbiologia. Basato sull'elevata specificità del legame: si ritiene che la tecnologia PNA diventerà presto la base per la creazione di sonde allele-specifiche per l'ibridazione in situ. È utilizzato in genetica, citogenetica, epigenetica, microbiologia, ecc.

3) Flow-FISH - FISH per citometria a flusso: Proposto nel 1998: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM Dinamica della lunghezza dei telomeri in sottopopolazioni di linfociti umani misurata mediante citometria a flusso. Biotecnologie naturali. 16, 743-747 (1998). Combinazione di Q-FISH e citometria a flusso per analizzare (misurare) il segnale e ordinare. Per il flow-FISH, vengono utilizzate una sospensione cellulare (per misurare la lunghezza dei telomeri cromosomici), spread cromosomici e cromosomi isolati (per ulteriore mappatura). Come in Q-FISH, vengono utilizzate sonde telomeriche marcate con PNA (ad esempio, per la visualizzazione e la misurazione della lunghezza della ripetizione telomerica).Il vantaggio principale è il metodo più veloce (analisi/smistamento di un gran numero di cellule/cromosomi). È ampiamente utilizzato per studiare vari problemi: invecchiamento, conservazione dei telomeri, studio delle sospensioni di cellule staminali emotopoietiche ex vivo, studio dei batteri.

L'analisi multiparametrica consente la differenziazione dei tipi di cellule all'interno di un campione, consentendo il controllo interno e l'analisi dei sottotipi di leucociti.

Vantaggi di flow-FISH: Risultato facilmente riproducibile Capacità di analizzare sottogruppi di cellule in una popolazione utilizzando immunofluorescenza fisica e marcatori Prestazioni migliori rispetto a Q-FISH Capacità di quantificare la fluorescenza di migliaia di cellule.

STUDIO DEI CROMOSOMI DISTACCATI utilizzando metodi di citometria a flusso 1. Ordinamento dei cromosomi mediante citometria a flusso - Il cariotipo mediante citometria a flusso viene utilizzato per mappare ulteriormente i geni e costruire librerie di cromosomi. - L'identificazione e la localizzazione dei geni sui cromosomi ordinati viene effettuata con la successiva applicazione di metodi FISH/PRINS (primed in situ labelling) o sue variazioni e PCR cromosoma-specifica. - Entro il 2011, solo i cromosomi di 17 specie di piante coltivate sono stati selezionati con successo finora. - Smistamento di cromosomi in metafase o pachitene con un alto indice di divisione.

Etichetta fluorescente: - I cromosomi sono etichettati con fluorocromi specifici per gli acidi nucleici. - I fluorocromi sono selezionati in base a 1) specificità per le basi azotate, 2) condizioni sperimentali (incluso tenendo conto delle lunghezze d'onda dei laser disponibili). 1. Per l'analisi monovariante, utilizzare vernici non specifiche per i vapori AT o GC: ioduro di propidio (picco di eccitazione: 535 nm, emissione: 617 nm, laser richiesto: laser ad argon da 488 nm o lampada + filtro a passaggio lungo) bromuro di etidio ( picchi di eccitazione: 300 e 520 nm, emissione: 600 nm, laser richiesto: 488 nm-argon laser o lampada + filtro passa-lungo) Questi tag colorano il DNA indipendentemente dal contenuto di A, G, T o basi di azoto. 2. Per l'analisi bivariata utilizzare: cromomicina (specifica per coppie di basi G-C), eccitazione di picco A 3: 458 nm, emissione 580 nm. Laser:, 458 nm minimo 400 m.V di potenza. Hoechst 33258 (specifico per coppie di basi AT), eccitazione: 351 -364 nm, emissione: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (potente). I laser devono essere separati nel tempo e nello spazio a causa della parziale sovrapposizione degli spettri del fluorocromo.

2. Studio delle sequenze cromosomiche/nucleotidiche dopo lo smistamento (per costruire mappe fisiche e genetiche, ecc.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Studio di grandi genomi con cromosomi lunghi. Mappatura di sequenze con un elevato numero di ripetizioni (es: regioni telomeriche e centromeriche). Uso di sonde corte. A causa dell'elevato numero di ripetizioni, il segnale è forte. Dimensioni della sonda standard: da 15 a 30 nucleotidi. PESCE

Problemi FISH: È difficile localizzare sequenze di DNA a locus singolo (cioè sequenze di DNA uniche non ripetitive) poiché il segnale sarà molto debole quando si utilizzano sonde corte standard. L'aumento della lunghezza della sonda a diverse kilobasi per amplificare il segnale porterà a una diminuzione della sensibilità e => a un legame non specifico. Soluzione: BAC-FISH -BAC-FISH - una combinazione del metodo FISH e l'uso di cloni di DNA genomico incorporati in cromosomi artificiali batterici (BAC), che consente l'inserimento di grandi sequenze di DNA. -Metodo efficace per identificare e mappare i singoli cromosomi di organismi con piccoli genomi. Le sonde BAC, overgos (oligonucleotidi sovrapposti) vengono utilizzate come sonda.

Alternativa al FISH: PRINS PRINS (primed in situ labelling) è un metodo per etichettare i cromosomi mediante la ricottura di un primer di DNA oligonucleotidico con una sequenza omologa di DNA cromosomico denaturato e successiva estensione enzimatica del primer in situ con nucleotidi marcati. Descritto per la prima volta da Koch et al. nel 1989 (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N. e Bolund, I. (1989) Metodi di innesco degli oligonucleotidi per l'etichettatura cromosomica specifica del DNA satellite alfa in situ. Cromosoma 98, 259 -265). PRINS è un'alternativa al PESCE. Viene utilizzato per la localizzazione di sequenze nucleotidiche, il riconoscimento e il conteggio di cromosomi in metafase o interfase o coppie cromosomiche (inclusa l'aneuploidia cromosomica). ricottura di un primer non marcato (primer - primer) con il DNA in esame allungamento del primer mediante DNA polimerasi termostabile e nucleotidi marcati arresto della reazione (attaccamento di una molecola bloccante all'estremità 3 ') Primer: frammento di restrizione prodotto della PCR oligonucleotide Etichettatura di nucleotidi: diretto - indiretto (biotina/dig avidina coniugata con fluorocromo/anti-dig) - Solo una coppia di cromosomi omologhi (un cromosoma) può essere identificata nei risultati di ciascuna reazione PRINS. La successiva reazione PRINS sullo stesso vetro può essere eseguita solo dopo aver bloccato la precedente. - Adatto per sequenze di DNA con un gran numero di ripetizioni.

Vantaggi di PRINS: 1. Sono richieste informazioni sulla sequenza minime necessarie per sintetizzare un primer oligonucleotidico. 2. Il metodo più rapido e semplice per rilevare la sequenza di interesse sul cromosoma (rispetto all'uso di sonde pesanti per FISH, ibridando per un periodo di tempo molto lungo). 3. Eliminazione della fase di tagging della sonda. 4. Capacità di allungare il primer con nucleotidi marcati per migliorare il segnale c-PRINS quando si rilevano brevi sequenze uniche. Per rilevare ripetizioni a bassa copia o brevi sequenze uniche, viene utilizzato un metodo più sensibile: PRINS ciclico (c -PRINS). C-PRINS proposto da Gosden et al. nel 1991, un protocollo migliorato ampiamente utilizzato da Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localizzazione di sequenze di DNA sui cromosomi vegetali utilizzando PRINS e C-PRINS. Metodi in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS include una serie di cicli termici simili alla PCR.

Guaina fluida per FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Citometria a flusso e FISH per misurare la lunghezza media dei telomeri (FISH a flusso). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 - 2376) -40 mt. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting dei cromosomi mitotici nel frumento tenero (Triticum aestivum L.). Genetica. 2000; 156 (4): 2033-41) -Mg ... So 4 tampone senza ditiotreitolo (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Cromosomi ordinati per flusso: un materiale fine per la mappatura fisica dei geni delle piante. Caryologia. 2006, vol. 59, n. 2: 99-103 ) -autoclavato 0,1% (peso/vol) Na. Cl -50 m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170 (2) 823 -829) - Tampone di poliammina stabilizzante cromosoma (fluido guaina contenente proteine) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Ibridazione a fluorescenza in situ

Ibridazione fluorescente sul posto , o il metodo FISH (ing. Fluorescenza sul posto ibridazione - FISH ) è un metodo citogenetico utilizzato per rilevare e determinare la posizione di una specifica sequenza di DNA sui cromosomi in metafase o nei nuclei in interfase sul posto... Inoltre, FISH viene utilizzato per rilevare mRNA specifici in un campione di tessuto. In quest'ultimo caso, il metodo FISH consente di stabilire le caratteristiche spazio-temporali dell'espressione genica nelle cellule e nei tessuti.

sonde

Con ibridazione fluorescente sul posto utilizzare sonde DNA (sonde DNA) che si legano a bersagli complementari nel campione. Le sonde del DNA contengono nucleosidi marcati con fluorofori (marcatura diretta) o coniugati come biotina o digossigenina (marcatura indiretta). Con l'etichettatura diretta, la sonda del DNA legata al bersaglio può essere osservata con un microscopio a fluorescenza subito dopo il completamento dell'ibridazione. Nel caso dell'etichettatura indiretta, è necessaria un'ulteriore procedura di colorazione, durante la quale la biotina viene rilevata utilizzando avidina o steptavidina marcate con fluorescenza e digossigenina utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza. Sebbene la versione indiretta dell'etichettatura delle sonde del DNA richieda reagenti aggiuntivi e dispendio di tempo, questo metodo di solito consente di ottenere un livello di segnale più elevato a causa della presenza di 3-4 molecole di fluorocromo sull'anticorpo o sulla molecola di avidina. Inoltre, nel caso di etichettatura indiretta, è possibile un'amplificazione a cascata del segnale.

Per creare sonde di DNA, vengono utilizzate sequenze di DNA clonate, DNA genomico, prodotti di reazione PCR, oligonucleotidi marcati e DNA ottenuto mediante microdissezione.

La marcatura della sonda può essere eseguita in diversi modi, ad esempio mediante traduzione di nick o mediante PCR con nucleotidi marcati.

Procedura di ibridazione

Schema dell'esperimento di ibridazione fluorescente sul posto per localizzare la posizione del gene nel nucleo

Nella prima fase, avviene la progettazione delle sonde. La dimensione della sonda dovrebbe essere sufficientemente grande da consentire l'ibridazione in un sito specifico, ma non troppo grande (non più di 1000 bp) in modo da non interferire con il processo di ibridazione. Quando vengono identificati loci specifici o quando vengono colorati interi cromosomi, è necessario bloccare l'ibridazione delle sonde di DNA con sequenze ripetute di DNA non univoche aggiungendo ripetizioni di DNA non etichettate (ad esempio, DNA Cot-1) alla miscela di ibridazione. Se la sonda del DNA è DNA a doppio filamento, deve essere denaturata prima dell'ibridazione.

Nella fase successiva, vengono preparate le preparazioni di nuclei interfase o cromosomi in metafase. Le cellule vengono fissate su un substrato, solitamente su un vetrino, e quindi il DNA viene denaturato. Per preservare la morfologia dei cromosomi o dei nuclei, la denaturazione viene effettuata in presenza di formammide, che consente di ridurre la temperatura di denaturazione a 70°.

Le sonde di DNA legate vengono visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza. L'intensità del segnale fluorescente dipende da molti fattori: l'efficienza dell'etichettatura con una sonda, il tipo di sonda e il tipo di colorante fluorescente.

Letteratura

Rubtsov N.B. Metodi per lavorare con i cromosomi dei mammiferi: libro di testo. manuale / Novosib. stato un-t. Novosibirsk, 2006.152 p.

Rubtsov N.B. Ibridazione dell'acido nucleico sul posto nell'analisi delle anomalie cromosomiche. Capitolo nel libro "Introduzione alla diagnostica molecolare" T. 2. "Metodi genetici molecolari nella diagnosi delle malattie ereditarie e oncologiche" / Ed. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaeva. Letteratura didattica per studenti delle università di medicina. M.: Medicina, 2011. T. 2. S. 100-136.

Note (modifica)

Fondazione Wikimedia. 2010.

Guarda cos'è l'ibridazione a fluorescenza in situ in altri dizionari:

Questo termine ha altri significati, vedi ibridazione. Ibridazione del DNA, ibridazione dell'acido nucleico in vitro combinazione di acidi nucleici a filamento singolo complementari in una molecola. Con completa complementarità ... ... Wikipedia

Metodo di determinazione ibridazione fluorescente in situ.

Materiale di studio Vedi la descrizione

Possibilità di visita domiciliare

Lo studio viene utilizzato per selezionare la chemioterapia adiuvante individuale per il cancro al seno o il cancro allo stomaco.

Il cancro al seno (BC) è al primo posto tra le malattie oncologiche nelle donne. Le cellule del tumore al seno possono contenere diversi tipi di recettori sensibili a determinate sostanze (ormoni o altre molecole biologicamente attive). A seconda della presenza di recettori ormonali (estrogeni e progesterone) o del recettore del fattore di crescita epidermico umano di tipo 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2) nelle cellule tumorali, vengono isolati il carcinoma mammario positivo per il recettore ormonale, HER2-positivo e triplo negativo. È importante tenerne conto nella selezione individuale della terapia e prevedere il successo del trattamento.

HER2 è un recettore presente nei tessuti e che normalmente partecipa alla regolazione della divisione e differenziazione cellulare. Il suo eccesso sulla superficie delle cellule tumorali (sovraespressione) predetermina la rapida crescita incontrollata della neoplasia, un alto rischio di metastasi e una bassa efficienza di alcuni tipi di trattamento. La sovraespressione di HER2 in alcuni sottotipi di cancro al seno porta ad un aumento della proliferazione e dell'angiogenesi, nonché alla disregolazione dell'apoptosi (autodistruzione cellulare geneticamente programmata). Attualmente, ci sono farmaci che prendono di mira il recettore HER2. Si tratta, in particolare, di Herceptin (trastuzumab), che è un anticorpo monoclonale contro i recettori HER2/neu.

L'amplificazione e la sovraespressione dell'oncogene HER2 (ErbB-2) sono eventi relativamente specifici per il carcinoma mammario e praticamente non si verificano in tumori di altre localizzazioni. Il cancro dello stomaco (GC) è una delle poche eccezioni: l'attivazione di HER2 si osserva in circa il 10-15% dei casi di neoplasie maligne di questo organo e si correla con il decorso aggressivo della malattia. Nel carcinoma mammario HER2-positivo, potrebbe esserci un eccesso di recettori HER2 sulla superficie delle cellule tumorali (denominato HER2-positivo o Hercept-positivo). Questo fenomeno è osservato nel 15-20% delle donne con cancro al seno. La valutazione dello stato di HER2 è importante per determinare le tattiche di trattamento.

I principali metodi standardizzati per rilevare la sovraespressione di HER2/neu e/o l'amplificazione del gene HER2/neu sono il metodo immunoistochimico (IHC) e l'ibridazione a fluorescenza in situ (FISH). Entrambi gli studi sono condotti su preparati istologici (sezioni di materiale tumorale incluse in paraffina) utilizzando anticorpi policlonali (IHC), sonde fluorescenti (FISH) e vari sistemi di imaging.

Quando si valutano i risultati della reazione IHC, viene presa in considerazione l'espressione solo nella componente invasiva del tumore. La valutazione dei risultati della reazione viene eseguita utilizzando una scala a punti: 0, 1+, 2+, 3+, sviluppata dal produttore del test e che ha ricevuto l'approvazione di esperti. Lo stato di Hercept, valutato come 0 e 1+, dovrebbe essere considerato negativo - non c'è sovraespressione della proteina, che è correlata alla mancanza di amplificazione del suo gene. Lo stato di Hercept, valutato come 3+, è positivo, cioè è presente una sovraespressione proteica, che è coerente con la presenza di amplificazione genica. Lo stato di Hercept 2+ è considerato incerto, cioè, dall'espressione della proteina determinata sulla base di una reazione immunoistochimica, è impossibile giudicare con sicurezza l'amplificazione del gene, pertanto è necessario uno studio che riveli direttamente la presenza o assenza di amplificazione. Il metodo FISH viene utilizzato su sezioni dello stesso campione (blocco) su cui è stato eseguito lo studio immunoistochimico. Nell'ibridazione FISH, la valutazione della presenza di amplificazione del gene HER2 viene effettuata calcolando il rapporto tra segnali fluorescenti rossi (corrispondenti ai geni HER2 marcati) e fluorescenti verdi, che marcano la regione centromerica del 17° cromosoma. Un rapporto maggiore di 2 indica la presenza di amplificazione HER2. FISH è più sensibile dell'IHC, in quanto consente la valutazione diretta della presenza o assenza di amplificazione.

Materiale per la ricerca: blocco di paraffina con biopsia tumorale.

Attenzione! NECESSARIAMENTE:

Vetrino HER2 / neu IHC
un rinvio da un medico o una dimissione con i risultati degli studi istologici e IHC con anticorpi contro Her-2/neu

Letteratura

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