Fluoreszcens in situ hibridizáció. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)

Egyes esetekben a citogenetikai vizsgálat nem elegendő a kariotípus megállapításához, ezekben az esetekben molekuláris citogenetikai módszereket alkalmaznak, különösen fluoreszcens in situ hibridizációt (angolul - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

A molekuláris citogenetika új, elsősorban a nukleinsavak in situ hibridizációján alapuló technológiáinak megjelenése jelentősen kibővítette a kromoszómadiagnosztika lehetőségeit. Az in situ hibridizációs módszert a specifikus DNS-szekvenciák közvetlen citológiai preparátumokon történő lokalizálására fejlesztették ki. A kromoszómák és kromoszómális régiók azonosításában átmenet történt a kromoszóma citológiai szerveződésének elemzésétől az őket alkotó DNS-szekvenciák elemzéséig. A kromoszóma-átrendeződések kimutatására és elemzésére szolgáló klasszikus citológiai módszerek – például a kromoszómák differenciális festődése – hatékonyságának összehasonlítása a modern molekuláris citogenetikai technológiákkal azt mutatta, hogy hematológiai rendellenességek esetén a kromoszómák citológiai analízise a kromoszóma-átrendeződések körülbelül egyharmadát észleli és azonosítja helyesen. spektrális kariotipizálás (SKY) segítségével. Az átrendeződések körülbelül egyharmada citológiai módszerekkel helytelenül azonosítható, egyharmada pedig teljesen észrevétlen marad. A citogenetikai elemzés klasszikus módszerei a SKY által azonosított kromoszóma-átrendeződéseknek csak körülbelül 15%-ának kimutatását teszik lehetővé.

A FISH-módszer fluoreszcens molekulákat használ a gének vagy kromoszómák in vivo megfestésére. A módszert géntérképezésre és kromoszóma-rendellenességek azonosítására használják.

A technika rövid DNS-szekvenciák, úgynevezett próbák elkészítésével kezdődik, amelyek komplementerek a vizsgálat tárgyát képező DNS-szekvenciákkal. A próbák komplementer DNS-régiókhoz hibridizálnak (kötődnek), és mivel fluoreszcens jelöléssel vannak megjelölve, lehetővé teszik a számunkra érdekes gének lokalizációját a DNS-ben vagy a kromoszómákban. Ellentétben más, aktív sejtosztódást igénylő kromoszómák vizsgálati módszereivel, a FISH nem osztódó sejteken is elvégezhető, így a módszer rugalmassá válik.

A FISH különféle célokra alkalmazható három különböző típusú szondával:

* lokuszspecifikus próbák, amelyek a kromoszómák bizonyos részeihez kötődnek. Ezeket a próbákat az izolált DNS rendelkezésre álló rövid szekvenciájának azonosítására használják, amelyet jelölt próba előállítására, majd kromoszómakészlettel történő hibridizációjára használnak;
* Az alfa vagy centromer ismétlődő próbák a kromoszómák centromer régióinak ismétlődő szekvenciái. Segítségükkel minden kromoszóma más színűre festhető, ami lehetővé teszi a kromoszómák számának és a normál számtól való eltérésének gyors meghatározását;
* A teljes kromoszómára vonatkozó szondák kis próbák halmaza, amelyek komplementerek a kromoszóma egyes részeihez, de általában lefedik annak teljes hosszát. Az ilyen szondák könyvtárának felhasználásával a teljes kromoszómát "színezhetjük", és az egyén differenciális spektrális kariotípusát kaphatjuk meg. Ezt a fajta elemzést a kromoszóma-rendellenességek, például transzlokációk elemzésére használják, amikor az egyik kromoszóma egy darabja átkerül a másik karjába.

Fluoreszcens címkével ellátott in situ hibridizáció (FISH)

A vizsgálat anyaga vér, csontvelő, tumorbiopszia, placenta, magzati szövetek vagy magzatvíz. Az elemzésre szánt mintákat frissen kell a laboratóriumba szállítani. A preparátumokat (lemezeket) közvetlenül szövetmintákból vagy tenyésztésük után készítik. Metafázisú és interfázisú sejtpreparátumok egyaránt használhatók. A fluoreszcens jelölésekkel jelölt specifikus DNS-próbák hibridizálnak a kromoszómális DNS-sel, és több szonda is használható egyidejűleg különböző lókuszokban.

A FISH a citogenetikai elemzés hasznos és érzékeny módszere a kvantitatív és kvalitatív kromoszóma-rendellenességek, például deléciók (beleértve a mikrodeléciókat), transzlokációk, megkettőződések és aneuploidia kimutatására. Az interfázisú kromoszómákon végzett FISH gyors módszer a 21-es, 18-as vagy 13-as triszómia vagy nemi kromoszóma-rendellenességek prenatális diagnosztizálására. Az onkológiában a FISH számos hematológiai rosszindulatú daganathoz kapcsolódó transzlokációt (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1) képes kimutatni. A módszer felhasználható a kemoterápia és a csontvelő-transzplantáció utáni rák maradványhatásainak monitorozására, valamint egyes daganatok rossz prognózisához kapcsolódó fokozott onkogének (c-myc/n-myc) kimutatására is. A FISH-t az ellenkező nemű egyedtől kapott csontvelő-allograft túlélésének monitorozására is használják.

A FISH egy érzékeny módszer a kromoszóma-rendellenességek azonosítására és nagy (> 500) sejtszám egyszerre történő gyors elemzésére. A módszer rendkívül pontos a kromoszómák természetének és a kromoszómális DNS ismeretlen fragmentumainak azonosításában.

Hagyományos citogenetika a kariotípus tanulmányozása során mindig a felbontás sávszintje korlátozta. Még a kromoszómák nagy felbontású differenciális festése esetén is csak több sávot találtunk kromoszómánként, de nem voltunk biztosak abban, hogy elérjük a felbontás molekuláris szintjét. A DNS-technológia és a citogenetika közelmúltbeli fejlődése lehetővé tette a FISH-módszerek alkalmazását a kromoszómális DNS-ben bekövetkező változások molekuláris szintű elemzésére. A molekuláris citogenetika forradalmi áttörést hozott a citogenetikában, lehetővé téve:

A kromoszómák DNS szerkezetének elemzése 10-100 kilobázis tartományban;
nem osztódó interfázisú sejtek diagnosztizálására, amelyek óriási hatással voltak a prenatális diagnózisra és a preimplantációs genetikai diagnózisra (PGD).

FISH technológia DNS-próbát használ, amely megköti vagy renaturálja a kromoszómán belüli specifikus DNS-szekvenciákat. A denaturált próbát natív sejt-DNS-sel inkubálják, amely szintén egyszálú állapotba van denaturálva. A szonda a biotin-dezoxiuridin-trifoszfátot vagy a digoxigenin-uridin-trifoszfátot timidinre cseréli. A natív DNS próba általi renaturálása után a próba-DNS komplex fluorokrómmal jelölt biotinkötő avidin vagy fluorokrómmal jelölt antidigoxigenin hozzáadásával detektálható. További jelerősítés érhető el antiavidin hozzáadásával és a kapott komplex fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával. Különböző DNS-próbák több különböző fluorokrómmal való megjelölésével egyetlen sejten belül több kromoszóma vagy kromoszómaszegmens egyszerre többszínű jelként jeleníthető meg.

Meghatározási képesség specifikus génszegmensek A kromoszómákon jelenlévő vagy hiányzó génszekvenciák DNS-szintű szindrómái, valamint interfázisú magokban, gyakran egyedi sejtekben történő transzlokációk diagnosztizálását tette lehetővé.

anyag számára HAL vagy osztódó sejtekből nyert metafázisú kromoszómák, vagy osztódási szakaszban nem lévő sejtekből származó interfázisos magok szolgálhatnak. A metszeteket RNázzal és proteinázzal előkezelik, hogy eltávolítsák az RNS-t, amely kereszthibridizálódhat a próbával és a kromatinnal. Ezután formamidban hevítik a DNS denaturálására, és jéghideg alkohollal rögzítik. A próbát ezután melegítéssel hibridizációra készítik elő. Ezt követően a próbát és a kromoszómapreparátumot összekeverjük, és 37 °C-on fedőlemezzel lezárjuk a hibridizációhoz. Az inkubációs hőmérséklet vagy a hibridizációs oldat sóösszetételének változtatásával a kötődési specifitás növelhető és a háttérjelölés csökkenthető.

Fluoreszcens in situ hibridizáció alkalmazása - FISH technológia

A FISH technológia hatékonysága először a gének lokalizálásával mutatták ki. A fluoreszcens jelölési módszer bevezetésével az in situ hibridizáció nélkülözhetetlenné vált a hagyományos sávozási módszerekkel nem kimutatható kromoszóma-rendellenességek diagnosztizálásában. A FISH kulcsszerepet játszott a modern genetika egyik legkülönlegesebb felfedezésében, a genomikus imprintingben is.

Fejlesztési technológiája HAL három formában érkezett meg. A Centromer vagy alfa-szatellit próbákat relatív kromoszómaspecifitás jellemzi, leggyakrabban az interfázisú sejtek genetikájában használták őket. Ezek a próbák kissé diffúz, megfelelő erősségű jeleket generálnak a centromer régióban, de nem kereszthibridizálódnak hasonló centromer szekvenciájú kromoszómákkal. Jelenleg olyan egykópiás szondákat fejlesztettek ki, amelyek egy adott kromoszómasávból diszkrét jelet adnak, és lehetővé teszik a kereszthibridizáció jelenségének elkerülését. Ezek a próbák arra is használhatók, hogy meghatározzák a kópiaszámot és azon kromoszómarégiókat, amelyekről feltételezhető, hogy egy adott szindrómához társulnak. A 13-as, 18-as, 21-es, X és Y kromoszómára tervezett egypéldányos és centromer próbákat a prenatális diagnózishoz használjuk.

Lehetőség van a teljes kromoszómák "festésére" is HAL. A spektrális kariotipizálás technológiájának köszönhetően, amely különböző fluorokrómok keverékét használja, ma már minden egyes kromoszómához egyedi fluoreszcens mintát lehet létrehozni 24 egyedi színnel. Ez a technológia lehetővé teszi olyan összetett kromoszóma-átrendeződések meghatározását, amelyek a hagyományos citogenetikai technikák segítségével nem láthatók.

Módszer HAL a prenatális diagnosztikában. Az idősebb reproduktív korú nők számára a terhesség nem annyira örömre, hanem aggodalomra adhat okot. Egy nő életkorával együtt jár a magzat kromoszóma-rendellenességeinek kialakulásának kockázata. Az amniocentézis a terhesség 16. hetében történik, majd a kariotípus elemzés 10-14 napig tart. A FISH használata az elővizsgálatban gyorsabb diagnózist és csökkentett várakozási időt tesz lehetővé. A legtöbb genetikus és laboratórium azon a véleményen van, hogy a FISH-módszert nem szabad elszigetelten használni a terhesség jövőbeli kezelésével kapcsolatos döntések meghozatalához. A FISH-módszert ki kell egészíteni kariotípusos elemzéssel, melynek eredményeinek legalább az ultrahang (ultrahang) vagy az anyai vér biokémiai szűrésének kórképével kell korrelálniuk.

A gének szindrómái sorozatok más néven mikrodeléciós szindrómák vagy szegmentális aneusomia. Ezek egy kromoszóma szomszédos fragmentumainak deléciói, amelyek általában sok gént érintenek. A génszekvencia-szindrómákat először 1986-ban írták le klasszikus citogenetikai technikákkal. Most a FISH-nak köszönhetően lehetséges a szubmikroszkópos deléciók DNS-szinten történő azonosítása, ami lehetővé tette egy adott szindróma kialakulásához kapcsolódó legkisebb deletált régió, az úgynevezett kritikus régió azonosítását. A szindróma kritikus régiójának azonosítása után gyakran lehet azonosítani azokat a specifikus géneket, amelyek hiányát a szindrómához kapcsolódónak tekintik. A génszekvencia-szindrómákról szóló legújabb útmutató 18 deléciós és mikrodeléciós szindrómáról számol be, amelyek 14 kromoszómához kapcsolódnak. A táblázatban a leggyakoribb génszekvencia-szindrómák és klinikai megnyilvánulásaik láthatók. 5-2.

Telomerek- olyan képződmények, amelyek a kromoszómák hosszú és rövid karjainak végeit fedik le. Ismétlődő TTAGGG szekvenciákból állnak, és megakadályozzák, hogy a kromoszómák végei összeolvadjanak. A telomer próbák fontos szerepet játszanak a hagyományos citogenetikai módszerekkel nem meghatározható komplex transzlokációk felismerésében. Emellett a Human Genome Project egyik felfedezése az volt, hogy a kromoszómák telomerekkel szomszédos régiói génekben gazdagok. Mostanra kimutatták, hogy a szubmikroszkópos szubtelomer deléciók felelősek számos genetikailag meghatározott betegség előfordulásáért.

Nukleinsavak in situ hibridizációja A módszer azon alapul, hogy egyszálú szekvenciák (ribo- vagy dezoxiribo-, oligo- vagy polinukleotid) alapján mesterségesen létrehozott jelölt próbák és az ezekkel komplementer szekvenciák között kettős szálú hibridek jöhetnek létre. célpontok – elemzett DNS- vagy RNS-molekulák. A hibridizációs helyek azonosítására DNS-próbát (DNS-próbát) egy riportercsoporttal jelölnek: ü radioaktív izotóp, ü fluorokróm, ü foltot vagy lumineszcens terméket adó enzim, ü haptén, amellyel a jelölt test kötődik, stb.

A szondában egy riportercsoport jelenlétéből adódó hibrid kimutatásával - megbecsülhető egy bizonyos típusú RNS-t kódoló gének száma, - meghatározható a nem átíródó DNS aránya a genomban, - megállapítható bizonyos láncszemek kapcsolata. gének egymással – és azok pontos elhelyezkedése a kromoszómákon. A molekuláris hibridizációs módszer nagy érzékenységgel (kis mennyiségű jelölt próba (10 -15 és 10 -19 M) kimutatása, és ennek megfelelően komplementer szekvenciája a célpontban) és gyors elemzéssel rendelkezik, ami Ez a módszer mind kutatási tevékenységhez, mind örökletes és fertőző betegségek diagnosztizálásához használható az orvostudományban, az állatgyógyászatban és a növénytermesztésben.

A molekuláris citogenetika új, elsősorban a nukleinsavak in situ hibridizációján alapuló technológiáinak megjelenése jelentősen kibővítette a kromoszómadiagnosztika lehetőségeit.

Interfázisos citogenetika: 1. Többszínű kromoszóma sávozás (MCB). 2. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH). 3. FISH kombinálása más módszerekkel: -citológia + FISH; -szövettan + FISH; -immunfenotipizálás + FISH (FICTION); Metafázisos citogenetika: 1. A kromoszómák szilárd festése (Egész festés). 2. Összehasonlító genomi hibridizáció (CGH). 3. Színváltó kariotipizálás (CCK). 4. Többszínű kariotipizálás: Spectral kariotipizálás (SKY); többszínű FISH (M - FISH, M - BAND).

A FISH – fluoreszcens in situ hibridizáció – egy citogenetikai módszer, amelyet specifikus DNS-szekvenciák kromoszómákon, mRNS-en stb. történő kimutatására és lokalizálására használnak. A technika egy fluoreszcensen jelölt DNS/RNS próba hibridizációján alapul egy komplementer DNS/RNS szekvenciával. A jelölést fluoreszcens mikroszkóppal detektáljuk. A FISH módszert több mint 30 éve vezették be. Széles körben elterjedt a gének kromoszómákon történő fizikai feltérképezésére szolgáló módszer. Később más kutatási területeken is alkalmazták (a klinikai genetika, a reproduktív gyógyászat, a toxikológia, az evolúciós biológia, az összehasonlító és sejtgenomika, valamint a kromoszómabiológia területén). Jelenleg a FISH-t elsősorban kromoszómák fizikai és genetikai térképeinek felépítésére használják, szerkezeti átrendeződések, transzlokációk, mikrodeléciók, génamplifikációk kimutatására interfázisos és metafázisos kromoszómákban. A tudomány fejlődése (a nukleinsavak és a kromatin kémiai és fizikai tulajdonságainak jobb megértése), valamint a fluoreszcens mikroszkópia és a digitális képalkotás fejlődése eredményeként a módszert folyamatosan fejlesztették (az érzékenység, a specificitás, a felbontás javulása) és ennek a módszernek számos változatát fejlesztették ki.

1) A sejteket egy tárgylemezre ejtjük, ami a kromoszómák szétterjedését okozza. 4) A kromoszómákat DAPI-val ellenfestjük. 2) Fluoreszcensen jelölt próbát helyezünk a kromoszómákra és lezárjuk. 3) A próbát és a kromoszómákat denaturáljuk, hibridizáljuk, majd mossuk. 5) A tárgylemezt fluoreszcens mikroszkóp alatt nézzük

A FISH beállítási protokolljának általános nézete a következőképpen ábrázolható: 1. Szövettani vagy citológiai készítmény készítése. A szövettani készítmény elkészítése a szabványos séma szerint történik: vágás, jelölés, huzalozás, öntés, mikrotómia, a vágás tárgylemezre helyezése és paraffinmentesítés. Citológiai készítmény készítésekor speciális kicsapó oldatokat és centrifugálást alkalmaznak, amely lehetővé teszi a koncentrált sejtszuszpenzió előállítását. 2. Előkezelés (ha szükséges). A készítményt proteázok dolgozzák fel, hogy kiküszöböljék a hibridizációt gátló fehérjék jelenlétét. 3. DNS-próba alkalmazása a készítményre, majd az azt követő denaturálás. A próba és a minta DNS denaturálásához formamiddal kezeljük, és körülbelül 85-900 C-ra melegítjük.

4. Hibridizáció. A denaturálást követően a gyógyszert egy bizonyos hőmérsékletre (klinikai vizsgálatok esetén 370 C) lehűtjük, és nedves kamrában több órán át inkubáljuk (az inkubáció időtartamát az egyes protokollokban feltüntetjük). Jelenleg automatikus hibridizálókat használnak a denaturációhoz és a hibridizációhoz. 5. Mosás. A hibridizáció befejezése után a nem kötött próbákat le kell mosni, ami egyébként olyan hátteret hozna létre, amely megnehezíti a FISH-eredmények értékelését. Az öblítéshez általában citrátot és nátrium-kloridot (SSC) tartalmazó oldatot használnak. 6. Ellenfestés. Fluoreszcens festékek (DAPI - 4, 6-diamidin-2 fenil-indol; propidium-jodid) segítségével az összes sejtmag DNS megfestődik. 7. Eredmények elemzése fluoreszcens mikroszkóp segítségével A rutinműveletek (paraffinmentesítés, előkezelés, mosás) automatizálhatók.

Telomer régiók vizsgálata fluoreszcens mikroszkóppal. Az interfázis (mag) és metafázis (egyedi kromoszómák) szakaszában kapott képeket kombinálják. kék szín - DAPI.

A FISH-módszer előnyei: 1. Az interfázisú sejtmagok genetikai anyagának tanulmányozása; 2. Az objektív eredmények elérése igen/nem alapon kvantitatív módszer 3. Az eredmények viszonylag egyszerű értelmezése, nagy felbontású A FISH módszer hátrányai: 1. a fluoreszcens festékek gyorsan "fakulnak", mikroszkóp.

A FISH-módszer egy speciális technológiával előállított DNS próba, amely egy korlátozott méretű nukleotid szekvencia és a vizsgált citogenetikai készítmény mag DNS-ének komplementer szakasza közötti hibridizációs reakción alapul. A DNS-szonda a FISH felállításának fő eleme, és egy "címkét" hordoz, azaz olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek közvetlenül kapcsolódnak egy fluorokrómhoz vagy egy hapténhez, és a fluorokrómot hordozó antitestek további láthatóvá teszik. A meg nem kötött jelölt DNS-t lemossuk, majd a hibridizált DNS-próbát fluoreszcens mikroszkóppal detektáljuk.

A DNS-jelölést direkt és indirektre osztják. A közvetlen jelölés riporterelemeket visz be a DNS-be - fluorokrómokat (rodamin, dietilaminokumarin, texasi vörös stb.). Közvetett jelölési módszer - a DNS-mintát előzetesen konjugálják köztes ligandumokkal (biotin, dioxigenin, 2, 4-dinitrofenol), amelyek jelenlétét a citológiai készítményen ezután fluorokrómok segítségével detektálják. Ebben az esetben a módszer érzékenysége nagymértékben megnő, mivel a ligandum több helyen is kölcsönhatásba léphet a fluorokrómmal. A32P-vel jelölt próbával végzett in situ hibridizációt először 1969-ben írták le. A DNS-próbák jelölésére és kimutatására szolgáló nem radioaktív rendszerek fejlesztése az in situ hibridizációs módszert biztonságossá, könnyen kivitelezhetővé és az eredmények feldolgozása során kevésbé munkaigényessé tette. A fluoreszcens festékek lágyak és könnyen használhatók, korlátlan ideig tárolhatók, nagy felbontást adnak, és lehetővé teszik több DNS-szekvencia egyidejű vizsgálatát.

Próbák: egyszálú/kétszálú DNS/RNS elsődleges/másodlagos jelölt próbák. A próbák jelölése: 1) közvetlenül: nukleotidok beépítésével, amelyekhez fluorokróm kapcsolódik (PCR vagy nick-transzláció) 2) riporter molekulán keresztül (pl.: digoxigenin, biotin), amelyhez fluoreszcensen jelölt antitestek kapcsolódnak. A jel fokozására használhat fluoreszcens címkével jelölt másodlagos, tercier stb. antitesteket. A DNáz bevágja a DNS Nicket Translation A DNS polimeráz I új nukleotidokat ad a 3' hidroxil DNS-hez. 4',6-diamidino-2-fenil-indol; erős kötődés A-T-ben gazdag DNS-régiókhoz; gerjesztés UV fénnyel; emisszió 461 nm (kék).

Jelenleg számos fő megközelítés létezik, amelyeket a modern molekuláris citogenetika széles körben használ: A kiterjesztett kromoszómarégiók és a teljes kromoszómák anyagának azonosítása. Egy adott DNS-szekvencia kimutatása a kívánt régióban. Az egyes kromoszómális régiók egyensúlyhiányának elemzése. A kiterjesztett kromoszómális régiók és a teljes kromoszómák anyagának azonosítására széles körben alkalmazzák a kromoszóma-specifikus és régióspecifikus DNS-próbákat („festőpróbák”).

Különböző típusú próbák jellemzői 1. lókusz-specifikus próbák (LSI - locus - specifikus azonosítók, amelyek a kromoszóma bizonyos régióihoz kötődnek.) Ezek a próbák az izolált DNS elérhető rövid (nem ismétlődő) szekvenciájának azonosítására szolgálnak. jelzett próba előállítása és ezt követő hibridizációja kromoszómakészlettel. Diagnosztikailag és prognosztikailag jelentős kromoszóma-rendellenességek kimutatására szolgálnak különféle kóros állapotokban (monoszómia és triszómia az egyes kromoszómák esetében). Ezeknek a mintáknak a legelterjedtebb felhasználása a prenatális citogenetikai diagnosztikában, különösen a chorionszövet sejtjeinek és az amniociták interfázisú magjainak vizsgálatában volt.

2. A kromoszómák telomer régióinak DNS-próbáit (TEL telomerpróbe) a kromoszómakarok terminális régióit érintő deléciók és átrendeződések kimutatására tervezték. Az ilyen próbák specifikusak a kromoszómák p- vagy q-karjaira, és komplementerek egy körülbelül 300 kb hosszúságú régióval. a kromoszóma végétől. A kromoszómák rövid és hosszú karjaihoz tartozó DNS-próbák általában különböző fluorokrómokhoz kapcsolódnak, ami lehetővé teszi a kromoszóma mindkét telomer régiójának kimutatását egy citogenetikai készítményben.

3. A centromer ismétlődő próbák, az alfa vagy kromoszóma számlálók (CEP - centromere. Enumeration. Probe) olyan kromoszóma-specifikus DNS-próbák, amelyeket tandem alfa és béta szatellit ismétlődések szekvenciái képviselnek. Ezek az ismétlődések túlnyomórészt a kromoszómák centromer vagy pericentromer heterokromatin régióiban találhatók. Segítségükkel minden kromoszóma más színűre festhető, ami lehetővé teszi a kromoszómák számának és a normál számtól való eltérésének gyors meghatározását, kiegészítve a kromoszóma egyes szakaszait, de egészében lefedi a teljes hosszát. Az ilyen szondák könyvtárának felhasználásával a teljes kromoszómát "színezhetjük", és az egyén differenciális spektrális kariotípusát kaphatjuk meg. Ezt a fajta elemzést a kromoszóma-rendellenességek, például transzlokációk elemzésére használják, amikor az egyik kromoszóma egy darabja átkerül a másik karjába.

Alkalmazások A FISH-t széles körben használják az alábbi klinikai diagnosztikai feladatok megoldására: 1. Perimplantáció prenatális és kromoszóma-rendellenességek diagnosztikája. In vitro megtermékenyítési (IVF) klinikákon és perinatális központokban használják. Lehetővé teszi időben (IVF esetén az embrió beültetése előtt vagy a magzati fejlődés korai szakaszában) a születendő gyermek genetikai rendellenességeinek azonosítását és a szükséges intézkedések megtételét. 2. Onkohematológia. Az onkohematológiai betegségek különböző kromoszóma-rendellenességek következtében alakulnak ki, ezért diagnózisukhoz megfelelő CEP és LSI szondákat használnak. 3. Szilárd daganatok diagnosztikája. Jelenleg egyre több ok-okozati összefüggést állapítanak meg a specifikus rákos megbetegedések kialakulása és a genomban bekövetkezett specifikus változások között. Ezért megfelelő DNS-próbák alkalmazásával lehetőség nyílik onkológiai FISH-diagnosztika elvégzésére.

Interfázisú citogenetika: FISH kombinálása más módszerekkel: - FISH immunfenotípus-meghatározás (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) - tumorsejtek tanulmányozására. Ehhez az elemzéshez festetlen vér-, csontvelő- vagy más szövetek készítményeit használják. 1. szakasz - a készítményeket specifikus monoklonális antitestekkel inkubálják, a 2. szakasz - fluoroforokkal való konjugációt hajtanak végre az antigén-monoklonális antitest komplex későbbi megjelenítéséhez. 3. szakasz - in situ hibridizáció végrehajtása DNS-próbákkal. A monoklonális antitestek és DNS-próbák kimutatására a színükben eltérő fluoroforokat használnak. A készítmény vizsgálata fluoreszcens mikroszkóp alatt a szükséges szűrőkészlettel lehetővé teszi a hibridizáció immunfenotípusának és a jelek egyidejű elemzését az interfázisú magokban.

A TNFAIP 3 kromoszómális deléciója a c. A HL interfázisos citogenetikával kimutatható. FIKCIÓS elemzései a. képviselő c. HL esetek kombinálva. CD 30 expresszió (piros) és FISH próbák a TNFAIP 3 és a 6. kromoszóma centromérához (kék [b]). Az A–C, E és F kétszínű tesztekben a TNFAIP 3 szonda zölddel (g) van jelölve; a D-ben alkalmazott háromszínű vizsgálatban a TNFAIP 3 próba g/narancssárga kolokalizált (co) jelet ad. Két különböző stratégiát alkalmaznak a két- és háromszínű FISH-vizsgálatok megjelenítésére CD 30 immunfluoreszcenciával kombinálva; én. e. , a kétszínű tesztek (A–C és E és F) háromszínű kijelzőn jelennek meg, míg az Isis szoftverrel kapott hamis többszínű megjelenítést alkalmazzák a háromszínű vizsgálathoz (D), hogy egyidejűleg négy színt ( azaz CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] és narancssárga, valamint 6. kromoszóma centromer [b]).

A mikroképek digitális rögzítése lehetővé tette, hogy ne csak a fluoroforok kombinációit, hanem azok arányait, intenzitását is álszínekké alakítsák.

A kromoszómák többszínű festése (Muli. Color Banding – MSV) Ez a módszer nem az összes kromoszóma teljes elemzésére szolgál, hanem egyetlen kromoszóma részletes elemzésére. A lókusz-specifikus DNS-próbákat különböző fluoroforokkal vagy fluoroforok kombinációival jelölik, így az egyes DNS-próbák jelszintje változó intenzitású. A DNS-próbajelek átfedő intenzitásprofiljai a kromoszóma mentén a különböző fluoroforok fluoreszcencia intenzitásának arányának eltéréseit eredményezik. Az intenzitásarányok lefordíthatók pszeudoszínekre, és így a kép minden pontjának, következésképpen minden kromoszómális lókusznak megvan a maga pszeudoszíne. A többszínű FISH módszer ezen változata rendkívül hatékonynak bizonyult nem csak az interkromoszómális, hanem az intrakromoszómális átrendeződések elemzésében is onkológiai betegségekben. A sikeres alkalmazáshoz azonban először meg kell határozni a vizsgálandó kromoszómát. Ez a molekuláris citogenetikai módszer alkalmas bizonyos kromoszómákkal kapcsolatos kariotípus-rendellenességek elemzésére.

A mai napig olyan DNS-próbákat hoztak létre, amelyek MCV-t biztosítanak az 5. kromoszómán lévő összes emberi kromoszómához; az 5. kromoszóma többszínű sávja; az 5. kromoszóma idiogramja; az MSV-hez használt fluorokrómok).

A metafázisos citogenetika, amely történetileg korábban keletkezett, mint az interfázisos citogenetika, lehetővé teszi a kromoszóma-rendellenességek széles körének meghatározását, de ehhez az szükséges, hogy a vizsgált sejtek a meiózis metafázisában legyenek.

Többszínű kariotipizálás Az analízist DNS-próbákkal végezzük, amelyek folyamatosan festik a karokat vagy a teljes kromoszómákat (WCP próbák - teljes kromoszómafesték). Az ilyen próbák számos, a kromoszóma teljes hosszában elhelyezkedő rövid DNS-szekvenciával hibridizálnak. Így, ha fluoreszcens mikroszkóp alatt nézzük, a kromoszóma egyenletesen festett egy bizonyos színben.

Az ehhez az elemzéshez használt DNS-próbák szilárd festőpróbák keverékéből állnak az emberi kromoszómák teljes készletéhez, amelyeket több fluorokróm kombinációjával jelöltek meg, amelyek arányát minden kromoszómapárra külön-külön választják meg. A megfelelő regisztrációs módszerek és számítógépes programok használata a képelemzéshez, amelyek a kép minden pontjára értékelik az összes fluorokróm lumineszcenciájának intenzitását, lehetővé teszi a kariotipizálás elvégzését, amelyben minden kromoszómapár saját egyedi "pszeudoszínnel" rendelkezik. ".

Az M-FISH (multitarget multifluor multicolor vagy multiplex. FISH) a hagyományos többszínű FISH általános neve, amely fluorokróm-specifikus szűrőkészleteket használ. Az M-FISH elve az összes használt fluorokróm jelének külön digitális rögzítéséből áll, ami a szűrőkészletek egymás utáni cseréjével érhető el. Valamennyi kép külön fájlba kerül rögzítésre, ami lehetővé teszi azok hatékony jel- és háttérleválasztással, valamint a jelek mennyiségi meghatározásával kapcsolatos feldolgozását. Az összes rögzített információ speciális szoftver segítségével történő feldolgozása a kép egyes pontjain lévő fluorokróm jelek szintjéről szóló információkat pszeudoszínekre fordítja. A felhasznált DNS-próbák számának egyik fő korlátja a rendelkezésre álló, nem átfedő gerjesztési és emissziós spektrummal rendelkező fluorokrómok száma, valamint a megfelelő szűrőkészletek elérhetősége.

24 színű FISH A legszélesebb körben használt M-FISH a 24 színű FISH az összes emberi kromoszómából származó anyagok egyidejű azonosítására. Nagyon hatékony a kromoszómális transzlokációk kimutatásában, de nem a deléciók és inverziók kimutatására tervezték. Ez a probléma azonban részben megoldható a kromoszómák egyidejű DAPI-festésével, amely lehetővé teszi azon kromoszómák differenciális csíkozódásának elemzését, amelyek kromoszómaanyagát már azonosították. Sajnos meg kell jegyezni, hogy a kromoszóma DAPI sávozás minősége az M-FISH után lényegesen gyengébb, mint a GTG differenciális festés, sőt a hagyományos in situ hibridizációt követő DAPI sávozás minősége is.

Rx. FISH Az M-FISH elvet használták az emberi kromoszómák többszínű vonalkódjának és a fajok közötti in situ hibridizáción alapuló többszínű kromoszóma sávozási módszernek a létrehozására. A 24 színű FISH-val ellentétben ez a módszer lehetővé teszi az intrakromoszómális átrendeződések egy részének közvetlen kimutatását. Az Rx-ben használt DNS-próbák. 3 fluorokróm kombinációjával jelölt FISH, amely 7 pszeudo színt biztosít. Kifejezetten megfestik a kromoszómák egyes régióit, létrehozva azok színcsíkosságát. A DNS-mintáknak ez a tulajdonsága az Rx-hez. A FISH-t a beszerzés módja határozza meg. Ezek két gibbonfaj kromoszóma-specifikus DNS-könyvtárai: a Hylobates concolor és a Hylobates syndactylus.

A modern gibbonfajok kialakulása során lezajlott intenzív kromoszóma-átrendeződések eredményeként kromoszómáik anyaga erősen kevertnek bizonyult az ember kromoszómáinak szerveződéséhez képest, akiknek kromoszómái konzervativizmusukról ismertek. A humán 1. kromoszóma és a gibbon kromoszómák aránya az 1. ábrán látható.

A 2. ábra az Rx eredményeként kapott humán kromoszómák általános nézetét mutatja. HAL. a) Metafázis lemez b) A kromoszómák elrendeződése.

Az RXFISH-nak azonban komoly korlátai vannak – az egy szín RX sávon belül végbement kromoszóma-átrendeződések nem mutathatók ki ezzel a módszerrel, hacsak nem vezetnek jelentős és könnyen látható változásokhoz a sáv méretében. - a szondák különböző kromoszómák több kromoszómális régióját festik meg egy pszeudoszínben. A felhasznált fluorokrómok számának növekedésével azonban az RXFISH módszer kétségtelenül informatívabb lesz, mint a rutin 24 színű FISH.

Az RXFISH előnyei jelenleg a következők: A módszer lehetővé teszi a teljes emberi genom elemzését egyetlen többszínű FISH kísérletben. Kereskedelmi forgalomban kapható jelölt DNS-próbák és a szükséges kimutatási rendszerek állnak rendelkezésre. A módszer lehetővé teszi az intra- és interkromoszómális átrendeződések jelentős részének gyors azonosítását. A „színsávos” metafázisú kromoszómák automatikus azonosítása lehetséges. Minden emberi kromoszóma egyedi színű vonalkóddal rendelkezik. Az RXFISH a Cyto munkaállomásba integrálva van. Látó és szabványos fluoreszcens mikroszkópos rendszerek.

Spektrális kariotipizálás (SKY-spectralkaryotyping) A spektrális kariotipizálás mikroszkópos képelemzésének alapelvei gyakorlatilag megegyeznek az M-FISH-ban használtakkal. A különbségek a kép regisztrálásának módjával kapcsolatosak. A SKY technológia lehetővé teszi, hogy egy mérés során a kép minden pontjára spektrális görbéket kapjunk, függetlenül attól, hogy az epifluoreszcenciához vagy a hagyományos fénymikroszkópiához kapcsolódik. Az összes emberi kromoszóma spektrális kariotipizálásához öt fluorokrómot használnak, egyet a zöld spektrumban, kettőt a vörösben és kettőt az infravörösben. A DNS-próbák jelöléséhez használt összes fluorokróm gerjesztése és emissziója egy szűrőkészlettel történik, ami lehetővé teszi azok szekvenciális változásának, közbenső fókuszálásnak, és ebből adódóan az ezzel összefüggő problémák elkerülését, mint a kép térbeli eltolódása, küszöbértékek meghatározása és szegmentáló maszkok. A spektrális görbék elemzése alapján meghatározzuk a specifikus fluorokrómok jelenlétét vagy hiányát egy adott pontban.

A következő lépés az osztályozási eljárás, amely lehetővé teszi az elemzett anyag kromoszómális hovatartozásának közvetlen és egyértelmű meghatározását. Ez biztosítja a marker kromoszómaanyag, valamint a különféle átrendeződésekből származó kromoszóma származékok megbízható azonosítását (egy kromoszómáig). A SKY nagy előnye, hogy a DAPI színezést a spektrális képpel párhuzamosan regisztráljuk. A DAPI sávozás szoftveres fejlesztése lehetővé teszi a GTG sávozáshoz közeli minőségi különbségek elérését. A spektrális kép párhuzamos elemzésének és a kromoszómák kvalitatív differenciális festésének lehetősége nagyban leegyszerűsíti a SKY eredmények értelmezését, és lehetővé teszi a kromoszómatörések pontjainak pontosabb meghatározását. A SKY kétségtelen előnyei közé tartozik az átfedő gerjesztési és emissziós spektrumú fluorokrómok alkalmazásának lehetősége, ami jelentősen bővíti a használható fluorokrómok listáját, és növeli az egyidejűleg használható fluorokrómok számát is. Az új fluorokróm listázásához nem szükséges új szűrőkészletet vásárolni, mivel egy szűrőegység a spektrális FISH-hoz és egy szűrőegység a DAPI-hoz elegendő a SKY-hez.

A SKY hátrányai a következők: - hosszú expozíciós idő, ami mikroszkopikus képek rögzítéséhez szükséges. - A SKY valamivel kevésbé hatékony, mint az M-FISH, ha viszonylag kis DNS-próbákkal kell kutatni.

Színváltoztató kariotipizálás (CCK-k Színváltó kariotipizálás) Ez a módszer a fluorokrómokhoz kapcsolódó DNS-próbákkal és az antitesteket hordozó DNS-próbákkal hibridizált DNS-minták jelhossz-különbségének elemzésén alapul. A módszer mindössze 3 szűrővel megvalósítható, és nem igényel speciális kamerákat és szoftvereket. A kromoszómák azonosításához egy hibridizációt végzünk, és két képet készítünk. A módszer a fluoreszcens jel hosszának különbségén alapul, mivel az antitestekhez kapcsolódó DNS-minták expozíciós ideje 80-90%-kal rövidebb, mint a fluorokrómokhoz kapcsolódó mintáké. A hibridizációs reakció után a tamponokat a megfelelő primer antitestekkel kezelik, majd láthatóvá teszik az első kép elkészítéséhez. A tárgylemezeket ezután másodlagos antitesteknek és ugyanazon fluorokrómokhoz kötött avidinnek tesszük ki. A löketeket DAPI segítségével lehet ellenfesteni.

A jövőben ismét 3 szűrő segítségével készítik el a képeket a készítményekről. Ezeket a képeket speciális szoftverrel összehasonlítják, és egy második képet kapnak, amelyen csak bizonyos antitestekhez kapcsolódó kromoszómák lesznek láthatók. Így egyes kromoszómák csak az első vagy a második szkenneléskor fluoreszkálnak, míg mások színt változtatnak a különböző letapogatásokon.

Összehasonlító genomiális hibridizáció (CGH) A módszert a genom mennyiségi rendellenességeinek azonosítására hozták létre. Ez egy in situ hibridizációs reakció végrehajtásán alapul, DNS-próbaként a teljes genomot használva. Az izolált és normál donor DNS-t különböző színű fluorokrómokkal jelölik, így DNS-próbákká alakulnak. E próbák egyenértékű mennyiségét összekeverjük, és egy kontroll citogenetikai készítménnyel történő hibridizációban alkalmazzuk. A FISH után a metafázisokat fluoreszcens mikroszkópon elemzik, speciális számítógépes képelemző programmal, hogy meghatározzák két fluorokróm fluoreszcencia intenzitását az egyes kromoszómák teljes hosszában.

A vizsgált minta kariotípusában bekövetkezett mennyiségi változások hiányában a két fluorokróm lumineszcencia intenzitásának bizonyos aránya figyelhető meg. Génamplifikáció esetén a megfelelő fluorokróm jelének intenzitása megnő, a genetikai anyag egy részének elvesztése esetén pedig éppen ellenkezőleg, gyengül. A CGH tehát lehetővé teszi a genomiális egyensúlyhiány kimutatását, de ezzel a módszerrel nem lehet kimutatni a kiegyensúlyozott transzlokációkat és inverziókat, a triszómiák és deléciók csak akkor mutathatók ki, ha a kiegyensúlyozatlan régió mérete legalább 10 millió bázispár.

A vizsgálati mintában a kromoszóma-kiegyensúlyozatlanságot két különböző fluorokróm fluoreszcencia intenzitása különbségéből becsüljük meg a fluoreszcens arány (RF) kiszámításával.

A CGH-módszer számos előnnyel rendelkezik a genomváltozások elemzésére szolgáló más módszerekkel szemben: Először is, nem függ a vizsgálati anyag forrásától, és sikeresen végrehajtható kis mennyiségű DNS-teszttel, beleértve az archív anyagokat is. Másodszor, lehetővé teszi, hogy egyetlen kísérletben részletes információkat szerezzünk a genetikai anyag másolatainak számának elvesztéséről vagy növekedéséről a genomban. Harmadszor, a CGH módszer nem igényli metafázisú kromoszóma preparátumok készítését a vizsgált szövetből, vagyis nem függ a sejttenyésztési folyamattól és a kapcsolódó műtermékektől.

A genomiális situ hibridizáció (genomicin situ hibridizáció in, GISH) a situ hibridizációs módszer egyik változata, amely abból áll, hogy a rögzített mintákkal történő hibridizációhoz egy élőlényfaj teljes genomiális DNS-ét használjuk fel fluoreszcensen jelölt próbaként. amelyekkel egy másik organizmusfaj teljes genomiális DNS-e verseng; fajok közötti és fajokon belüli különbségek meghatározására használják a genomokban, kromoszóma átrendeződésekben, deléciókban és szubsztitúciókban.

FISH-variációk 1) Q-FISH – kvantitatív FISH: Lansdorp és munkatársai fejlesztették ki: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward és P. M. Lansdorp. 1998. Rövid telomerek az emberi kromoszómán 17 p. Nat. Közönséges petymeg. 18:76-80. mennyiségi módszer. Áramlási citometriával való együttműködésre tervezték. Eredetileg a kromoszóma hosszának mérésére használták (felbontás: 200 bp) a telomer ismétlődések számának megszámlálásával. PNA-konjugált próbákat használnak. Kezdetben metafázisú kromoszómákat vizsgáltak (tulajdonképpen QFISH), ma már interfázisú kromoszómákra (IQ-FISH) is alkalmazható ez a módszer. A Q-FISH-t sejttenyészeten, szövetmetszeteken (mindkettő szemüvegen) végezzük. Jelenleg a Q-FISH fontos eszköz a telomerek öregedési és rákképződési folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatában.

PNA-FISH – Peptid nukleinsavak FISH: A peptid nukleinsavak (PNA-k) a DNS szintetikus analógjai, amelyekben a dezoxiribóz-foszfát cukorvázát, amely a nitrogénbázist támogatja, egy töltetlen peptidváz helyettesíti. Ennek a szerkezetnek az eredménye: amikor a PNA-oligomer próba hibridizálódik a komplementer DNS/RNS-sel, nem lép fel elektrosztatikus taszítás. A PNA-DNS (PNA-RNS) duplexek sokkal stabilabbak, mint a természetes homo/heteroduplexek. A PNS-DNS kötés nagy specifitása: A PNS-DNS hibridizáció sokkal érzékenyebb a bázispár eltérésre, mint a DNS-DNS hibridizáció. Így egy PNA-próba segítségével két centromer ismétlődés különböztethető meg, amelyek csak egy bázispárban térnek el egymástól. A PNA relatív hidrofób tulajdonsággal rendelkezik (a DNS-hez képest), aminek következtében a PNA jobban átdiffundál a sejtfalon => széleskörű alkalmazás a mikrobiológiában. Magas kötődési specifitáson alapul: Úgy gondolják, hogy a PNA technológia hamarosan az in situ hibridizációhoz szükséges allélspecifikus próbák létrehozásának alapjává válik. Használják a genetikában, citogenetikában, epigenetikában, mikrobiológiában stb.

3) Flow-FISH – FISH áramlási citometriához: 1998-ban javasolta: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Telomerhosszúság dinamikája humán limfocita szubpopulációkban áramlási citometriával mérve . természet biotechnológia. 16, 743-747 (1998). A Q-FISH és az áramlási citometria kombinációja, amely lehetővé teszi a jelek elemzését (mérését) és válogatását. A flow-FISH-hoz sejtszuszpenziót használnak (a kromoszóma telomerek hosszának mérésére), kromoszóma terjedéseket és izolált kromoszómákat (további térképezéshez). A Q-FISH-hoz hasonlóan PNA-címkézett telomer próbákat használnak (például a telomer ismétlődések hosszának megjelenítésére és mérésére).A fő előny a gyorsabb módszer (nagyszámú sejt/kromoszóma elemzése/válogatása). Széles körben használják különféle problémák vizsgálatára: öregedés, telomerek megőrzése, vérképző őssejt-szuszpenziók ex vivo vizsgálata, baktériumok vizsgálata.

A többparaméteres elemzés lehetővé teszi a sejttípusok megkülönböztetését egy mintán belül, lehetővé téve a belső kontrollt és a leukocita altípusok elemzését.

A flow-FISH előnyei: Könnyen reprodukálható eredmények Egy populáció sejtalcsoportjainak elemzése fizikai immunfluoreszcencia és markerek segítségével Jobb teljesítmény, mint a Q-FISH. Képes több ezer sejt fluoreszcenciájának számszerűsítésére.

IZOLÁLT KROMOSZÓMÁK VIZSGÁLATA ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL 1. Kromoszóma-válogatás áramlási citometriával - Az áramlási citometriával végzett kariotipizálást gének további térképezésére és kromoszómakönyvtárak építésére használják. - A szétválogatott kromoszómákon lévő gének azonosítása és lokalizálása FISH módszerek / PRINS módszer (primed in situ jelölés) vagy annak variációi és kromoszóma-specifikus PCR utólagos alkalmazásával történik. - 2011-re eddig csak 17 kultúrnövényfaj kromoszómáját sikerült válogatni. - Magas osztódási indexű metafázisos vagy pachytenikus kromoszómák válogatása.

Fluoreszcens jelölés: - A kromoszómák nukleinsavspecifikus fluorokrómokkal vannak jelölve. - A fluorokrómokat az 1) nitrogénbázisokra vonatkozó specifitás, 2) a kísérleti körülmények (beleértve a rendelkezésre álló lézerek hullámhosszának figyelembevételét) megfelelően választják ki. 1. A monovariáns analízishez használjon nem specifikus A-T vagy G-C párokra jellemző festékeket: propidium-jodid (gerjesztési csúcs: 535 nm, emisszió: 617 nm, lézer szükséges: 488 nm argon lézer vagy lámpa + hosszú áteresztő szűrő) etidium-bromid (gerjesztés csúcsok: : 300 és 520 nm, emisszió: 600 nm, szükséges lézer: 488 nm argon lézer vagy lámpa + hosszú áteresztő szűrő) Ezek a címkék A, G, T vagy nitrogén bázis tartalomtól függetlenül megfestik a DNS-t. 2. Kétváltozós analízishez: kromomicin (specifikus a G-C bázispárokra), csúcs A 3 gerjesztés: 458 nm, emisszió 580 nm. Lézer: , 458 nm minimum 400 m. V teljesítmény. Hoechst 33258 (specifikus az A-T bp-re), gerjesztés: 351-364 nm, emisszió: 470 nm. Lézer: 351-364 nm (erős). A lézereket időben és térben el kell különíteni a fluorokróm spektrumok részleges átfedése miatt.

2. Kromoszómák/nukleotid szekvenciák válogatás utáni vizsgálata (fizikai és genetikai térképek készítéséhez stb.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Hosszú kromoszómákkal rendelkező nagy genomok vizsgálata. Nagy számú ismétlődést tartalmazó szekvenciák feltérképezése (pl.: telomer és centromer régiók). Rövid szondák használata. A nagy ismétlésszám miatt a jel erős. Szabványos próbaméret: 15-30 nukleotid. HAL

FISH-problémák: Nehéz lokalizálni az egylokuszú DNS-szekvenciákat (azaz nem ismétlődő egyedi DNS-szekvenciákat), mert a jel nagyon gyenge lesz standard rövid próbák használatakor. A szonda hosszának több kilobázisra növelése a jel fokozása érdekében csökkent érzékenységet és => nem specifikus kötődést eredményez. Megoldás: A BAC-FISH -BAC-FISH a FISH módszer és a bakteriális mesterséges kromoszómákba (BAC) integrált genomiális DNS-klónok kombinációja, amely lehetővé teszi nagy DNS-szekvenciák beillesztését. - Hatékony módszer kis genomú szervezetek egyedi kromoszómáinak azonosítására és feltérképezésére. BAC-próbákat, overgo-kat (átfedő oligonukleotidokat) használunk próbaként.

A FISH alternatívája: A PRINS PRINS (in situ primed jelölés) egy kromoszómák jelölési módszere egy oligonukleotid DNS primer és egy denaturált kromoszómális DNS homológ szekvenciájával történő összekapcsolásával, majd a primer in situ enzimatikus kiterjesztésével jelölt nukleotidokkal. Először Koch és munkatársai írták le. 1989-ben (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N. és Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming módszerek az alfa-szatellit DNS kromoszóma-specifikus jelölésére in situ. Chromosoma 98, 259 –265). A PRINS a FISH alternatívája. Nukleotidszekvenciák lokalizálására, metafázisos vagy interfázisú kromoszómák vagy kromoszómapárok felismerésére és számlálására (beleértve a kromoszómális aneuploidiát is) használják. a jelöletlen primer (primer-primer) összekapcsolása a kérdéses DNS-sel; a primer meghosszabbítása hőstabil DNS polimeráz és jelölt nukleotidok segítségével; a reakció leállítása (blokkoló molekula rögzítése a 3'-véghez) Primer : PCR restrikciós fragmens - indirekt (biotin/dig fluorokróm-konjugált avidin/anti-dig) - Minden PRINS reakció eredményeiben csak egy pár homológ kromoszóma (egy kromoszóma) azonosítható. A következő PRINS reakció ugyanazon a dián csak az előző blokkolása után hajtható végre. - Nagy számú ismétlődést tartalmazó DNS-szekvenciákhoz használják.

A PRINS előnyei: 1. Minimális szekvenciainformációt igényel egy oligonukleotid primer szintéziséhez. 2. A leggyorsabb és legegyszerűbb módszer a kérdéses szekvencia kimutatására egy kromoszómán (összehasonlítva a nehéz FISH-próbák használatával, amelyek nagyon hosszú ideig hibridizálnak). 3. A szonda címkézési lépésének kizárása. 4. A primer meghosszabbításának képessége jelölt nukleotidokkal a c-PRINS jel fokozása érdekében rövid egyedi szekvenciák detektálásakor. Az alacsony példányszámú ismétlődések vagy rövid egyedi szekvenciák azonosítására egy érzékenyebb módszert alkalmaznak - a PRINS ciklusos (c-PRINS) használatát. A C-PRINS-t Gosden és munkatársai javasolták. 1991-ben egy továbbfejlesztett, széles körben használt protokollt Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). DNS szekvenciák lokalizációja növényi kromoszómákon PRINS és C-PRINS segítségével. Methods in Cell Science 23: 71-82). A C-PRINS a PCR-hez hasonló hőciklusok sorozatát tartalmazza.

Tokfolyadék FISH-hoz: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Áramlási citometria és FISH a telomerek átlagos hosszának mérésére (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -Mg . Tehát 4 puffer ditiotreitol nélkül (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant genephysical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99-103 )-autoklávozott 0,1% (tömeg/térfogat) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, ):17(02, ): 823–829) - Kromoszómastabilizáló poliamin puffer (fehérjét tartalmazó hüvelyfolyadék) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2. kiadás, B. rész, San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Fluoreszcencia in situ hibridizáció

Fluoreszcens hibridizáció in situ , vagy a FISH módszerrel (eng. Fluoreszcencia in situ hibridizáció - HAL ) - citogenetikai módszer, amelyet egy adott DNS-szekvencia kimutatására és helyzetének meghatározására használnak metafázisos kromoszómákon vagy interfázisú magokban in situ. Ezenkívül a FISH-t specifikus mRNS-ek kimutatására használják szövetmintában. Ez utóbbi esetben a FISH-módszer lehetővé teszi a sejtekben és szövetekben a génexpresszió spatiotemporális jellemzőinek megállapítását.

Szondák

Fluoreszcens hibridizációval in situ használjon DNS-próbákat (DNS-próbákat), amelyek a mintában lévő komplementer célpontokhoz kötődnek. A DNS-próbák fluoroforokkal jelölt nukleozidokat (közvetlen jelölés) vagy konjugátumokat, például biotint vagy digoxigenint (közvetett jelölés) tartalmaznak. Közvetlen jelöléssel a célponthoz kötött DNS-próba fluoreszcens mikroszkóp segítségével közvetlenül a hibridizáció befejezése után megfigyelhető. Közvetett jelölés esetén további festési eljárás szükséges, melynek során a biotin kimutatása fluoreszcensen jelölt avidin vagy szteavidin, a digoxigenin pedig fluoreszcensen jelölt antitestek segítségével történik. Bár a DNS-minták jelölésének indirekt változata további reagenseket és időt igényel, ez a módszer általában magasabb jelszintet ér el, mivel 3-4 fluorokróm molekula van egy antitesten vagy avidin molekulán. Ezen kívül indirekt címkézés esetén lehetőség van a jel kaszkádos erősítésére.

DNS-minták létrehozásához klónozott DNS-szekvenciákat, genomi DNS-t, PCR-reakciótermékeket, jelölt oligonukleotidokat és mikrodisszekcióval nyert DNS-t használnak.

A próba jelölését különféle módokon végezhetjük, például nick-transzlációval vagy jelölt nukleotidokkal végzett PCR-rel.

Hibridizációs eljárás

A fluoreszcens hibridizációs kísérlet vázlata in situ hogy lokalizálja a gén helyzetét a sejtmagban

Az első lépés a szondák tervezése. A próba méretének elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy a hibridizáció egy adott helyen végbemenjen, de ne legyen túl nagy (legfeljebb 1 kb), hogy ne zavarja a hibridizációs folyamatot. Specifikus lókuszok azonosításakor vagy teljes kromoszómák festésekor meg kell akadályozni a DNS-próbák hibridizációját nem egyedi ismétlődő DNS-szekvenciákkal úgy, hogy jelöletlen DNS-ismétlődéseket (például Cot-1 DNS-t) adunk a hibridizációs keverékhez. Ha a DNS próba kettős szálú DNS, akkor azt denaturálni kell a hibridizáció előtt.

A következő szakaszban interfázisú magok vagy metafázisú kromoszómák preparátumait készítik elő. A sejteket szubsztrátumon rögzítik, általában tárgylemezen, majd DNS-denaturációt végeznek. A kromoszómák vagy magok morfológiájának megőrzése érdekében a denaturálást formamid jelenlétében végezzük, ami lehetővé teszi a denaturációs hőmérséklet 70 °C-ra csökkentését.

A megkötött DNS-próbák megjelenítését fluoreszcens mikroszkóp segítségével végezzük. A fluoreszcens jel intenzitása számos tényezőtől függ - a szonda jelölési hatékonyságától, a szonda típusától és a fluoreszcens festék típusától.

Irodalom

Rubtsov N.B. Az emlős kromoszómákkal való munkavégzés módszerei: Proc. pótlék / Novoszib. állapot un-t. Novoszibirszk, 2006. 152 p.

Rubtsov N.B. Nukleinsavak hibridizációja in situ a kromoszóma-rendellenességek elemzésében. Fejezet a "Bevezetés a molekuláris diagnosztikába" című könyvben, 2. kötet. "Molekuláris genetikai módszerek az örökletes és onkológiai betegségek diagnosztizálásában" / Szerk. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaev. Oktatási irodalom orvosi egyetemek hallgatói számára. M.: Orvostudomány, 2011. T. 2. S. 100–136.

Megjegyzések

Wikimédia Alapítvány. 2010 .

Nézze meg, mi a "Fluoreszcens in situ hibridizáció" más szótárakban:

Ennek a kifejezésnek más jelentése is van, lásd a hibridizációt. DNS hibridizáció, nukleinsavak hibridizációja komplementer egyszálú nukleinsavak in vitro kombinációja egy molekulává. Teljes kiegészítő jelleggel ... ... Wikipédia

Meghatározás módja fluoreszcens in situ hibridizáció.

Vizsgált anyag Lásd a leírásban

Házi látogatás lehetséges

A vizsgálatot az emlőrák vagy gyomorrák egyéni adjuváns kemoterápiájának kiválasztására használják.

A mellrák (BC) az első helyen áll a nők onkológiai megbetegedései között. Az emlődaganat sejtjei különféle típusú receptorokat tartalmazhatnak, amelyek érzékenyek bizonyos anyagokra (hormonokra vagy más biológiailag aktív molekulákra). A hormonreceptorok (ösztrogén és progeszteron) vagy a 2-es típusú humán epidermális növekedési faktor receptor (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2) daganatsejtekben való jelenlététől függően a hormonreceptor-pozitív, a HER2-pozitív és a hármas negatív emlőrákot izolálják. . Ezt fontos figyelembe venni a terápia egyéni megválasztásánál és a kezelés sikerének előrejelzésénél.

A HER2 egy olyan receptor, amely a szövetekben jelen van, és normálisan részt vesz a sejtosztódás és -differenciálódás szabályozásában. Feleslege a daganatsejtek felszínén (hiperexpresszió) meghatározza a daganatok gyors, ellenőrizetlen növekedését, a metasztázisok magas kockázatát és egyes kezelési módok alacsony hatékonyságát. A HER2 hiperexpressziója az emlőrák egyes altípusaiban fokozott proliferációhoz és angiogenezishez, valamint az apoptózis (a sejtek genetikailag programozott önpusztulása) szabályozási zavarához vezet. Jelenleg vannak olyan gyógyszerek, amelyek a HER2 receptort célozzák. Ez különösen a Herceptin (trastuzumab), amely a HER2/neu receptorok elleni monoklonális antitest.

A HER2 (ErbB-2) onkogén amplifikációja és túlzott expressziója az emlőkarcinóma viszonylag specifikus eseménye, és gyakorlatilag nem fordul elő más lokalizációjú daganatokban. A gyomorrák (GC) azon kevés kivételek egyike: a HER2 aktivációt e szerv rosszindulatú daganatainak körülbelül 10-15%-ában észlelik, és ez korrelál a betegség agresszív lefolyásával. HER2-pozitív emlőrák esetén a HER2-receptorok feleslege lehet jelen a daganatsejtek felszínén (HER2-pozitív vagy Hercept-pozitív). Ez a jelenség az emlőrákban szenvedő nők 15-20% -ánál figyelhető meg. A HER2 állapot felmérése fontos a kezelési taktika meghatározásához.

A HER2/neu túlzott expressziójának és/vagy a HER2/neu gén amplifikációjának kimutatására szolgáló fő standardizált módszerek az immunhisztokémiai (IHC) módszer és a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH). Mindkét vizsgálatot szövettani preparátumokon (a tumoranyag paraffinba ágyazott metszetein) végezzük poliklonális antitestek (IHC), fluoreszcens próbák (FISH) és különféle képalkotó rendszerek felhasználásával.

Az IHC reakció eredményeinek értékelésekor az expressziót csak a tumor invazív komponensében vesszük figyelembe. A reakció eredményeit a teszt gyártója által kidolgozott és szakértők által jóváhagyott pontozási skála segítségével értékelik: 0, 1+, 2+, 3+. A 0 és 1+ besorolású Hercept-státuszt negatívnak kell tekinteni – nincs a fehérje túlzott expressziója, ami korrelál a génje amplifikációjának hiányával. A 3+-ra értékelt Hercept státusz pozitív, azaz fehérje túlzott expressziója van jelen, ami korrelál a génamplifikáció jelenlétével. A Hercept 2+ státusz határozatlannak minősül, azaz az immunhisztokémiai reakció alapján meghatározott fehérje expressziót nem lehet magabiztosan megítélni a génamplifikáció alapján, ezért olyan vizsgálatra van szükség, amely közvetlenül feltárja az amplifikáció meglétét vagy hiányát. A FISH-módszert ugyanabból a mintából (blokkból) származó metszeteken alkalmazzák, amelyeken az immunhisztokémiai vizsgálatot elvégezték. A FISH-hibridizáció során a HER2 génamplifikáció jelenlétét a 17. kromoszóma centromer régióját jelölő vörös fluoreszcens (a jelölt HER2 géneknek megfelelő) és zöld fluoreszcens jelek arányának megszámlálásával értékelik. A 2-nél nagyobb arány a HER2 amplifikáció jelenlétét jelzi. A FISH módszer érzékenyebb, mint az IHC, mivel lehetővé teszi az amplifikáció jelenlétének vagy hiányának közvetlen értékelését.

Kutatási anyag: paraffin blokk tumorbiopsziával.

Figyelem! SZÜKSÉGSZERŰEN:

tárgylemez IHC-festéssel HER2/neu elleni antitestekkel
orvosi beutaló vagy kivonat a Her-2/neu elleni antitestekkel végzett szövettani és IHC vizsgálat eredményeivel

Irodalom

Zavalishina L.E., Frank G.A. A HER2 állapot morfológiai vizsgálata. Módszertan és atlasz. - M.: Szerk. Media Medica. 2006:98.
Rosszindulatú betegségek Oroszországban 2011-ben (morbiditás és mortalitás). Szerk. AZ ÉS. Chissova, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. - M.: FGBU "MNIOI őket. P.A. Herzen" az Orosz Egészségügyi Minisztériumtól. 2013:289.
Onkológia. Klinikai irányelvek. Orosz Onkológusok Szövetsége. Szerk. AZ ÉS. Chissova, S.L. Darjalova. - M.: Szerk. "GEOTAR-Média". 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. et al. Trastuzumab kemoterápiával kombinálva, szemben a kemoterápiával önmagában a HER2-pozitív előrehaladott gyomor- vagy gyomor-nyelőcső-csatlakozási rák (ToGA) kezelésére: 3. fázisú, nyílt, randomizált, kontrollált vizsgálat. Gerely. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Diagnosztikai immunhisztokémia: Theranostic and Genomical Applications. Elsevier, 4. kiadás. 2013:960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No. 10. Lyon, Franciaország: International Agency for Research on Cancer; 2010. Elérhető: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. A találkozó kiemelt eseményei: Nemzetközi szakértői konszenzus a korai emlőrák elsődleges terápiájáról, 2005. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. A női nemi szervek daganatainak WHO osztályozása. WHO Press, 4. kiadás. 2014; 4:316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. et al. A Her2/neu amplifikáció független prognosztikai tényező a gyomorrákban. Emésztőrendszeri betegségek és tudományok. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D. et al. Adjuváns trastuzumab HER2-pozitív emlőrákban. A New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.