هیبریداسیون درجا فلورسنت هیبریداسیون درجا فلورسانس (FISH)

در برخی موارد، تحقیقات سیتوژنتیک برای نتیجه گیری در مورد کاریوتیپ کافی نیست، در این موارد از روش های سیتوژنتیک مولکولی، به ویژه هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) استفاده می شود.

ظهور فن‌آوری‌های جدید سیتوژنتیک مولکولی، که عمدتاً مبتنی بر هیبریداسیون درجا اسیدهای نوکلئیک است، به طور قابل‌توجهی امکانات تشخیص کروموزومی را گسترش داده است. روش هیبریداسیون درجا برای بومی سازی توالی های DNA خاص به طور مستقیم بر روی آماده سازی سیتولوژی توسعه داده شد. انتقالی در شناسایی کروموزوم ها و مناطق کروموزومی از تجزیه و تحلیل سازمان سیتولوژیک کروموزوم به تجزیه و تحلیل توالی های DNA که آنها را تشکیل می دهند وجود داشت. مقایسه اثربخشی روش‌های سیتولوژی کلاسیک برای تشخیص و تجزیه و تحلیل بازآرایی‌های کروموزومی، مانند رنگ‌آمیزی کروموزومی افتراقی، با فناوری‌های سیتوژنتیک مولکولی مدرن نشان داده است که در اختلالات خونی، تجزیه و تحلیل سیتولوژیک کروموزوم‌ها تنها حدود یک سوم تغییرات کروموزومی را به درستی شناسایی و شناسایی می‌کند. شناسایی با استفاده از کاریوتایپ طیفی (SKY) ... حدود یک سوم از بازآرایی ها با روش های سیتولوژیک به اشتباه شناسایی می شوند و یک سوم کاملاً مورد توجه قرار نمی گیرند. روش‌های کلاسیک آنالیز سیتوژنتیک می‌توانند تنها حدود 15 درصد از بازآرایی‌های کروموزومی شناسایی شده با استفاده از SKY را نشان دهند.

روش FISH از مولکول های فلورسنت برای رنگ آمیزی ژن ها یا کروموزوم ها در داخل بدن استفاده می کند. این روش برای نقشه برداری از ژن ها و شناسایی ناهنجاری های کروموزومی استفاده می شود.

این تکنیک با تهیه توالی‌های DNA کوتاه، به نام پروب، که مکمل توالی‌های DNA موضوع مطالعه هستند، آغاز می‌شود. کاوشگرها به نواحی مکمل DNA هیبرید می شوند (پیوند می شوند) و با توجه به این که با برچسب فلورسنت برچسب گذاری شده اند، به شما امکان می دهند محل قرارگیری ژن های مورد نظر را در DNA یا کروموزوم ها مشاهده کنید. برخلاف سایر روش‌های مطالعه کروموزوم‌ها که نیاز به تقسیم سلولی فعال دارند، FISH را می‌توان روی سلول‌های غیرقابل تقسیم انجام داد که این روش را انعطاف‌پذیر می‌کند.

FISH را می توان برای اهداف مختلف با استفاده از سه نوع کاوشگر مختلف استفاده کرد:

• * کاوشگرهای اختصاصی مکان که به مناطق خاصی از کروموزوم ها متصل می شوند. این کاوشگرها برای شناسایی توالی کوتاه موجود از DNA جدا شده، که برای تهیه یک پروب نشاندار شده و هیبریداسیون بعدی آن با مجموعه ای از کروموزوم ها استفاده می شود، استفاده می شود.
• * پروب های تکرار آلفوئید یا سانترومر، توالی های تکرار شونده از مناطق سانترومر کروموزوم ها هستند. با کمک آنها، هر کروموزوم را می توان به رنگ متفاوتی رنگ کرد، که به شما امکان می دهد به سرعت تعداد کروموزوم ها و انحراف از تعداد طبیعی آنها را تعیین کنید.
• * پروب‌های کل کروموزوم مجموعه‌ای از پروب‌های کوچک هستند که مکمل بخش‌های جداگانه کروموزوم هستند، اما عموماً تمام طول آن را می‌پوشانند. با استفاده از کتابخانه ای از چنین کاوشگرهایی، می توان کل کروموزوم را "رنگ" کرد و کاریوتیپ طیفی تفاضلی یک فرد را به دست آورد. این نوع تجزیه و تحلیل برای تجزیه و تحلیل انحرافات کروموزومی، به عنوان مثال، جابجایی، زمانی که قطعه ای از یک کروموزوم به شانه کروموزوم دیگری منتقل می شود، استفاده می شود.

هیبریداسیون درجا فلورسنت (FISH)

مواد برای تحقیق خون، مغز استخوان، بیوپسی تومور، جفت، بافت جنینی یا مایع آمنیوتیک است. نمونه های تحقیق باید تازه به آزمایشگاه تحویل داده شود. اسلایدها (اسلایدها) مستقیماً از نمونه های بافتی یا پس از کشت تهیه می شوند. می توان از هر دو آماده سازی سلولی متافاز و اینترفاز استفاده کرد. کاوشگرهای DNA خاص نشاندار شده با فلورسنت با DNA کروموزومی هیبرید می شوند و پروب های متعدد را می توان به طور همزمان در مکان های مختلف استفاده کرد.

FISH یک روش مفید و حساس برای تجزیه و تحلیل سیتوژنتیک برای تشخیص انحرافات کمی و کیفی کروموزومی، مانند حذف (از جمله حذف میکرو)، جابجایی، دو برابر شدن و آنیوپلوئیدی است. FISH روی کروموزوم های اینترفاز روشی سریع برای تشخیص قبل از تولد تریزومی های 21، 18 یا 13 کروموزوم یا ناهنجاری های کروموزوم جنسی است. در انکولوژی، FISH می تواند تعدادی جابجایی (bcr/abl، MLL، PML/RARA، TEL/AML1) مرتبط با نئوپلاسم های بدخیم هماتولوژیک را تشخیص دهد. این روش همچنین می تواند برای نظارت بر اثرات باقیمانده سرطان پس از شیمی درمانی و پیوند مغز استخوان و شناسایی انکوژن های تقویت شده (c-myc / n-myc) مرتبط با پیش آگهی ضعیف برای برخی تومورها مورد استفاده قرار گیرد. FISH همچنین برای نظارت بر میزان بقای آلوگرافت مغز استخوان به دست آمده از فردی از جنس مخالف استفاده می شود.

FISH یک روش حساس برای شناسایی انحرافات کروموزومی و برای تجزیه و تحلیل سریع یک مرحله ای تعداد سلول های بزرگ (بیش از 500) است. این روش در شناسایی ماهیت کروموزوم ها و قطعات ناشناخته DNA کروموزومی بسیار دقیق است.

سیتوژنتیک سنتیهنگام مطالعه کاریوتایپ، همیشه با سطح وضوح باند محدود می شد. حتی با استفاده از روش‌های رنگ‌آمیزی دیفرانسیل کروموزوم با وضوح بالا، ما فقط نوارهای بیشتری را روی کروموزوم تشخیص دادیم، اما مطمئن نبودیم که به سطح وضوح مولکولی می‌رسیم. پیشرفت های اخیر در فناوری DNA و سیتوژنتیک امکان استفاده از روش های FISH را برای تجزیه و تحلیل تغییرات DNA کروموزومی در سطح مولکولی فراهم کرده است. سیتوژنتیک مولکولی یک پیشرفت انقلابی در سیتوژنتیک ایجاد کرده است که اجازه می دهد:

تجزیه و تحلیل ساختار کروموزوم های DNA در محدوده 10-100 کیلو باز.
برای انجام تشخیص سلول های اینترفاز غیرقابل تقسیم، که تأثیر زیادی بر تشخیص قبل از تولد و تشخیص ژنتیکی قبل از لانه گزینی (PGD) داشت.

تکنولوژی FISHاز یک پروب DNA استفاده می کند که توالی های DNA خاصی را در یک کروموزوم متصل یا بازپخت می کند. پروب دناتوره شده با DNA مادری سلول، همچنین به حالت تک رشته ای دناتوره شده، انکوبه می شود. پروب جایگزین بیوتین-دئوکسی یوریدین تری فسفات یا دیگوکسیژنین-اوریدین تری فسفات با تیمیدین می شود. پس از بازسازی مجدد پروب DNA بومی با یک پروب، کمپلکس پروب-DNA را می توان با افزودن آویدین نشاندار شده با فلوروکروم، که به بیوتین یا آنتی دیگوکسیژنین نشاندار شده با فلوروکروم متصل می شود، شناسایی کرد. تقویت اضافی سیگنال را می توان با افزودن آنتی آویدین و مطالعه کمپلکس حاصل با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس به دست آورد. با علامت گذاری پروب های DNA مختلف با چندین فلوروکروم مختلف، می توان همزمان چندین کروموزوم یا بخش کروموزومی را در یک سلول به شکل سیگنال های چند رنگ مشاهده کرد.

امکان تعیین بخش های ژنی خاصوجود یا عدم وجود روی کروموزوم‌ها، تشخیص سندرم‌های توالی ژنی در سطح DNA و همچنین جابه‌جایی در هسته‌های بین فازی، اغلب در سلول‌های منفرد را ممکن می‌سازد.

مواد برای ماهیمی تواند کروموزوم متافازی باشد که از سلول های در حال تقسیم به دست می آید یا هسته های بین فازی از سلول هایی که در مرحله تقسیم نیستند. بخش‌ها با RNase و پروتئیناز پیش تیمار می‌شوند تا RNA حذف شود، که می‌تواند با پروب و کروماتین هیبریدیزه شود. سپس در فرمامید حرارت داده می شود تا DNA را دناتوره کند و با الکل یخی ثابت می شود. سپس پروب با حرارت دادن برای هیبریداسیون آماده می شود. پس از آن، پروب و آماده سازی کروموزوم مخلوط شده و با یک پوشش در دمای 37 درجه سانتیگراد برای هیبریداسیون مهر و موم می شوند. با تغییر دمای جوجه کشی یا ترکیب نمک محلول هیبریداسیون، ویژگی اتصال و برچسب زدن پس زمینه را می توان کاهش داد.

کاربرد هیبریداسیون درجا فلورسنت - فناوری FISH

کارایی فناوری FISHبرای اولین بار در محلی سازی ژن ها نشان داده شد. با معرفی روش برچسب‌گذاری فلورسنت، هیبریداسیون درجا ثابت شده است که برای تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی که با روش‌های باندبندی سنتی تشخیص داده نمی‌شوند ضروری است. FISH همچنین نقشی کلیدی در یکی از خارق‌العاده‌ترین اکتشافات در ژنتیک مدرن - نقش‌گذاری ژنومی - ایفا کرد.

تکنولوژی توسعه آن ماهیبه سه شکل دریافت شد. کاوشگرهای سانترومری یا آلفا-ماهواره ای با ویژگی کروموزومی نسبی مشخص می شوند؛ آنها اغلب در ژنتیک سلول های اینترفاز استفاده می شوند. این پروب‌ها سیگنال‌های تا حدی منتشر با قدرت کافی در ناحیه سانترومر تولید می‌کنند، اما با کروموزوم‌هایی که توالی‌های سانترومر مشابهی دارند هیبرید نمی‌شوند. در حال حاضر، کاوشگرهای تک کپی ساخته شده اند که سیگنال مجزایی را از باند خاصی از کروموزوم می دهند و امکان جلوگیری از پدیده هیبریداسیون متقابل را فراهم می کنند. این پروب ها همچنین می توانند برای تعیین تعداد کپی و مناطق خاص کروموزوم، که احتمالاً با یک سندرم خاص مرتبط هستند، استفاده شوند. پروب های تک کپی و سانترومر طراحی شده برای کروموزوم های 13، 18، 21، X و Y برای تشخیص قبل از تولد استفاده می شود.

همچنین می توان کل کروموزوم ها را با آن "لکه دار کرد". ماهی... به لطف فناوری کاریوتایپینگ طیفی، که از مخلوطی از فلوروکروم های مختلف استفاده می کند، اکنون می توان یک الگوی فلورسنت منحصر به فرد برای هر کروموزوم جداگانه با 24 رنگ مجزا ایجاد کرد. این فناوری امکان تعیین بازآرایی های پیچیده کروموزومی را فراهم می کند که با استفاده از تکنیک های سیتوژنتیک سنتی قابل مشاهده نیستند.

روش ماهیدر تشخیص قبل از تولد برای زنانی که در سنین باروری بالاتر هستند، بارداری می تواند دلیلی نه چندان شادی باشد که باعث اضطراب شود. با افزایش سن یک زن، خطر ابتلا به ناهنجاری های کروموزومی جنین همراه است. آمنیوسنتز انجام شده در هفته شانزدهم بارداری و به دنبال آن تجزیه و تحلیل کاریوتیپ، 10-14 روز طول می کشد. استفاده از FISH در معاینه اولیه می تواند تشخیص را تسریع کند و زمان انتظار را کاهش دهد. اکثر متخصصین ژنتیک و آزمایشگاه ها بر این عقیده هستند که روش FISH نباید به طور جداگانه برای تصمیم گیری در مورد مدیریت آینده بارداری استفاده شود. روش FISH باید با تجزیه و تحلیل کاریوتیپی تکمیل شود و نتایج آن حداقل باید با تصویر پاتولوژیک معاینه اولتراسوند (US) یا غربالگری بیوشیمیایی بر اساس خون مادر مرتبط باشد.

سندرم های ژنی دنباله هاهمچنین به عنوان سندرم حذف میکرو یا آنئوسمی سگمنتال شناخته می شود. اینها حذف قطعات کروموزوم مجاور هستند که معمولاً ژن های زیادی را شامل می شوند. سندرم های توالی ژن برای اولین بار در سال 1986 با استفاده از تکنیک های سیتوژنتیک کلاسیک توصیف شد. در حال حاضر، به لطف FISH، امکان شناسایی حذف های زیر میکروسکوپی در سطح DNA وجود دارد که امکان شناسایی کوچکترین ناحیه حذف شده مرتبط با ایجاد یک سندرم خاص به نام منطقه بحرانی را فراهم می کند. هنگامی که منطقه حیاتی برای یک سندرم شناسایی شد، اغلب می توان ژن های خاصی را شناسایی کرد که عدم وجود آنها به عنوان مرتبط با سندرم شناخته می شود. در کتابچه راهنمای نشانگان توالی ژنی که اخیراً منتشر شده است، 18 سندرم حذف و ریزحذف مرتبط با 14 کروموزوم گزارش شده است. برخی از شایع ترین سندرم های توالی ژنی و تظاهرات بالینی آنها در جدول نشان داده شده است. 5-2.

تلومرها- تشکیلاتی که انتهای بازوهای بلند و کوتاه کروموزوم ها را می پوشانند. آنها از توالی های تکراری TTAGGG تشکیل شده اند و از همجوشی انتهای کروموزوم ها با یکدیگر جلوگیری می کنند. کاوشگرهای تلومری نقش مهمی در شناسایی جابجایی های پیچیده ای دارند که با روش های سیتوژنتیک سنتی قابل تشخیص نیستند. علاوه بر این، یکی از اکتشافات پروژه ژنوم انسانی این واقعیت بود که نواحی کروموزوم های مجاور تلومرها از نظر ژن غنی هستند. اکنون نشان داده شده است که حذف های ساب تلومری زیر میکروسکوپی مسئول بروز بسیاری از بیماری های تعیین شده ژنتیکی هستند.

هیبریداسیون درجا اسیدهای نوکلئیک این روش مبتنی بر امکان تشکیل هیبریدهای دو رشته ای بین کاوشگرهای نشاندار شده است که به طور مصنوعی بر اساس توالی های تک رشته ای (ریبو یا دئوکسی ریبو، الیگو یا پلی نوکلئوتید) و توالی های مکمل آنها در اهداف ایجاد شده اند. - تجزیه و تحلیل مولکول های DNA یا RNA برای شناسایی مناطق هیبریداسیون، یک نمونه DNA (کاوشگر DNA) با یک گروه گزارشگر برچسب گذاری می شود: ü ایزوتوپ رادیواکتیو، فلوروکروم، آنزیمی که یک محصول رنگی یا درخشان می دهد، ü هاپتنی که جسم نشاندار شده به آن متصل می شود. و غیره.

با شناسایی یک هیبرید به دلیل وجود یک گروه گزارشگر در کاوشگر، می توان - تخمین تعداد ژن های کدکننده نوع خاصی از RNA، - تعیین نسبت DNA رونویسی نشده در ژنوم، - ایجاد کرد. پیوند ژنهای خاص با یکدیگر - و مکان دقیق آنها بر روی کروموزومها. روش هیبریداسیون مولکولی از حساسیت بالایی برخوردار است (می توان مقدار کمی از یک پروب نشاندار شده (10-15 و 10-19 M) و بر این اساس، یک توالی مکمل در هدف را تشخیص داد) و سرعت تجزیه و تحلیل، که باعث می شود امکان استفاده از این روش هم برای فعالیت های تحقیقاتی و هم برای تشخیص بیماری های ارثی و عفونی در پزشکی، دامپزشکی و نباتات وجود دارد.

ظهور فن‌آوری‌های جدید سیتوژنتیک مولکولی، که عمدتاً مبتنی بر هیبریداسیون درجا اسیدهای نوکلئیک است، به طور قابل‌توجهی امکانات تشخیص کروموزومی را گسترش داده است.

سیتوژنتیک اینترفاز: 1. باند کروموزومی چند رنگ (MCB). 2. هیبریداسیون درجا فلورسنت (FISH). 3. ترکیب FISH با روش های دیگر: سیتولوژی + FISH. بافت شناسی + FISH. - ایمونوفنوتایپینگ + FISH (FICTION)؛ سیتوژنتیک متافاز: 1. نقاشی کامل. 2. هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی (CGH). 3. کاریوتایپ تغییر رنگ (CCK). 4. کاریوتایپ چند رنگ: کاریوتایپ طیفی (SKY). ماهی چند رنگ (M - FISH، M - BAND).

FISH - fluorescence in situ hybridization یک روش سیتوژنتیکی است که برای شناسایی و بومی سازی توالی های DNA خاص روی کروموزوم ها، m.RNA و غیره استفاده می شود. این روش بر اساس هیبریداسیون یک پروب DNA / RNA نشاندار شده با فلورسنت با یک توالی DNA / RNA مکمل است. شناسایی برچسب با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس انجام می شود. روش FISH بیش از 30 سال پیش معرفی شد. به طور گسترده ای به عنوان روشی برای نقشه برداری فیزیکی ژن ها روی کروموزوم ها پذیرفته شده است. بعداً در سایر زمینه‌های تحقیقاتی (در زمینه‌های ژنتیک بالینی، پزشکی تولیدمثل، سم‌شناسی، زیست‌شناسی تکاملی، ژنومیک سلولی و مقایسه‌ای، و زیست‌شناسی کروموزومی) به کار گرفته شد. در حال حاضر، FISH عمدتا برای ساختن نقشه های فیزیکی و ژنتیکی کروموزوم ها، شناسایی بازآرایی های ساختاری، جابجایی ها، ریزحذف ها، تقویت ژن در کروموزوم های بین فازی و متافازی استفاده می شود. در نتیجه پیشرفت علم (درک بهتر از خواص شیمیایی و فیزیکی اسیدهای نوکلئیک و کروماتین)، و همچنین توسعه میکروسکوپ فلورسانس و تصویربرداری دیجیتال، این روش به طور مداوم بهبود یافته است (بهبود حساسیت، ویژگی، وضوح) ، و انواع مختلفی از این روش ایجاد شده است.

1) سلول ها روی یک لام شیشه ای ریخته می شوند که باعث پخش شدن کروموزوم ها می شود. 4) کروموزوم ها با استفاده از DAPI رنگ آمیزی متقابل می شوند. 2) پروب دارای برچسب فلورسنت روی کروموزوم ها قرار می گیرد و مهر و موم می شود. 3) پروب و کروموزوم ها دناتوره می شوند، هیبرید می شوند و سپس شسته می شوند. 5) اسلاید زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می شود.

نمای کلی پروتکل مرحله بندی FISH را می توان به صورت زیر ارائه کرد: 1. تهیه نمونه بافت شناسی یا سیتولوژی. آماده سازی نمونه بافت شناسی طبق طرح استاندارد انجام می شود: برش، علامت گذاری، سیم کشی، پر کردن، میکروتومی، قرار دادن بخش بر روی یک اسلاید شیشه ای و موم زدایی. هنگام تهیه یک آماده سازی سیتولوژیک، از محلول های رسوب دهنده ویژه و سانتریفیوژ استفاده می شود که امکان به دست آوردن سوسپانسیون متمرکز سلول ها را فراهم می کند. 2. پیش پردازش (در صورت لزوم). این دارو با پروتئازها درمان می شود تا حضور پروتئین هایی که مانع هیبریداسیون می شوند از بین برود. 3. استفاده از پروب DNA برای آماده سازی و دناتوراسیون بعدی. به منظور دناتوره کردن پروب و DNA نمونه، آنها را با فرمامید درمان کرده و تا دمای حدود 900-85 درجه سانتیگراد گرم می کنند.

4. هیبریداسیون. پس از دناتوره کردن، آماده سازی تا دمای معینی (در مورد مطالعات بالینی 370 درجه سانتیگراد) خنک می شود و در یک محفظه مرطوب به مدت چند ساعت انکوبه می شود (مدت انکوباسیون در هر پروتکل خاص نشان داده شده است). در حال حاضر از هیبریدایزرهای اتوماتیک برای دناتوره سازی و هیبریداسیون استفاده می شود. 5. گرگرفتگی. پس از تکمیل هیبریداسیون، شستن کاوشگرهای غیر متصل ضروری است، که در غیر این صورت، پس زمینه ای ایجاد می کند که ارزیابی نتایج تجزیه و تحلیل FISH را دشوار می کند. برای شستشو معمولاً از محلولی حاوی سیترات و کلرید سدیم (SSC) استفاده می شود. 6. ضد لک. با استفاده از رنگ های فلورسنت (DAPI - 4، 6-diamidine-2 phenylindol; propidium iodide)، تمام DNA هسته ای رنگ آمیزی می شود. 7. تجزیه و تحلیل نتایج با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت. عملیات معمول (مووم زدایی، پیش تصفیه، شستشو) می تواند خودکار باشد.

مطالعه نواحی تلومری با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس تصاویر به دست آمده در مرحله اینترفاز (هسته) و متافاز (کروموزوم های مجزا) با هم ترکیب می شوند. رنگ آبی - DAPI.

مزایای روش FISH: 1. توانایی مطالعه مواد ژنتیکی در هسته های بین فازی. 2. به دست آوردن نتایج عینی با توجه به اصل "بله / خیر" یک روش کمی است؛ 3. تفسیر نسبتاً ساده از نتایج؛ وضوح بالا. معایب روش FISH: 1. رنگ های فلورسنت به سرعت "محو" می شوند؛ 2. با کیفیت بالا. برای تجزیه و تحلیل نتایج به رنگ های فلورسنت با کیفیت نیاز است.

روش FISH بر اساس یک واکنش هیبریداسیون بین یک کاوشگر DNA ایجاد شده با استفاده از فناوری های ویژه است که یک توالی نوکلئوتیدی با اندازه محدود است و یک بخش مکمل از DNA هسته ای آماده سازی سیتوژنتیک مورد مطالعه. کاوشگر DNA - عنصر اصلی برای مرحله بندی FISH دارای یک "برچسب" است، به عنوان مثال، حاوی نوکلئوتیدهایی است که مستقیماً با یک فلوروکروم یا هاپتن برای تجسم بیشتر با آنتی بادی های حامل فلوروکروم مرتبط است. DNA نشاندار نشده شسته می شود و سپس پروب DNA هیبرید شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس تشخیص داده می شود.

برچسب گذاری DNA به دو دسته مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می شود. معرفی مستقیم برچسب گذاری به DNA عناصر گزارشگر - - فلوروکروم ها (رودامین، دی اتیل آمینوکومارین، قرمز تگزاس، و غیره). روش برچسب‌گذاری غیرمستقیم - نمونه DNA با لیگاندهای میانی (بیوتین، دی‌اکسیژنین، 2،4-دی‌نیتروفنول) از پیش کونژوگه می‌شود، که حضور آن در آماده‌سازی سیتولوژیک با استفاده از فلوروکروم‌ها تشخیص داده می‌شود. در این مورد، حساسیت روش به طور قابل توجهی افزایش می یابد، زیرا لیگاند می تواند دارای چندین مکان برای تعامل با فلوروکروم باشد. برای اولین بار هیبریداسیون درجا با یک کاوشگر نشاندار 32 P در سال 1969 توصیف شد. توسعه سیستم‌های غیر رادیواکتیو برای برچسب‌گذاری و شناسایی پروب‌های DNA، روش هیبریداسیون درجا را ایمن، پیاده‌سازی ساده و در پردازش نتایج کم‌تر کرده است. رنگ های فلورسنت نرم و آسان برای استفاده هستند، می توانند به طور نامحدود ذخیره شوند، وضوح بالایی دارند و اجازه می دهند چندین توالی DNA به طور همزمان بررسی شوند.

پروب ها: پروب های برچسب دار تک رشته ای / دو رشته ای DNA / RNA اولیه / ثانویه. کاوشگرها به صورت مستقیم نشان‌گذاری می‌شوند: 1) مستقیماً: با قرار دادن نوکلئوتیدهایی که فلوروکروم به آنها متصل است (PCR یا ترجمه نیک) 2) از طریق یک مولکول گزارشگر (مثلاً دیگوکسیژنین، بیوتین) که آنتی‌بادی‌های نشاندار شده با فلورسنت به آن متصل می‌شوند. برای تقویت سیگنال، می توانید از آنتی بادی های ثانویه، سوم و غیره که با برچسب فلورسنت برچسب گذاری شده اند استفاده کنید. DNase Nicks DNA Nick Translation DNA polymerase I نوکلئوتیدهای جدیدی را به 3 هیدروکسیل DNA پلیمراز I اضافه می کند. 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole; اتصال قوی به مناطق DNA غنی از A-T. تحریک توسط نور UV؛ انتشار 461 نانومتر (آبی).

در حال حاضر، چندین رویکرد اصلی وجود دارد که به طور گسترده در سیتوژنتیک مولکولی مدرن استفاده می شود: شناسایی مواد از مناطق کروموزومی گسترده و کروموزوم های کامل. تشخیص یک توالی DNA خاص در ناحیه مورد نظر. تجزیه و تحلیل عدم تعادل در مناطق کروموزومی فردی. پروب های DNA مخصوص کروموزوم و ناحیه خاص ("کاوشگرهای نقاشی") به طور گسترده برای شناسایی مواد مناطق کروموزومی گسترده و کروموزوم های کامل استفاده می شود.

مشخصات انواع مختلف پروب ها 1. پروب های اختصاصی مکان (LSI - مکان - شناسه های اختصاصی، که به مناطق خاصی از کروموزوم ها متصل می شوند.) این پروب ها برای شناسایی توالی کوتاه (غیر تکرار شونده) DNA ایزوله شده استفاده می شوند. برای تهیه یک پروب نشاندار و هیبریداسیون بعدی آن با مجموعه ای از کروموزوم ها استفاده می شود. آنها برای تشخیص انحرافات کروموزومی مهم تشخیصی و پیش آگهی در شرایط مختلف پاتولوژیک (مونوسومی و تریزومی برای کروموزوم های فردی) طراحی شده اند. گسترده ترین توزیع این نمونه ها در تشخیص سیتوژنتیک قبل از تولد، به ویژه در مطالعات سلول های بافت کوریونی، هسته های بین فاز آمنیوسیت ها به دست آمد.

2. DNA - کاوشگرهای نواحی تلومری کروموزوم ها (TEL telomericprobe) برای شناسایی حذف ها و بازآرایی های موثر بر نواحی انتهایی بازوهای کروموزوم ها طراحی شده اند. چنین کاوشگرهایی مخصوص بازوهای p یا q کروموزوم ها هستند و مکمل ناحیه ای به طول حدود 300 کیلوبایت هستند. از انتهای کروموزوم به عنوان یک قاعده، کاوشگرهای DNA برای بازوهای کوتاه و بلند کروموزوم ها با فلوروکروم های مختلف مرتبط هستند، که امکان شناسایی هر دو ناحیه تلومری کروموزوم را در یک آماده سازی سیتوژنتیکی ممکن می سازد.

3. کاوشگرهای سانترومر-تکرار، آلفوئید یا شمارشگرهای کروموزومی (CEP - centromere. Enumeration. Probe) کاوشگرهای DNA مخصوص کروموزوم هستند که با توالی هایی از تکرارهای ماهواره ای آلفا و بتا پشت سر هم نشان داده می شوند. این تکرارها عمدتاً در مناطق هتروکروماتین سانترومر یا پریسانترومریک کروموزوم ها قرار دارند. با کمک آنها، هر کروموزوم را می توان به رنگ متفاوتی رنگ آمیزی کرد، که به شما امکان می دهد به سرعت تعداد کروموزوم ها و انحرافات از تعداد طبیعی آنها، 4. پروب برای کل کروموزوم، پروب کل کروموزوم (WCP - Whole-Chromosome-Painting) را تعیین کنید. مجموعه‌ای از پروب‌های کوچک هستند که مکمل بخش‌های جداگانه کروموزوم هستند، اما عموماً تمام طول آن را می‌پوشانند. با استفاده از کتابخانه ای از چنین کاوشگرهایی، می توان کل کروموزوم را "رنگ" کرد و کاریوتیپ طیفی تفاضلی یک فرد را به دست آورد. این نوع تجزیه و تحلیل برای تجزیه و تحلیل انحرافات کروموزومی، به عنوان مثال، جابجایی، زمانی که قطعه ای از یک کروموزوم به شانه کروموزوم دیگری منتقل می شود، استفاده می شود.

زمینه های کاربرد FISH به طور گسترده برای حل وظایف تشخیصی بالینی زیر استفاده می شود: 1. قبل از لانه گزینی قبل از تولد و تشخیص ناهنجاری های کروموزومی. در کلینیک های لقاح آزمایشگاهی (IVF) و مراکز پری ناتال استفاده می شود. به شما این امکان را می دهد که به موقع (قبل از کاشت جنین در مورد IVF یا در مراحل اولیه رشد جنین) اختلالات ژنتیکی را در نوزاد متولد نشده شناسایی کرده و اقدامات لازم را انجام دهید. 2. انکوهماتولوژی. بیماری های انکوهماتولوژیک در نتیجه ناهنجاری های کروموزومی مختلف ایجاد می شوند، بنابراین از پروب های مناسب CEP و LSI برای تشخیص آنها استفاده می شود. 3. تشخیص تومورهای جامد. در حال حاضر، بیشتر و بیشتر روابط علت و معلولی بین توسعه بیماری های سرطانی خاص و تغییرات خاص در ژنوم ایجاد می شود. بنابراین با استفاده از پروب های DNA مناسب می توان تشخیص FISH انکولوژیک را انجام داد.

سیتوژنتیک اینترفاز: ترکیب FISH با روش های دیگر: - ایمونوفنوتایپینگ FISH (FICTION). + FICTION (فلورسانس ایمونوفنوتایپ و سیتوژنتیک رابط به عنوان ابزاری برای بررسی نئوپلاسم ها) - برای مطالعه سلول های تومور. برای این آزمایش، از اسمیرهای بدون رنگ خون، مغز استخوان یا سایر آماده‌سازی‌های بافتی استفاده می‌شود. مرحله 1 - آماده سازی با آنتی بادی های مونوکلونال خاص انکوبه می شود، مرحله 2 - کونژوگه با فلوروفورها برای تجسم بعدی مجموعه آنتی ژن-آنتی بادی مونوکلونال انجام می شود. مرحله 3 - هیبریداسیون درجا با پروب های DNA انجام دهید. برای تشخیص آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و پروب‌های DNA، از فلوروفورهایی استفاده می‌شود که از نظر رنگ متفاوت هستند. مطالعه آماده سازی در زیر میکروسکوپ فلورسانس در حضور مجموعه ای از فیلترها، امکان تجزیه و تحلیل همزمان ایمونوفنوتیپ هیبریداسیون و سیگنال ها را در هسته های بین فازی فراهم می کند.

حذف کروموزومی TNFAIP 3 در سال. HL توسط interphasecytogenetics شناسایی شد. FICTION تجزیه و تحلیل از. نماینده ج. ترکیب موارد HL بیان CD 30 (قرمز) و پروب های FISH برای TNFAIP 3 و کروموزوم 6 سانترومر (آبی [b]). در سنجش دو رنگ در A - C و E و F، پروب TNFAIP 3 با رنگ سبز (g) مشخص شده است. در سنجش سه رنگ اعمال شده در D، پروب TNFAIP 3 یک سیگنال colocalized (co) گرم به رنگ نارنجی می دهد. دو استراتژی مختلف برای نمایش سنجش های FISH دو و سه رنگ در ترکیب با ایمونوفلورسانس CD 30 استفاده می شود. من. ه. سنجش دو رنگ (A - C و E و F) با استفاده از یک نمایشگر سه رنگ نشان داده می شوند، در حالی که یک نمایشگر چند رنگ کاذب که توسط نرم افزار Isis به دست آمده است برای سنجش سه رنگ (D) استفاده می شود تا به طور همزمان چهار رنگ را نشان دهد. به عنوان مثال، CD 30 [r]، TNFAIP 3 [g] و نارنجی، و کروموزوم 6 سانترومر [b]).

ضبط دیجیتالی ریز تصاویر امکان تبدیل ترکیبی از فلوروفورها به شبه رنگ ها، بلکه نسبت و شدت آنها را نیز فراهم کرده است.

رنگ آمیزی کروموزوم چند رنگ (Muli. Color Banding - MCB) این روش برای تجزیه و تحلیل کامل همه کروموزوم ها نیست، بلکه برای تجزیه و تحلیل دقیق یک کروموزوم فردی در نظر گرفته شده است. کاوشگرهای DNA اختصاصی لوکوس با فلوروفورها یا ترکیبی از فلوروفورهای مختلف برچسب‌گذاری می‌شوند تا سطح سیگنال هر یک از پروب‌های DNA از نظر شدت متفاوت باشد. همپوشانی پروفیل‌های شدت سیگنال‌های پروب‌های DNA، تغییراتی را در نسبت‌های شدت فلورسانس فلوروفورهای مختلف در طول کروموزوم ایجاد می‌کند. نسبت های شدت را می توان به شبه رنگ ها ترجمه کرد و بنابراین، هر نقطه از تصویر، و بنابراین، هر یک از مکان های کروموزومی، شبه رنگ خود را خواهد داشت. این نسخه از روش FISH چند رنگ در تجزیه و تحلیل نه تنها بین کروموزومی، بلکه همچنین بازآرایی های داخل کروموزومی در سرطان بسیار موثر است. اما برای کاربرد موفقیت آمیز آن لازم است ابتدا کروموزوم مورد بررسی مشخص شود. این روش سیتوژنتیک مولکولی برای تجزیه و تحلیل ناهنجاری های کاریوتیپ مرتبط با کروموزوم های خاص مناسب است.

تا به امروز، مجموعه‌ای از کاوشگرهای DNA ایجاد شده‌اند که MSV را برای همه کروموزوم‌های انسانی فراهم می‌کنند. کتابخانه‌های DNA ویژه ناحیه روی کروموزوم 5؛ نواربندی چند رنگ کروموزوم 5؛ ایدیوگرام کروموزوم 5؛ فلوئوروکروم‌های مورد استفاده برای MCV).

سیتوژنتیک متافاز، که از نظر تاریخی زودتر از اینترفاز ظهور کرده است، به فرد اجازه می دهد تا طیف وسیعی از ناهنجاری های کروموزومی را تعیین کند، اما برای این امر لازم است سلول های مورد مطالعه در مرحله متافاز میوز باشند.

کاریوتایپینگ چند رنگ تجزیه و تحلیل با استفاده از پروب های DNA برای رنگ آمیزی مداوم به بازوها یا کل کروموزوم ها (کاوشگرهای WCP - رنگ کل کروموزوم) انجام می شود. چنین کاوشگرهایی با توالی های کوتاه DNA متعددی که در طول کل کروموزوم قرار دارند هیبرید می شوند. بنابراین، هنگامی که در زیر میکروسکوپ فلورسانس بررسی می شود، کروموزوم یکنواخت در یک رنگ خاص به نظر می رسد.

پروب‌های DNA مورد استفاده برای این تجزیه و تحلیل شامل مخلوطی از پروب‌های رنگ‌آمیزی جامد برای مجموعه کاملی از کروموزوم‌های انسانی است که با استفاده از ترکیبی از چندین فلوروکروم برچسب‌گذاری شده‌اند که نسبت آن‌ها به صورت جداگانه برای هر جفت کروموزوم انتخاب می‌شود. استفاده از روش های ثبت نام مناسب و برنامه های کامپیوتری برای تجزیه و تحلیل تصویر، ارزیابی شدت درخشندگی تمام فلوئوروکروم ها برای هر نقطه از تصویر، امکان انجام کاریوتایپینگ را فراهم می کند که در آن هر جفت کروموزوم "شبه رنگ" منحصر به فرد خود را دارد. .

M-FISH (چند هدف چند رنگی یا چند رنگی. FISH) نام عمومی ماهی چند رنگ سنتی با استفاده از کیت های فیلتر مخصوص فلوروکروم است. اصل M-FISH شامل ثبت دیجیتال جداگانه سیگنال تمام فلورکروم های استفاده شده است که با تعویض متوالی مجموعه فیلترها به دست می آید. همه تصاویر در فایل های جداگانه ضبط می شوند که امکان پردازش کارآمد آنها را در ارتباط با جداسازی سیگنال و پس زمینه و همچنین ارزیابی کمی سیگنال فراهم می کند. پردازش تمام اطلاعات ثبت شده با استفاده از نرم افزار ویژه، اطلاعات مربوط به سطح سیگنال های فلوروکروم در هر نقطه از تصویر را به رنگ های شبه تبدیل می کند. یکی از محدودیت‌های اصلی تعداد پروب‌های DNA مورد استفاده، تعداد فلوئوروکروم‌های موجود، با طیف‌های تحریک و انتشار غیرهمپوشانی، و در دسترس بودن مجموعه‌های فیلتر مناسب است.

FISH 24 رنگی M-FISH به طور گسترده به عنوان ماهی 24 رنگ برای شناسایی همزمان مواد از همه کروموزوم های انسان استفاده می شود. در تشخیص جابجایی های کروموزومی بسیار موثر است، اما برای تشخیص حذف ها و وارونگی ها طراحی نشده است. با این حال، این مشکل را می توان تا حدی با رنگ آمیزی همزمان کروموزوم ها با DAPI حل کرد، که امکان تجزیه و تحلیل striation تفاضلی کروموزوم ها را فراهم می کند، وابستگی کروموزومی مواد آن قبلاً شناسایی شده است. متأسفانه، باید توجه داشت که کیفیت باند DAPI کروموزوم ها پس از M-FISH به طور قابل توجهی از رنگ آمیزی افتراقی GTG و حتی باند DAPI پس از هیبریداسیون درجا معمولی پایین تر است.

Rx. FISH اصل M-FISH برای تولید بارکد چند رنگ کروموزوم های انسانی و روش نواربندی کروموزوم چند رنگ بر اساس هیبریداسیون درجا بین گونه ها استفاده شده است. برخلاف ماهی 24 رنگی، این روش به شخص اجازه می دهد تا به طور مستقیم برخی از بازآرایی های داخل کروموزومی را آشکار کند. کاوشگرهای DNA مورد استفاده در Rx. FISH با ترکیبی از 3 فلوئوروکروم برچسب گذاری شده است که منجر به 7 شبه رنگ می شود. آنها به طور خاص مناطق جداگانه کروموزوم ها را رنگ می کنند و خطوط رنگی آنها را ایجاد می کنند. این یکی از ویژگی های پروب های DNA برای Rx است. FISH بر اساس روش به دست آوردن آنها تعیین می شود. آنها کتابخانه های DNA کروموزوم خاص دو گونه گیبون هستند: Hylobates concolor و Hylobates syndactylus.

در نتیجه بازآرایی‌های کروموزومی شدیدی که در طول شکل‌گیری گونه‌های مدرن گیبون‌ها اتفاق افتاد، معلوم شد که مواد کروموزوم‌های آنها در مقایسه با سازماندهی کروموزوم‌ها در انسان‌ها که کروموزوم‌های آن به محافظه کاری معروف هستند، به شدت در هم ریخته است. نسبت کروموزوم 1 انسان به کروموزوم های گیبون در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل 2 نمای کلی کروموزوم های انسانی به دست آمده در نتیجه Rx را نشان می دهد. ماهی. الف) صفحه متافاز ب) چیدمان کروموزوم ها.

با این حال، RXFISH محدودیت‌های نسبتاً جدی دارد - بازآرایی‌های کروموزومی که در یک باند RX رنگی رخ داده‌اند، در صورتی که منجر به تغییرات قابل توجه و به راحتی قابل مشاهده در اندازه این باند نشوند، با استفاده از این روش قابل تشخیص نیستند. - پروب ها چندین ناحیه کروموزومی کروموزوم های مختلف را در یک شبه رنگ رنگ می کنند. با این حال، با افزایش تعداد فلوئوروکروم های مورد استفاده، روش RXFISH بدون شک آموزنده تر از FISH معمولی 24 رنگ خواهد بود.

مزایای RXFISH در حال حاضر شامل نکات زیر است: این روش امکان تجزیه و تحلیل کل ژنوم انسان را در یک آزمایش FISH چند رنگی فراهم می کند. کیت های تجاری موجود از پروب های DNA نشاندار و سیستم های تشخیص مورد نیاز در دسترس هستند. این روش امکان شناسایی سریع بخش قابل توجهی از بازآرایی های درون و بین کروموزومی را فراهم می کند. شناسایی خودکار کروموزوم های متافاز "باند رنگ" امکان پذیر است. یک بارکد رنگی منحصر به فرد برای هر کروموزوم انسانی وجود دارد. RXFISH در ایستگاه کاری Cyto یکپارچه شده است. بینایی و سیستم های میکروسکوپ فلورسانس استاندارد

کاریوتایپینگ طیفی (SKY-spectralkaryotyping) اصول اولیه تجزیه و تحلیل تصاویر میکروسکوپی در کاریوتایپ طیفی عملاً با موارد مورد استفاده در M-FISH تفاوتی ندارد. تفاوت ها مربوط به نحوه ثبت تصویر است. فناوری SKY به یک اندازه گیری اجازه می دهد تا منحنی های طیفی را برای همه نقاط تصویر به دست آورد، صرف نظر از اینکه مربوط به اپی فلورسانس است یا میکروسکوپ نوری سنتی. برای کاریوتایپینگ طیفی همه کروموزوم‌های انسان، از پنج فلوئوروکروم استفاده می‌شود، یکی در طیف سبز، دو تا در قرمز و دو در مادون قرمز. تحریک و انتشار تمام فلوروکروم‌های مورد استفاده برای برچسب‌گذاری پروب‌های DNA با یک مجموعه از فیلترها انجام می‌شود که از تغییر متوالی آنها، تمرکز میانی و در نتیجه مشکلات مرتبط مانند تغییر تصویر فضایی، تعیین مقادیر آستانه و ماسک‌های تقسیم‌بندی جلوگیری می‌کند. ... بر اساس تجزیه و تحلیل منحنی های طیفی، وجود یا عدم وجود فلوروکروم های خاص در یک نقطه مشخص تعیین می شود.

مرحله بعدی روش طبقه بندی است که به شما امکان می دهد به طور مستقیم و بدون ابهام هویت کروموزومی مواد مورد تجزیه و تحلیل را تعیین کنید. این امر شناسایی قابل اعتماد (تا دقت کروموزوم) مواد کروموزوم های نشانگر و همچنین مشتقات کروموزوم ناشی از بازآرایی های مختلف را تضمین می کند. مزیت بزرگ SKY این است که رنگ DAPI به موازات تصویر طیفی ثبت می شود. بهبود نرم افزار باند نویسی DAPI امکان دستیابی به striation دیفرانسیل در کیفیت نزدیک به باند GTG را فراهم می کند. امکان تجزیه و تحلیل موازی تصویر طیفی و رنگ‌آمیزی کروموزوم دیفرانسیل کیفی، تفسیر نتایج SKY را بسیار ساده می‌کند و امکان تعیین دقیق‌تر نقاط شکست کروموزومی را ممکن می‌سازد. از مزایای بدون شک SKY می توان به امکان استفاده از فلوئوروکروم هایی با طیف های تحریک و انتشار همپوشانی اشاره کرد که به طور قابل توجهی لیست فلوئوروکروم های مناسب را گسترش می دهد و همچنین تعداد فلوئوروکروم های قابل استفاده همزمان را افزایش می دهد. فهرست بندی یک فلوروکروم جدید نیازی به خرید مجموعه فیلتر جدید ندارد، زیرا یک بلوک فیلتر برای FISH طیفی و یک بلوک فیلتر برای DAPI برای SKY کافی است.

معایب SKY عبارتند از: - زمان نوردهی طولانی، لازم برای ضبط تصاویر میکروسکوپی. - SKY در مواقعی که انجام مطالعات با پروب های نسبتاً کوچک DNA ضروری است تا حدودی کمتر از M-FISH مؤثر است.

کاریوتایپ تغییر رنگ این روش مبتنی بر تجزیه و تحلیل تفاوت طول سیگنال بین نمونه‌های DNA هیبرید شده با پروب‌های DNA متصل به فلوروکروم‌ها و با پروب‌های DNA حامل آنتی‌بادی است. این روش تنها با 3 فیلتر قابل اجرا است و نیازی به دوربین و نرم افزار خاصی ندارد. برای شناسایی کروموزوم ها یک هیبریداسیون انجام می شود و دو تصویر به دست می آید. این روش بر اساس تفاوت در طول سیگنال فلورسنت است، زیرا زمان قرار گرفتن در معرض نمونه‌های DNA متصل به آنتی‌بادی‌ها 80 تا 90 درصد کوتاه‌تر از نمونه‌های متصل به فلوروکروم است. پس از واکنش هیبریداسیون، اسمیرها در معرض آنتی بادی های اولیه مربوطه قرار می گیرند و سپس با مشاهده اولین تصویر، مشاهده می شوند. سپس آماده سازی در معرض آنتی بادی های ثانویه و آویدین متصل به فلوروکروم های مشابه قرار می گیرد. سکته ها را می توان با استفاده از DAPI ضد رنگ کرد.

در آینده، با استفاده از 3 فیلتر به نوبه خود، دوباره تصاویری از آماده سازی به دست می آید. این تصاویر با استفاده از نرم افزار مخصوص مقایسه می شوند و تصویر دومی به دست می آید که در آن فقط کروموزوم های مرتبط با آنتی بادی های خاص قابل مشاهده خواهند بود. بنابراین، برخی از کروموزوم ها فقط در تصویر اول یا دوم فلورسانس می شوند، در حالی که برخی دیگر در تصاویر مختلف رنگ خود را تغییر می دهند.

هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی (CGH) این روش برای تشخیص ناهنجاری های کمی در ژنوم توسعه یافته است. این بر اساس یک واکنش هیبریداسیون درجا با استفاده از کل ژنوم به عنوان یک پروب DNA است. DNA دهنده جدا شده و طبیعی با فلوئوروکروم های رنگ های مختلف برچسب گذاری می شود، بنابراین آنها را به پروب DNA تبدیل می کند. مقادیر معادل این پروب ها مخلوط شده و در هیبریداسیون با یک آماده سازی سیتوژنتیک کنترل استفاده می شود. پس از FISH، متافازها بر روی یک میکروسکوپ فلورسانس تجزیه و تحلیل می‌شوند و شدت فلورسانس دو فلوئوروکروم در تمام طول هر کروموزوم با استفاده از یک برنامه تخصصی تجزیه و تحلیل تصویر کامپیوتری تعیین می‌شود.

در غیاب تغییرات کمی در کاریوتیپ نمونه آزمایشی، نسبت خاصی از شدت لومینسانس دو فلوئوروکروم مشاهده خواهد شد. در صورت تکثیر ژن، شدت سیگنال فلوئوروکروم مربوطه افزایش می یابد و در صورت از بین رفتن بخشی از ماده ژنتیکی، برعکس، ضعیف می شود. بنابراین، CGH امکان تشخیص عدم تعادل ژنومی را فراهم می کند، اما از این روش نمی توان برای تشخیص جابه جایی ها و وارونگی های متعادل استفاده کرد و تریزومی ها و حذف ها را تنها در صورتی می توان تعیین کرد که اندازه ناحیه نامتعادل حداقل 10 میلیون جفت باز باشد.

عدم تعادل کروموزومی در یک نمونه آزمایشی با تفاوت در شدت فلورسانس دو فلوئوروکروم مختلف با محاسبه نسبت فلورسانس (FR) ارزیابی می شود.

روش CGH نسبت به روش‌های دیگر برای تجزیه و تحلیل تغییرات ژنوم مزایای زیادی دارد: اولاً، این روش به منبع ماده مورد مطالعه بستگی ندارد و می‌تواند با مقدار کمی DNA آزمایش شده، از جمله مواد آرشیوی، با موفقیت انجام شود. ثانیاً، به شما امکان می دهد در یک آزمایش اطلاعات دقیقی در مورد از دست دادن یا افزایش تعداد کپی های مواد ژنتیکی در سراسر ژنوم به دست آورید. ثالثاً، روش CGH نیازی به آماده سازی کروموزوم های متافاز از بافت مورد مطالعه ندارد، یعنی به روند کشت سلول و مصنوعات مربوطه بستگی ندارد.

هیبریداسیون درجا ژنومی در (GISH) گونه‌ای از روش هیبریداسیون درجا است که شامل این واقعیت است که برای هیبریداسیون با نمونه‌های ثابت، کل DNA ژنومی یک گونه از ارگانیسم به عنوان یک کاوشگر نشاندار فلورسنت استفاده می‌شود که با آن کل ژنومی DNA گونه دیگری از ارگانیسم رقابت می کند. برای تعیین تفاوت های بین گونه ای و درون گونه ای در ژنوم ها، بازآرایی های کروموزومی، حذف ها و جانشینی ها استفاده می شود.

تغییرات FISH 1) Q-FISH - ماهی کمی: توسعه یافته توسط Lansdorp و همکاران: U. M. Martens، J. M. Zijlmans، S. S. Poon، W. Dragowska، J. Yui، E. A. Chavez، R. K. Ward، و P. M. Lansdorp. 1998. تلومرهای کوتاه در کروموزوم انسانی 17 ص. نات. ژنت 18: 76 -80. روش کمی. برای کاربردهای فلوسیتومتری طراحی شده است. در اصل برای اندازه گیری طول کروموزوم ها (رزولوشن: 200 جفت باز) با شمارش تعداد تکرارهای تلومری استفاده می شد. پروب های کونژوگه با PNA استفاده می شود. در ابتدا کروموزوم های متافاز (خود QFISH) را مطالعه کردیم، اکنون این روش برای کروموزوم های بین فازی (IQ-FISH) قابل استفاده است. Q-FISH بر روی کشت سلولی، بخش های بافتی (هر دو روی اسلاید) انجام می شود. در حال حاضر Q-FISH ابزار مهمی در مطالعه نقش تلومرها در پیری و سرطان است.

PNA-FISH - اسیدهای نوکلئیک پپتیدی FISH: اسیدهای نوکلئیک پپتیدی (PNAs) آنالوگ های مصنوعی DNA هستند که در آنها ستون فقرات قند دئوکسی ریبوز فسفات که پایه نیتروژنی را پشتیبانی می کند با یک ستون فقرات پپتیدی شارژ نشده جایگزین می شود. در نتیجه این ساختار: هنگامی که پروب الیگومری PNA با DNA / RNA مکمل هیبرید می شود، دافعه الکترواستاتیکی رخ نمی دهد. دوبلکس های PNA-DNA (PNA-RNA) بسیار پایدارتر از هومو/هترودوپلکس های طبیعی هستند. ویژگی بالای اتصال PNA-DNA: هیبریداسیون PNA-DNA برای عدم تطابق جفت باز بسیار حساس تر از هیبریداسیون DNA-DNA است. بنابراین، با استفاده از یک پروب PNA، می توان بین دو تکرار سانترومر که تنها در یک جفت باز متفاوت هستند، تمایز قائل شد. PNA نسبتا آبگریز است (در مقایسه با DNA)، به این معنی که PNA بهتر از طریق دیواره های سلولی پخش می شود => استفاده گسترده در میکروبیولوژی. بر اساس ویژگی بالای اتصال: اعتقاد بر این است که فناوری PNA به زودی مبنایی برای ایجاد پروب‌های اختصاصی آلل برای هیبریداسیون درجا خواهد شد. در ژنتیک، سیتوژنتیک، اپی ژنتیک، میکروبیولوژی و غیره استفاده می شود.

3) Flow-FISH - FISH برای فلوسیتومتری: در سال 1998 پیشنهاد شد: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM دینامیک طول تلومر در زیرجمعیت های لنفوسیت انسانی اندازه گیری شده توسط فلوسیتومتری. بیوتکنول طبیعت 16, 743-747 (1998). ترکیبی از Q-FISH و فلوسیتومتری برای تجزیه و تحلیل (اندازه گیری) سیگنال و مرتب سازی. برای flow-FISH، یک سوسپانسیون سلولی (برای اندازه گیری طول تلومرهای کروموزوم)، گسترش کروموزومی و کروموزوم های جدا شده (برای نقشه برداری بیشتر) استفاده می شود. همانند Q-FISH، از پروب های تلومری نشاندار شده با PNA استفاده می شود (به عنوان مثال، برای تجسم و اندازه گیری طول تکرار تلومری). این به طور گسترده ای برای مطالعه مشکلات مختلف استفاده می شود: پیری، حفظ تلومرها، مطالعه تعلیق سلول های بنیادی خونساز ex vivo، مطالعه باکتری ها.

تجزیه و تحلیل چند پارامتری امکان تمایز انواع سلول را در یک نمونه فراهم می کند و امکان کنترل داخلی و تجزیه و تحلیل زیرگروه های لکوسیت را فراهم می کند.

مزایای flow-FISH: نتایج به راحتی قابل تکرار توانایی تجزیه و تحلیل زیر گروه های سلولی در یک جمعیت با استفاده از ایمونوفلورسانس فیزیکی و نشانگرها عملکرد بهتر نسبت به Q-FISH توانایی تعیین کمیت فلورسانس هزاران سلول.

مطالعه کروموزوم های جدا شده با استفاده از روش های فلوسیتومتری 1. مرتب سازی کروموزوم ها با استفاده از فلوسیتومتری - کاریوتایپینگ با استفاده از فلوسیتومتری برای نقشه برداری بیشتر ژن ها و ساخت کتابخانه های کروموزوم استفاده می شود. - شناسایی و محلی سازی ژن ها بر روی کروموزوم های مرتب شده با استفاده بعدی از روش های FISH / PRINS (پرایم شده در محل برچسب گذاری) یا تغییرات آن و PCR اختصاصی کروموزوم انجام می شود. - تا سال 2011، تنها کروموزوم های 17 گونه از گیاهان کشت شده تاکنون با موفقیت مرتب شده اند. - مرتب سازی کروموزوم های متافاز یا پاکیتن با شاخص تقسیم بالا.

برچسب فلورسنت: - کروموزوم ها با فلوئوروکروم های مخصوص اسیدهای نوکلئیک نشاندار می شوند. - فلوئوروکروم ها مطابق با 1) ویژگی برای بازهای نیتروژنی، 2) شرایط آزمایشی (از جمله در نظر گرفتن طول موج لیزرهای موجود) انتخاب می شوند. 1. برای تجزیه و تحلیل تک متغیری، از رنگ هایی استفاده کنید که مختص بخارات AT یا GC نیستند: یدید پروپیدیوم (پیک تحریک: 535 نانومتر، انتشار: 617 نانومتر، لیزر مورد نیاز: لیزر یا لامپ 488 نانومتر آرگون + فیلتر طولانی گذر) اتیدیوم بروماید ( پیک های تحریک: 300 و 520 نانومتر، گسیل: 600 نانومتر، لیزر مورد نیاز: لیزر یا لامپ آرگون 488 نانومتر + فیلتر گذر طولانی) این برچسب ها DNA را بدون توجه به محتوای بازهای A، G، T یا نیتروژن رنگ می کنند. 2. برای تجزیه و تحلیل دو متغیره استفاده کنید: کرومومایسین (ویژه برای جفت بازهای G-C)، پیک تحریک A3: 458 نانومتر، انتشار 580 نانومتر. لیزر:، 458 نانومتر حداقل توان 400 m.V. Hoechst 33258 (ویژه برای جفت پایه A-T)، تحریک: 351 -364 نانومتر، انتشار: 470 نانومتر. لیزر: 351 -364 نانومتر (قدرتمند). لیزرها باید در زمان و مکان به دلیل همپوشانی جزئی طیف های فلوئوروکروم از هم جدا شوند.

2. مطالعه کروموزوم ها / توالی های نوکلئوتیدی پس از مرتب سازی (برای ساختن نقشه های فیزیکی و ژنتیکی و ...) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS مطالعه ژنوم های بزرگ با کروموزوم های بلند. نقشه برداری از توالی با تعداد زیادی تکرار (مثلاً مناطق تلومری و سانترومر). استفاده از پروب های کوتاه به دلیل تعداد زیاد تکرار، سیگنال قوی است. اندازه پروب استاندارد: 15 تا 30 نوکلئوتید. ماهی

مشکلات FISH: محلی‌سازی توالی‌های DNA تک جایگاهی (یعنی توالی‌های DNA منحصربه‌فرد غیر تکراری) دشوار است زیرا هنگام استفاده از پروب‌های کوتاه استاندارد سیگنال بسیار ضعیف خواهد بود. افزایش طول پروب به چند کیلو باز برای تقویت سیگنال منجر به کاهش حساسیت و => اتصال غیر اختصاصی می شود. راه حل: BAC-FISH -BAC-FISH - ترکیبی از روش FISH و استفاده از کلون های DNA ژنومی جاسازی شده در کروموزوم های مصنوعی باکتریایی (BAC) که امکان درج توالی های DNA بزرگ را فراهم می کند. -روشی موثر برای شناسایی و نقشه برداری کروموزوم های منفرد موجودات دارای ژنوم کوچک. پروب های BAC، overgos (الیگونوکلئوتیدهای همپوشانی) به عنوان یک پروب استفاده می شوند.

جایگزین برای FISH: PRINS PRINS (برچسب‌گذاری درجا) روشی برای نشان‌گذاری کروموزوم‌ها با بازپخت یک آغازگر DNA الیگونوکلئوتیدی با یک توالی همولوگ از DNA کروموزومی دناتوره‌شده و متعاقب آن گسترش آنزیمی پرایمر در محل با نوکلئوت‌های نشان‌دار شده است. اولین بار توسط Koch و همکاران توصیف شد. در سال 1989 (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) روشهای اولیه الیگونوکلئوتیدی برای برچسب زدن کروموزوم خاص DNA ماهواره آلفا در محل. Chromosoma 98, 259 -265). PRINS جایگزینی برای FISH است. برای محلی سازی توالی های نوکلئوتیدی، شناسایی و شمارش کروموزوم های متافاز یا اینترفاز یا جفت های کروموزومی (از جمله آنوپلوئیدی کروموزومی) استفاده می شود. بازپخت پرایمر بدون نشاندار (پرایمر - پرایمر) با DNA تحت مطالعه افزایش طول پرایمر با استفاده از DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت و نوکلئوتیدهای نشاندار متوقف کننده واکنش (اتصال یک مولکول مسدود کننده به انتهای 3) پرایمر: قطعه محدود کننده PCR محصول الیگونوکلئوتید برچسب زدن نوکلئوتیدها: مستقیم - غیر مستقیم (بیوتین / آویدین کنژوگه با فلوئوروکروم / ضد حفاری) - فقط یک جفت کروموزوم همولوگ (یک کروموزوم) در نتایج هر واکنش PRINS قابل شناسایی است. واکنش PRINS بعدی روی همان شیشه فقط پس از مسدود کردن شیشه قبلی قابل انجام است. - مناسب برای توالی های DNA با تعداد تکرار زیاد.

مزایای PRINS: 1. حداقل اطلاعات توالی مورد نیاز برای سنتز پرایمر الیگونوکلئوتیدی مورد نیاز است. 2. سریع ترین و ساده ترین روش برای تشخیص توالی مورد نظر روی کروموزوم (در مقایسه با استفاده از پروب های سنگین برای FISH، هیبریداسیون برای مدت زمان بسیار طولانی). 3. حذف مرحله برچسب گذاری پروب. 4. قابلیت طویل کردن پرایمر با نوکلئوتیدهای نشاندار برای افزایش سیگنال c-PRINS هنگام تشخیص توالی های منحصر به فرد کوتاه. برای تشخیص تکرارهای کم کپی یا توالی های منحصر به فرد کوتاه، از روش حساس تری استفاده می شود - PRINS دوچرخه سواری (c -PRINS). C-PRINS پیشنهاد شده توسط Gosden و همکاران. در سال 1991، یک پروتکل بهبود یافته به طور گسترده توسط Kubaláková و همکاران مورد استفاده قرار گرفت. ، 2001 (Kubaláková M، Vrána J، Cíhalíková J، Lysák MA، Dole J (2001). محلی سازی توالی های DNA روی کروموزوم های گیاهی با استفاده از PRINS و C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS شامل یک سری چرخه حرارتی مشابه PCR است.

مایع غلاف برای FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. فلوسیتومتری و FISH برای اندازه گیری طول متوسط ​​تلومرها (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 - 2376) -40 متر M KCl + 10 متر. M Na. کلر (Vrána J، Kubaláková M، Simková H، Cíhalíková J، Lysák MA، Dolezel J. مرتب‌سازی جریان کروموزوم‌های میتوزی در گندم معمولی (Triticum aestivum L.). ژنتیک. 2000؛ 156 (4): -2033-41) ... بنابراین 4 بافر بدون دی تیوتریتول (Lj. Li، L. Ma، K. Arumuganathan، YC Song. کروموزوم های مرتب شده با جریان: یک ماده خوب برای نقشه برداری فیزیکی ژن گیاهی. Caryologia. 2006، جلد 59، شماره 2: 99-103 سدیم 0.1% (وزنی در حجم) اتوکلاو شده. Cl -50 متر. M Na. Cl (M Kubaláková، P Kovářová، P Suchánková، J Číhalíková، J Bartoš، S Lucretti، N Watanabe، SF Kianian، J Doležel. مرتب سازی کروموزوم در گندم تتراپلوئید و پتانسیل آن برای تجزیه و تحلیل ژنوم. ژنتیک. -829) -بافر پلی آمین تثبیت کننده کروموزوم (مایع غلاف حاوی پروتئین) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

هیبریداسیون درجا فلورسانس

هیبریداسیون فلورسنت در موقعیت ، یا روش FISH (eng. فلورسانس در موقعیت هیبریداسیون - FISH ) یک روش سیتوژنتیکی است که برای شناسایی و تعیین موقعیت یک توالی DNA خاص بر روی کروموزوم های متافاز یا در هسته های بین فازی استفاده می شود. در موقعیت... علاوه بر این، FISH برای شناسایی mRNA های خاص در یک نمونه بافت استفاده می شود. در مورد دوم، روش FISH امکان ایجاد ویژگی‌های مکانی-زمانی بیان ژن در سلول‌ها و بافت‌ها را فراهم می‌کند.

پروب ها

با هیبریداسیون فلورسنت در موقعیتاز پروب های DNA (پروب های DNA) که به اهداف مکمل در نمونه متصل می شوند، استفاده کنید. پروب های DNA حاوی نوکلئوزیدهایی هستند که با فلوروفورها (برچسب گذاری مستقیم) یا مزدوجاتی مانند بیوتین یا دیگوکسیژنین (برچسب گذاری غیرمستقیم) برچسب گذاری شده اند. با برچسب زدن مستقیم، پروب DNA متصل به هدف را می توان با میکروسکوپ فلورسانس بلافاصله پس از تکمیل هیبریداسیون مشاهده کرد. در مورد برچسب زدن غیرمستقیم، یک روش رنگ آمیزی اضافی مورد نیاز است، که طی آن بیوتین با استفاده از آویدین یا استپتاویدین نشاندار فلورسنت و دیگوکسیژنین با استفاده از آنتی بادی های نشاندار فلورسنت تشخیص داده می شود. اگرچه نسخه غیرمستقیم کاوشگرهای DNA نشان‌دار نیاز به معرف‌های اضافی و صرف زمان دارد، این روش معمولاً به دلیل وجود 3-4 مولکول فلوئوروکروم روی آنتی‌بادی یا مولکول آویدین اجازه می‌دهد تا سطح سیگنال بالاتری به دست آید. علاوه بر این، در مورد برچسب زدن غیر مستقیم، تقویت آبشاری سیگنال امکان پذیر است.

برای ایجاد کاوشگرهای DNA، توالی های DNA کلون شده، DNA ژنومی، محصولات واکنش PCR، الیگونوکلئوتیدهای نشاندار شده و DNA به دست آمده توسط ریز شکاف استفاده می شود.

برچسب‌گذاری پروب می‌تواند به روش‌های مختلفی انجام شود، برای مثال، با ترجمه نیک یا PCR با نوکلئوتیدهای نشاندار.

روش هیبریداسیون

طرح آزمایش هیبریداسیون فلورسنت در موقعیتبرای تعیین موقعیت ژن در هسته

در مرحله اول، طراحی پروب ها انجام می شود. اندازه پروب باید به اندازه کافی بزرگ باشد که هیبریداسیون در یک مکان خاص اتفاق بیفتد، اما نه خیلی بزرگ (بیش از 1000 جفت باز) تا در فرآیند هیبریداسیون تداخلی ایجاد نکند. هنگامی که جایگاه‌های خاصی شناسایی می‌شوند یا زمانی که کروموزوم‌های کامل رنگ‌آمیزی می‌شوند، لازم است هیبریداسیون پروب‌های DNA با توالی‌های DNA تکراری غیر منحصر به فرد با افزودن تکرارهای DNA نشان‌دار نشده (مثلا DNA Cot-1) به مخلوط هیبریداسیون مسدود شود. اگر پروب DNA دو رشته ای باشد، باید قبل از هیبریداسیون دناتوره شود.

در مرحله بعد، آماده سازی هسته های اینترفاز یا کروموزوم های متافاز تهیه می شود. سلول ها روی یک بستر، معمولاً روی یک لام شیشه ای ثابت می شوند و سپس DNA دناتوره می شود. برای حفظ مورفولوژی کروموزوم ها یا هسته ها، دناتوره سازی در حضور فرمامید انجام می شود که اجازه می دهد تا دمای دناتوراسیون به 70 درجه کاهش یابد.

پروب‌های DNA متصل با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می‌شوند. شدت سیگنال فلورسنت به عوامل زیادی بستگی دارد - کارایی برچسب زدن با پروب، نوع پروب و نوع رنگ فلورسنت.

ادبیات

• روبتسوف N.B. روش های کار با کروموزوم های پستانداران: کتاب درسی. دفترچه راهنما / Novosib. دولت un-t. نووسیبیرسک، 2006.152 ص.

• روبتسوف N.B. هیبریداسیون اسید نوکلئیک در موقعیتدر تجزیه و تحلیل ناهنجاری های کروموزومی. فصل در کتاب "مقدمه ای بر تشخیص مولکولی" T. 2. "روش های ژنتیکی مولکولی در تشخیص بیماری های ارثی و انکولوژیک" / ویرایش. M.A. پالتسوا، دی.و. زالتایوا ادبیات آموزشی برای دانشجویان دانشگاه های علوم پزشکی. M.: پزشکی، 2011. T. 2. S. 100-136.

یادداشت ها (ویرایش)

بنیاد ویکی مدیا 2010.

ببینید «هیبریداسیون درجا فلورسانس» در فرهنگ‌های دیگر چیست:

این اصطلاح معانی دیگری دارد، به هیبریداسیون مراجعه کنید. هیبریداسیون DNA، هیبریداسیون اسید نوکلئیک در شرایط آزمایشگاهی ترکیبی از اسیدهای نوکلئیک تک رشته ای مکمل به یک مولکول. با مکمل بودن کامل ... ... ویکی پدیا

روش تعیین هیبریداسیون درجا فلورسنت

مطالب مطالعه توضیحات را ببینید

بازدید از خانه در دسترس است

این مطالعه برای انتخاب شیمی درمانی کمکی فردی برای سرطان سینه یا سرطان معده استفاده می شود.

سرطان پستان (BC) در بین بیماری های سرطانی در زنان رتبه اول را دارد. سلول های تومور پستان می توانند حاوی انواع مختلفی از گیرنده ها باشند که به مواد خاصی (هورمون ها یا سایر مولکول های فعال بیولوژیکی) حساس هستند. بسته به وجود گیرنده های هورمونی (استروژن و پروژسترون) یا گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی نوع 2 (گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی 2، HER2) در سلول های تومور، سرطان پستان گیرنده هورمونی مثبت، HER2 مثبت و سه گانه منفی جدا می شود. در نظر گرفتن این موضوع در انتخاب فردی درمان و پیش بینی موفقیت درمان مهم است.

HER2 گیرنده ای است که در بافت ها وجود دارد و به طور معمول در تنظیم تقسیم و تمایز سلولی شرکت می کند. بیش از حد آن در سطح سلول های تومور (بیان بیش از حد) رشد سریع و کنترل نشده نئوپلاسم، خطر بالای متاستاز و کارایی پایین برخی از انواع درمان را از پیش تعیین می کند. بیان بیش از حد HER2 در برخی از زیرگروه های سرطان سینه منجر به افزایش تکثیر و رگ زایی و همچنین به اختلال در تنظیم آپوپتوز (خود تخریبی سلولی برنامه ریزی شده ژنتیکی) می شود. در حال حاضر، داروهایی وجود دارند که گیرنده HER2 را هدف قرار می دهند. اینها به ویژه هرسپتین (تراستوزوماب) هستند که یک آنتی بادی مونوکلونال علیه گیرنده های HER2/neu است.

تقویت و بیان بیش از حد انکوژن HER2 (ErbB-2) رویدادهای نسبتاً اختصاصی برای کارسینوم پستان است و عملاً در تومورهای سایر نقاط رخ نمی دهد. سرطان معده (GC) یکی از معدود استثناها است: فعال شدن HER2 در حدود 10-15٪ موارد نئوپلاسم های بدخیم این اندام مشاهده می شود و با سیر تهاجمی بیماری مرتبط است. در سرطان پستان HER2 مثبت، ممکن است گیرنده های HER2 بیش از حد روی سطح سلول های تومور وجود داشته باشد (که به آن ها HER2 مثبت یا Hercept مثبت گفته می شود). این پدیده در 15 تا 20 درصد زنان مبتلا به سرطان سینه مشاهده می شود. ارزیابی وضعیت HER2 برای تعیین تاکتیک های درمانی مهم است.

روش های استاندارد اصلی برای تشخیص بیان بیش از حد HER2 / neu و / یا تقویت ژن HER2 / neu، روش ایمونوهیستوشیمی (IHC) و هیبریداسیون فلورسانس در محل (FISH) است. هر دو مطالعه بر روی آماده‌سازی‌های بافت‌شناسی (بخش‌هایی از مواد تومور تعبیه‌شده در پارافین) با استفاده از آنتی‌بادی‌های پلی کلونال (IHC)، پروب‌های فلورسنت (FISH) و سیستم‌های تصویربرداری مختلف انجام می‌شوند.

هنگام ارزیابی نتایج واکنش IHC، بیان تنها در جزء مهاجم تومور در نظر گرفته می شود. ارزیابی نتایج واکنش با استفاده از مقیاس نقطه‌ای انجام می‌شود: 0، 1+، 2+، 3+، که توسط سازنده آزمایش توسعه یافته و تأییدیه متخصص را دریافت کرده است. وضعیت هرسپت که به عنوان 0 و 1+ ارزیابی می شود، باید منفی در نظر گرفته شود - هیچ بیان بیش از حد پروتئین وجود ندارد، که با عدم تقویت ژن آن ارتباط دارد. وضعیت هرسپت، که به عنوان 3+ ارزیابی می شود، مثبت است، یعنی بیان بیش از حد پروتئین وجود دارد، که با حضور تکثیر ژن مطابقت دارد. وضعیت هرسپت 2+ نامشخص در نظر گرفته می شود، به عنوان مثال، از بیان پروتئین تعیین شده بر اساس یک واکنش ایمونوهیستوشیمی، نمی توان با اطمینان در مورد تقویت ژن قضاوت کرد، بنابراین، مطالعه ای مورد نیاز است که مستقیماً وجود آن را نشان دهد. یا عدم تقویت روش FISH بر روی برش هایی از همان نمونه (بلوک) که مطالعه ایمونوهیستوشیمی روی آن انجام شده است، استفاده می شود. در هیبریداسیون FISH، ارزیابی وجود تقویت ژن HER2 با محاسبه نسبت فلورسنت قرمز (مربوط به ژن‌های HER2 نشان‌دار) و سیگنال‌های فلورسنت سبز، که ناحیه سانترومر کروموزوم 17 را مشخص می‌کنند، انجام می‌شود. نسبت بیشتر از 2 نشان دهنده وجود تقویت HER2 است. FISH از IHC حساس تر است، زیرا امکان ارزیابی مستقیم وجود یا عدم وجود تقویت را فراهم می کند.

مواد برای تحقیق: بلوک پارافین با بیوپسی تومور.

توجه! لزوما:

• اسلاید شیشه ای رنگی HER2 / neu IHC
• ارجاع از پزشک یا ترخیص با نتایج مطالعات بافت شناسی و IHC با آنتی بادی به Her-2 / neu

ادبیات

• Zavalishina L.E., Frank G.A. بررسی مورفولوژیکی وضعیت HER2. روش شناسی و اطلس. - م.: اد. "مدیا مدیکا". 2006: 98.
• بیماری های بدخیم در روسیه در سال 2011 (میزان بیماری و مرگ و میر). اد. در و. چیسووا، وی. استارینسکی، جی.وی. پتروا. - M .: FGBU "MNIOI im. P.A. هرزن »از وزارت بهداشت روسیه. 2013: 289.
• انکولوژی. دستورالعمل های بالینی انجمن انکولوژیست های روسیه. اد. در و. چیسووا، اس.ال. داریالووا. - م.: اد. GEOTAR-Media. 2008: 702.
• Bang Y. J.، Van Cutsem E.، Feyereislova A.، Chung H. C.، Shen L.، Sawaki A. و همکاران. تراستوزوماب در ترکیب با شیمی درمانی در مقابل شیمی درمانی به تنهایی برای درمان سرطان پیشرفته معده یا اتصال معده به مری (ToGA) مثبت HER2: یک کارآزمایی کنترل شده تصادفی با برچسب باز، فاز 3. لانست. 2010؛ 376: 687-697.
• دابز دی.جی. ایمونوهیستوشیمی تشخیصی: کاربردهای ترانوستیک و ژنومیک. الزویر، ویرایش چهارم. 2013: 960.
• Ferlay J.، Shin H.R.، Bray F.، Forman D.، Mathers C.، Parkin D.M. GLOBOCAN 2008، بروز سرطان و مرگ و میر در سراسر جهان: پایگاه سرطان IARC شماره 10. لیون، فرانسه: آژانس بین المللی تحقیقات سرطان. 2010. موجود در: http://globocan.iarc.fr.
• Goldhirsch A.، Glick J.H.، Gelber R.D.، Coates A.S.، Thurlimann B.، Senn H.J. نکات مهم جلسه: اجماع کارشناسان بین المللی در مورد درمان اولیه سرطان پستان اولیه 2005. Annals of Oncology. 2005؛ 16 (10): 1569-1583.
• Kurman R.J.، Carcangiu M.L.، Herrington C.S.، Young R.H. طبقه بندی تومورهای اندام های تناسلی زنان توسط سازمان جهانی بهداشت. انتشارات WHO، ویرایش چهارم. 2014؛ 4: 316.
• NordiQC. http://www.nordiqc.org.
• پارک دی آی، یون جی دبلیو، پارک جی.اچ. و همکاران تقویت Her2 / neu یک عامل پیش آگهی مستقل در سرطان معده است. بیماری های گوارشی و علوم. 1385؛ 51 (8): 1371-1379.
• اسلمون دی و همکاران تراستوزوماب کمکی در سرطان پستان HER2 مثبت. مجله پزشکی نیوانگلند. 2011؛ ​​365: 1273-1283.