Fluorescentna in situ hibridizacija. Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)

U nekim slučajevima citogenetska studija nije dovoljna da se donese zaključak o kariotipu, u tim se slučajevima koriste molekularne citogenetičke metode, posebno fluorescentna in situ hibridizacija (engleski - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

Pojava novih tehnologija u molekularnoj citogenetici, baziranih uglavnom na in situ hibridizaciji nukleinskih kiselina, značajno je proširila mogućnosti hromozomske dijagnostike. Metoda hibridizacije in situ je razvijena da lokalizuje specifične sekvence DNK direktno na citološkim preparatima. Došlo je do prijelaza u identifikaciji hromozoma i hromozomskih regiona sa analize citološke organizacije hromozoma na analizu DNK sekvenci koje ih čine. Poređenje efikasnosti klasičnih citoloških metoda za otkrivanje i analizu kromosomskih preuređivanja, kao što je diferencijalno bojenje hromozoma, sa modernim molekularno-citogenetskim tehnologijama pokazalo je da kod hematoloških poremećaja citološkom analizom hromozoma detektuje i ispravno identifikuje samo oko trećine reakcionih hromozoma. korištenjem spektralne kariotipizacije (SKY). Otprilike trećina preuređenja je pogrešno identificirana citološkim metodama, a trećina ostaje potpuno neprimijećena. Klasične metode citogenetske analize omogućavaju da se otkrije samo oko 15% kromosomskih preuređivanja identificiranih pomoću SKY-a.

FISH metoda koristi fluorescentne molekule za bojenje gena ili hromozoma in vivo. Metoda se koristi za mapiranje gena i identifikaciju hromozomskih aberacija.

Tehnika počinje pripremom kratkih sekvenci DNK, zvanih sonde, koje su komplementarne sekvencama DNK koje predstavljaju predmet proučavanja. Sonde se hibridiziraju (vezuju) za komplementarne DNK regije i, zbog činjenice da su označene fluorescentnom oznakom, omogućavaju vam da vidite lokalizaciju gena od interesa u DNK ili hromozomima. Za razliku od drugih metoda proučavanja hromozoma koje zahtijevaju aktivnu diobu stanica, FISH se može izvesti na stanicama koje se ne dijele, što metodu čini fleksibilnom.

FISH se može primijeniti u različite svrhe pomoću tri različite vrste sondi:

* sonde specifične za lokus koje se vezuju za određene dijelove hromozoma. Ove sonde se koriste za identifikaciju dostupne kratke sekvence izolovane DNK, koja se koristi za pripremu obeležene sonde i njene naknadne hibridizacije sa skupom hromozoma;
* alfa ili centromerne ponavljajuće sonde su ponavljajuće sekvence centromernih regiona hromozoma. Uz njihovu pomoć, svaki se kromosom može obojiti u drugu boju, što vam omogućuje brzo određivanje broja kromosoma i odstupanja od njihovog normalnog broja;
* Sonde za cijeli hromozom su skup malih sondi koje su komplementarne pojedinačnim dijelovima hromozoma, ali općenito pokrivaju cijelu njegovu dužinu. Koristeći biblioteku takvih sondi, može se "obojiti" cijeli hromozom i dobiti diferencijalni spektralni kariotip pojedinca. Ova vrsta analize se koristi za analizu hromozomskih aberacija, kao što su translokacije, kada se deo jednog hromozoma prenese na krak drugog.

Fluorescentno označena hibridizacija in situ (FISH)

Materijal za studiju je krv, koštana srž, biopsija tumora, posteljica, fetalno tkivo ili amnionska tečnost. Uzorci za analizu moraju se dostaviti svježi u laboratoriju. Preparati (slajdovi) se pripremaju direktno iz uzoraka tkiva ili nakon njihove kultivacije. Mogu se koristiti i metafazni i interfazni ćelijski preparati. Specifične DNK sonde označene fluorescentnim oznakama hibridiziraju se sa hromozomskom DNK, a više sondi se može koristiti istovremeno na različitim lokusima.

FISH je korisna i osjetljiva metoda citogenetske analize u otkrivanju kvantitativnih i kvalitativnih hromozomskih aberacija kao što su delecije (uključujući mikrodelecije), translokacije, udvostručavanje i aneuploidija. FISH na interfaznim hromozomima je brza metoda za prenatalnu dijagnozu trisomije 21, 18 ili 13 ili aberacija polnih hromozoma. U onkologiji, FISH može otkriti brojne translokacije (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1) povezane s hematološkim malignitetima. Metoda se također može koristiti za praćenje rezidualnih efekata raka nakon kemoterapije i transplantacije koštane srži i za otkrivanje pojačanih onkogena (c-myc/n-myc) povezanih s lošom prognozom za neke tumore. FISH se također koristi za praćenje preživljavanja alografta koštane srži dobijenog od osobe suprotnog spola.

FISH je osjetljiva metoda za identifikaciju hromozomskih aberacija i za brzu analizu velikog (> 500) broja ćelija odjednom. Metoda je vrlo precizna u identifikaciji prirode hromozoma i nepoznatih fragmenata hromozomske DNK.

Tradicionalna citogenetika kada se proučava kariotip, on je uvek bio ograničen nivoom rezolucije opsega. Čak i uz diferencijalno bojenje hromozoma visoke rezolucije, pronašli smo samo više traka po hromozomu, ali nismo bili sigurni da dolazimo do molekularne razine rezolucije. Nedavni napredak u DNK tehnologiji i citogenetici omogućio je korištenje FISH metoda za analizu promjena u hromozomskoj DNK na molekularnom nivou. Molekularna citogenetika je omogućila revolucionarni proboj u citogenetici, omogućavajući:

Analizirati DNK strukturu hromozoma u rasponu od 10-100 kilobaza;
dijagnosticirati interfazne ćelije koje se ne dijele, što je imalo ogroman utjecaj na prenatalnu dijagnozu i preimplantacijsku genetsku dijagnozu (PGD).

FISH tehnologija koristi DNK sondu koja veže ili obnavlja specifične sekvence DNK unutar hromozoma. Denaturirana sonda se inkubira s nativnom ćelijskom DNK, također denaturiranom u jednolančano stanje. Sonda zamjenjuje biotin deoksiuridin trifosfat ili digoksigenin uridin trifosfat timidinom. Nakon renaturacije nativne DNK pomoću sonde, kompleks sonda-DNK može se otkriti dodavanjem fluorohrom-obilježenog biotin-vezujućeg avidina ili fluorohrom-obilježenog antidigoksigenina. Dodatno pojačanje signala može se dobiti dodavanjem antiavidina i ispitivanjem rezultirajućeg kompleksa pomoću fluorescentne mikroskopije. Označavanjem različitih DNK sondi s nekoliko različitih fluorohroma, nekoliko hromozoma ili segmenata hromozoma unutar jedne ćelije može se istovremeno vizualizirati kao višebojni signali.

Sposobnost definisanja specifične genske segmente, prisutni ili odsutni na hromozomima, omogućili su dijagnosticiranje sindroma genskih sekvenci na nivou DNK, kao i translokacije u interfaznim jezgrama, često u pojedinačnim ćelijama.

materijal za RIBA mogu poslužiti ili metafazni hromozomi dobijeni iz ćelija koje se dele ili interfazna jezgra iz ćelija koje nisu u fazi deobe. Sekcije su prethodno tretirane RNazom i proteinazom kako bi se uklonila RNK koja se može unakrsno hibridizirati sa sondom i hromatinom. Zatim se zagrijavaju u foramidu da denaturiraju DNK i fiksiraju ledeno hladnim alkoholom. Sonda se zatim priprema za hibridizaciju zagrijavanjem. Nakon toga, sonda i preparat hromozoma se miješaju i zatvaraju pokrovnim stakalcem na 37 °C radi hibridizacije. Promjenom temperature inkubacije ili sastava soli otopine za hibridizaciju, može se povećati specifičnost vezivanja i smanjiti pozadinsko obilježavanje.

Primjena fluorescentne in situ hibridizacije - FISH tehnologija

Efikasnost FISH tehnologije je prvi put pokazano lokalizacijom gena na . Uvođenjem metode fluorescentnog obilježavanja, in situ hibridizacija je postala nezamjenjiva za dijagnozu hromozomskih abnormalnosti koje se ne otkrivaju tradicionalnim metodama povezivanja. RIBA je također odigrala ključnu ulogu u jednom od najneobičnijih otkrića moderne genetike, genomskom otiskivanju.

Njegova tehnologija razvoja RIBA primljena u tri oblika. Centromerne, ili alfa-satelitske, sonde karakterizira relativna kromosomska specifičnost, najčešće su korištene u genetici interfaznih stanica. Ove sonde stvaraju donekle difuzne signale adekvatne jačine u regiji centromera, ali se ne križaju sa hromozomima koji imaju slične centromerne sekvence. Trenutno su razvijene sonde sa jednom kopijom koje daju diskretni signal iz specifične trake hromozoma i omogućavaju izbegavanje fenomena unakrsne hibridizacije. Ove sonde se takođe mogu koristiti za određivanje broja kopija i specifičnih hromozomskih regiona za koje se sumnja da su povezani sa određenim sindromom. Pojedinačna kopija i centromerne sonde dizajnirane za hromozome 13, 18, 21, X i Y koriste se za prenatalnu dijagnozu.

Također je moguće "zamrljati" cijele hromozome RIBA. Zahvaljujući tehnologiji spektralne kariotipizacije, koja koristi mješavinu različitih fluorohroma, sada je moguće kreirati jedinstveni fluorescentni uzorak za svaki pojedinačni hromozom sa 24 pojedinačne boje. Ova tehnologija omogućava određivanje složenih kromosomskih preuređivanja koji nisu vidljivi upotrebom tradicionalnih citogenetskih tehnika.

Metoda RIBA u prenatalnoj dijagnostici. Za žene starije reproduktivne dobi trudnoća može biti razlog ne toliko za radost, koliko za zabrinutost. Sa godinama žene povezan je rizik od razvoja hromozomskih abnormalnosti fetusa. Amniocenteza, urađena u 16. nedelji trudnoće, praćena analizom kariotipa traje 10-14 dana. Upotreba FISH-a u pretpregledu omogućava bržu dijagnozu i skraćeno vrijeme čekanja. Većina genetičara i laboratorija je mišljenja da FISH metodu ne treba koristiti izolovano za donošenje odluka o budućem vođenju trudnoće. FISH metoda mora biti dopunjena kariotipskom analizom, a njeni rezultati trebaju barem korelirati s patološkom slikom ultrazvuka (ultrazvuka) ili biohemijskog skrininga krvi majke.

Sindromi gena sekvence također poznati kao mikrodelecijski sindromi ili segmentna aneusomija. To su delecije susjednih fragmenata hromozoma, koje obično uključuju mnogo gena. Sindromi genske sekvence prvi put su opisani 1986. godine upotrebom klasičnih citogenetskih tehnika. Sada, zahvaljujući FISH-u, moguće je identificirati submikroskopske delecije na nivou DNK, što je omogućilo identifikaciju najmanjeg izbrisanog područja povezanog s razvojem određenog sindroma, nazvanog kritična regija. Jednom kada se identifikuje kritična regija za sindrom, često je moguće identifikovati specifične gene čije se odsustvo smatra povezanim sa sindromom. Nedavni vodič za sindrome genske sekvence izvještava o 18 sindroma delecije i mikrodelecije povezanih sa 14 hromozoma. Neki od najčešćih sindroma genske sekvence i njihove kliničke manifestacije prikazani su u tabeli. 5-2.

Telomere- formacije koje pokrivaju krajeve dugih i kratkih krakova hromozoma. Sastoje se od ponavljanja TTAGGG sekvenci i sprečavaju spajanje krajeva hromozoma. Telomerne sonde igraju važnu ulogu u prepoznavanju složenih translokacija koje se ne mogu odrediti tradicionalnim citogenetskim metodama. Osim toga, jedno od otkrića projekta Human Genome bila je činjenica da su regije hromozoma pored telomera bogate genima. Sada je pokazano da su submikroskopske subtelomerne delecije odgovorne za pojavu mnogih genetski uvjetovanih bolesti.

In situ hibridizacija nukleinskih kiselina Metoda se zasniva na mogućnosti formiranja dvolančanih hibrida između obilježenih sondi umjetno stvorenih na bazi jednolančanih sekvenci (ribo- ili deoksiribo-, oligo- ili polinukleotida) i sekvenci koje su im komplementarne u mete - analizirane molekule DNK ili RNK. Da bi se identificirala mjesta hibridizacije, DNK sonda (DNK sonda) je označena reporterskom grupom: ü radioaktivni izotop, ü fluorohrom, ü enzim koji daje mrlju ili luminiscentni proizvod, ü hapten s kojim se obilježeno tijelo vezuje, itd.

Otkrivanjem hibrida zbog prisustva reporterske grupe u sondi, može se - procijeniti broj gena koji kodiraju određeni tip RNK, - odrediti udio netranskribirane DNK u genomu, - uspostaviti povezanost određenih gena međusobno – i njihova tačna lokacija na hromozomima. Metoda molekularne hibridizacije ima visoku osjetljivost (moguće je detektirati malu količinu označene sonde (10 -15 i 10 -19 M) i, shodno tome, njen komplementarni niz u meti) i brzu analizu, što ga čini Ovu metodu moguće je koristiti kako za istraživačke aktivnosti tako i za dijagnostiku nasljednih i zaraznih bolesti u medicini, veterini i biljnoj proizvodnji.

Pojava novih tehnologija u molekularnoj citogenetici, baziranih uglavnom na in situ hibridizaciji nukleinskih kiselina, značajno je proširila mogućnosti hromozomske dijagnostike.

Interfazna citogenetika: 1. Višebojna traka hromozoma (MCB). 2. Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). 3. Kombinacija FISH sa drugim metodama: -citologija + FISH; -histologija + RIBE; -imunofenotipizacija + RIBE (FIKCIJA); Metafazna citogenetika: 1. Čvrsto bojenje hromozoma (cijela slika). 2. Komparativna genomska hibridizacija (CGH). 3. Kariotipizacija promjene boje (CCK). 4. Višebojna kariotipizacija: spektralna kariotipizacija (SKY); višebojna RIBA (M - RIBA, M - TRAKA).

FISH – fluorescentna in situ hibridizacija – je citogenetska metoda koja se koristi za detekciju i lokalizaciju specifičnih sekvenci DNK na hromozomima, mRNA, itd. Tehnika se zasniva na hibridizaciji fluorescentno obeležene DNK/RNA sonde sa komplementarnom sekvencom DNK/RNA. Oznaka se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa. FISH metoda je uvedena prije više od 30 godina. Postala je široko rasprostranjena kao metoda fizičkog mapiranja gena na hromozomima. Kasnije je primijenjen iu drugim područjima istraživanja (u područjima kliničke genetike, reproduktivne medicine, toksikologije, evolucijske biologije, komparativne i ćelijske genomike i hromozomske biologije). Trenutno se FISH uglavnom koristi za izgradnju fizičkih i genetičkih mapa hromozoma, za detekciju strukturnih preuređivanja, translokacija, mikrodelecija, genskih amplifikacija u interfaznim i metafaznim hromozomima. Kao rezultat napretka nauke (bolje razumijevanje kemijskih i fizičkih svojstava nukleinskih kiselina i kromatina), kao i razvoja fluorescentne mikroskopije i digitalnog snimanja, metoda je konstantno unapređivana (poboljšanja osjetljivosti, specifičnosti, rezolucije) i razvijene su mnoge varijacije ove metode.

1) Ćelije se ispuštaju na staklenu pločicu uzrokujući širenje hromozoma. 4) Hromozomi su kontraobojeni pomoću DAPI 2) Fluorescentno označena sonda se stavlja na hromozome i zatvara. 3) Sonda i hromozomi su denaturirani, hibridizirani i isprani 5) Slajd se gleda pod fluorescentnim mikroskopom

Opšti pogled na protokol za postavljanje FISH može se predstaviti na sljedeći način: 1. Priprema histološkog ili citološkog uzorka. Priprema histološkog preparata provodi se prema standardnoj shemi: rezanje, označavanje, ožičenje, izlijevanje, mikrotomija, stavljanje reza na predmetno staklo i deparafinizacija. Prilikom pripreme citološkog preparata koriste se posebne otopine za taloženje i centrifugiranje, što omogućava dobivanje koncentrirane suspenzije stanica. 2. Predtretman (ako je potrebno). Preparat se obrađuje proteazama kako bi se eliminisalo prisustvo proteina koji ometaju hibridizaciju. 3. Primjena DNK sonde na preparat i naknadna denaturacija. Da bi se denaturirala sonda i DNK uzorka, oni se tretiraju formamidom i zagrijavaju na temperaturu od oko 85-900 C.

4. Hibridizacija. Nakon denaturacije, lijek se ohladi na određenu temperaturu (370 C u slučaju kliničkih studija) i inkubira u vlažnoj komori nekoliko sati (trajanje inkubacije je naznačeno u svakom posebnom protokolu). Trenutno se za denaturaciju i hibridizaciju koriste automatski hibridizatori. 5. Pranje. Kada se hibridizacija završi, nevezane sonde moraju biti isprane, što bi inače stvorilo pozadinu koja otežava procjenu FISH rezultata. Za ispiranje se obično koristi otopina koja sadrži citrat i natrijum hlorid (SSC). 6. Protiv bojenje. Uz pomoć fluorescentnih boja (DAPI - 4,6-diamidin-2 fenilindol; propidijum jodid), sva nuklearna DNK je obojena. 7. Analiza rezultata pomoću fluorescentnog mikroskopa Rutinske operacije (deparafinizacija, predtretman, pranje) mogu se automatizirati.

Ispitivanje telomernih regiona pomoću fluorescentnog mikroskopa. Kombinuju se slike dobijene u fazi interfaze (nukleus) i metafaze (pojedinačni hromozomi). plava boja - DAPI.

Prednosti FISH metode: 1. Mogućnost proučavanja genetskog materijala u interfaznim jezgrima; 2. Dobijanje objektivnih rezultata na osnovu da/ne je kvantitativna metoda 3. Relativno jednostavna interpretacija rezultata visoka rezolucija Nedostaci FISH metode: 1. fluorescentne boje brzo "blede" mikroskop.

FISH metoda se temelji na reakciji hibridizacije između DNK sonde stvorene posebnim tehnologijama, koja je nukleotidna sekvenca ograničene veličine, i komplementarnog dijela nuklearne DNK citogenetskog preparata koji se proučava. DNK sonda je glavni element za postavljanje FISH-a i nosi "oznaku", odnosno sadrži nukleotide koji su direktno vezani za fluorohrom ili hapten za dalju vizualizaciju antitijelima koja nose fluorohrom. Nevezana označena DNK se ispere, a zatim se hibridizirana DNK sonda detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa.

Označavanje DNK dijeli se na direktno i indirektno. Direktno označavanje uvodi reporterske elemente u DNK - fluorohrome (rodamin, dietilaminokumarin, teksas crveni, itd.). Metoda indirektnog označavanja - uzorak DNK je prethodno konjugiran sa intermedijarnim ligandima (biotin, dioksigenin, 2, 4-dinitrofenol), čije se prisustvo na citološkom preparatu zatim detektuje pomoću fluorohroma. U ovom slučaju, osjetljivost metode se značajno povećava, jer ligand može sadržavati nekoliko mjesta interakcije s fluorohromom. In situ hibridizacija sa 32 P-obilježenom sondom prvi put je opisana 1969. godine. Razvoj neradioaktivnih sistema za obeležavanje i detekciju DNK sondi učinio je metodu in situ hibridizacije bezbednom, lakom za izvođenje i manje napornom u obradi rezultata. Fluorescentne boje su mekane i jednostavne za upotrebu, mogu se čuvati neograničeno dugo, daju visoku rezoluciju i omogućavaju istovremeno ispitivanje više sekvenci DNK.

Sonde: jednolančane/dvolančane DNK/RNA primarno/sekundarno označene sonde. Sonde se obeležavaju: 1) direktno: umetanjem nukleotida za koje je vezan fluorohrom (PCR ili nick translacija) 2) preko reporterske molekule (npr. digoksigenin, biotin) za koju su vezana fluorescentno obeležena antitela. Da biste pojačali signal, možete koristiti sekundarna, tercijarna itd. antitijela označena fluorescentnom oznakom. DNase ukida DNK Nick Translation DNK polimeraza I dodaje nove nukleotide 3' hidroksil DNK polimerazi I uklanja pojedinačne baze sa snimanja hromozoma 5' kraja: korišćenjem DAPI (2 mg/ml). 4', 6-diamidino-2-fenilindol; snažno vezivanje za A-T bogate DNK regije; ekscitacija UV svjetlom; emisija 461 nm (plava).

Trenutno postoji nekoliko glavnih pristupa koji se široko koriste u modernoj molekularnoj citogenetici: Identifikacija materijala proširenih hromozomskih regiona i celih hromozoma. Detekcija specifične DNK sekvence u oblasti od interesa. Analiza neravnoteže pojedinih hromozomskih regiona. Za identifikaciju materijala proširenih hromozomskih regiona i celih hromozoma, široko se koriste hromozomske i specifične DNK sonde („probe za slikanje“).

Karakteristike različitih tipova sondi 1. sonde specifične za lokus (LSI - locus - specifični identifikatori koji se vezuju za određene regione hromozoma.) Ove sonde se koriste za identifikaciju dostupne kratke (neponavljajuće) sekvence izolovane DNK, koja se koristi za pripremu označene sonde i njenu naknadnu hibridizaciju sa skupom hromozoma. Dizajnirani su za otkrivanje dijagnostički i prognostički značajnih hromozomskih aberacija u različitim patološkim stanjima (monosomija i trisomija za pojedinačne hromozome). Najrasprostranjenija upotreba ovih uzoraka dobijena je u prenatalnoj citogenetskoj dijagnostici, posebno u proučavanju ćelija korionskog tkiva i interfaznih jezgara amniocita.

2. DNK sonde za telomerne regione hromozoma (TEL telomericprobe) su dizajnirane da otkriju delecije i preuređenja koja utiču na terminalne regione krakova hromozoma. Takve sonde su specifične za p- ili q-krake hromozoma i komplementarne su regionu dugačkom oko 300 kb. od kraja hromozoma. DNK sonde za kratke i dugačke krakove hromozoma su po pravilu povezane sa različitim fluorohromima, što omogućava detekciju oba telomerna regiona hromozoma na jednom citogenetskom preparatu.

3. Sonde za ponavljanje centromera, alfa ili hromozomski brojači (CEP - centromere. Enumeration. Probe) su DNK sonde specifične za hromozom predstavljene sekvencama tandemskih alfa i beta satelitskih ponavljanja. Ova ponavljanja su locirana pretežno u centromernim ili pericentromernim heterohromatinskim regijama hromozoma. Uz njihovu pomoć, svaki kromosom se može obojiti u drugu boju, što vam omogućava da brzo odredite broj kromosoma i odstupanja od njihovog normalnog broja, komplementarno pojedinačnim dijelovima kromosoma, ali kao cjelina pokriva cijelu njegovu dužinu. Koristeći biblioteku takvih sondi, može se "obojiti" cijeli hromozom i dobiti diferencijalni spektralni kariotip pojedinca. Ova vrsta analize se koristi za analizu hromozomskih aberacija, kao što su translokacije, kada se deo jednog hromozoma prenese na krak drugog.

Primene FISH se široko koristi za rešavanje sledećih kliničkih dijagnostičkih zadataka: 1. Perimplantacija prenatalne i dijagnostika hromozomskih abnormalnosti. Koristi se u klinikama za vantjelesnu oplodnju (IVF) i perinatalnim centrima. Omogućava pravovremeno (prije implantacije embrija u slučaju IVF-a ili u ranim fazama fetalnog razvoja) da se identifikuju genetski poremećaji kod nerođenog djeteta i preduzmu potrebne mjere. 2. Onkohematologija. Onkohematološke bolesti nastaju kao rezultat različitih hromozomskih aberacija, pa se za njihovu dijagnostiku koriste odgovarajuće CEP i LSI sonde. 3. Dijagnoza solidnih tumora. Trenutno se uspostavlja sve više uzročno-posledičnih veza između razvoja specifičnih karcinoma i specifičnih promjena u genomu za njih. Stoga je korištenjem odgovarajućih DNK sondi moguće provesti onkološku FISH dijagnostiku.

Interfazna citogenetika: Kombinacija RIBE sa drugim metodama: - imunofenotipizacija RIBE (FIKCIJA); + FIKCIJA (Fluorescentna imunofenotipizacija i interfazna citogenetika kao alat za istraživanje neoplazmi) - za proučavanje tumorskih ćelija. Za ovu analizu koriste se neobojeni razmazi krvi, koštane srži ili preparati drugih tkiva. Faza 1 - preparati se inkubiraju sa specifičnim monoklonskim antitelima, faza 2 - vrši se konjugacija sa fluoroforima za naknadnu vizualizaciju kompleksa antigen-monoklonsko antitelo. Faza 3 - izvršiti in situ hibridizaciju sa DNK sondama. Fluorofori koji se razlikuju po boji koriste se za otkrivanje monoklonskih antitijela i DNK sondi. Proučavanje preparata pod fluorescentnim mikroskopom sa potrebnim setom filtera omogućava istovremenu analizu imunofenotipa hibridizacije i signala u interfaznim jezgrama.

Delecija hromozoma TNFAIP 3 u c. HL detektovan interfaznom citogenetikom. FICTION analize. predstavnik c. Kombinovani slučajevi HL. CD 30 ekspresija (crvena) i FISH sonde za TNFAIP 3 i centromeru hromozoma 6 (plava [b]). U testovima dvostruke boje u A–C i E i F, TNFAIP 3 sonda je označena zelenom bojom (g); u trobojnom testu primenjenom u D, TNFAIP 3 sonda daje g/narandžasti kolokalizovani (co) signal. Dve različite strategije se koriste za prikaz dvostrukih i trobojnih FISH testova u kombinaciji sa CD 30 imunofluorescencijom; i. e. , dvobojni testovi (A–C i E i F) prikazani su pomoću displeja u tri boje, dok se lažni višebojni prikaz koji je dobio softverom Isis primjenjuje za trobojni test (D) da istovremeno prikazuje četiri boje ( tj. CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] i narandžasta i centromera hromozoma 6 [b]).

Digitalno snimanje mikroslika otvorilo je mogućnost pretvaranja u pseudoboje ne samo kombinacija fluorofora, već i njihovih odnosa, intenziteta

Višebojno bojenje hromozoma (Muli. Color Banding - MSV) Ova metoda nije namijenjena za potpunu analizu svih hromozoma, već za detaljnu analizu jednog hromozoma. DNK sonde specifične za lokus su označene različitim fluoroforima ili kombinacijama fluorofora tako da nivo signala svake od DNK sondi varira u intenzitetu. Preklapajući profili intenziteta signala DNK sonde daju varijacije u omjerima intenziteta fluorescencije različitih fluorofora duž hromozoma. Omjeri intenziteta mogu se prevesti u pseudoboje, pa će tako svaka tačka slike, a samim tim i svaki od hromozomskih lokusa, imati svoju pseudoboju. Ova verzija višebojne FISH metode pokazala se vrlo efikasnom u analizi ne samo interhromozomskih već i intrahromozomskih preustroja u onkološkim bolestima. Međutim, za njegovu uspješnu primjenu potrebno je prvo odrediti kromosom koji će se istraživati. Ova metoda molekularne citogenetike pogodna je za analizu kariotipskih poremećaja povezanih s određenim kromosomima.

Do danas su kreirani setovi DNK sondi koje obezbeđuju MCV za sve ljudske hromozome na hromozomu 5; višebojne trake hromozoma 5; idiogram hromozoma 5; fluorohrome koji se koriste za MSV).

Metafazna citogenetika, koja je istorijski nastala ranije od interfazne citogenetike, omogućava određivanje širokog spektra hromozomskih poremećaja, ali to zahteva da ćelije koje se proučavaju budu u fazi metafaze mejoze.

Višebojna kariotipizacija Analiza se vrši korišćenjem DNK sondi kontinuiranog bojenja do krakova ili celih hromozoma (WCP sonde - farba celog hromozoma). Takve sonde se hibridiziraju s brojnim kratkim sekvencama DNK koje se nalaze duž cijele dužine hromozoma. Stoga, kada se gleda pod fluorescentnim mikroskopom, hromozom izgleda jednolično obojen određenom bojom.

DNK sonde koje se koriste za ovu analizu sastoje se od mješavine čvrstih sondi za bojenje za puni set ljudskih hromozoma, označenih kombinacijom nekoliko fluorohroma, čiji se odnos bira pojedinačno za svaki par hromozoma. Korištenje odgovarajućih metoda registracije i kompjuterskih programa za analizu slike, koji procjenjuju intenzitet luminescencije svih fluorohroma za svaku tačku slike, omogućava da se izvrši kariotipizacija, u kojoj svaki par hromozoma ima svoju jedinstvenu "pseudoboju". ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor ili multiplex. FISH) je generički naziv za tradicionalne višebojne RIBE koje koriste setove filtera specifičnih za fluorohrom. M-FISH princip se sastoji u odvojenom digitalnom snimanju signala svih korištenih fluorohroma, što se postiže sekvencijalnom promjenom filterskih setova. Sve slike se snimaju u zasebne datoteke, što omogućava njihovu efikasnu obradu u vezi sa razdvajanjem signala i pozadine, kao i kvantifikacijom signala. Obrada svih snimljenih informacija uz pomoć specijalnog softvera prevodi informacije o nivou fluorohromnih signala u svakoj tački slike u pseudoboje. Jedno od glavnih ograničenja broja korišćenih DNK sondi je broj dostupnih fluorohroma, sa ne-preklapajućim spektrom ekscitacije i emisije, i dostupnost odgovarajućih filterskih setova.

RIBA u 24 boje Najrasprostranjenija M-RIBA je RIBA od 24 boje za istovremenu identifikaciju materijala iz svih ljudskih hromozoma. Veoma je efikasan u otkrivanju hromozomskih translokacija, ali nije dizajniran za otkrivanje delecija i inverzija. Međutim, ovaj problem se može djelomično riješiti istovremenim bojenjem hromozoma DAPI, što omogućava analizu diferencijalne pruge hromozoma čiji je hromozomski materijal već identifikovan. Nažalost, treba napomenuti da je kvalitet DAPI traka hromozoma nakon M-FISH značajno inferioran u odnosu na GTG diferencijalno bojenje, pa čak i DAPI trake nakon konvencionalne in situ hibridizacije.

Rx. RIBA Princip M-FISH je korišten za generiranje višebojnog bar koda za ljudske hromozome i metode višebojnih traka hromozoma zasnovane na interspecies in situ hibridizaciji. Za razliku od FISH-a sa 24 boje, ova metoda omogućava direktno otkrivanje dijela intrahromozomskih preuređivanja. DNK sonde korištene u Rx. RIBA označena kombinacijom 3 fluorohroma, što daje 7 pseudo boja. Oni posebno boje pojedinačne regije hromozoma, stvarajući njihovu prugastu boju. Ova karakteristika DNK uzoraka za Rx. RIBE se određuju po načinu na koji se dobijaju. To su hromozomske specifične DNK biblioteke dvije vrste gibona: Hylobates concolor i Hylobates syndactylus.

Kao rezultat intenzivnih kromosomskih preuređivanja do kojih je došlo tokom formiranja modernih vrsta gibona, ispostavilo se da je materijal njihovih hromozoma jako izmiješan u odnosu na organizaciju hromozoma kod ljudi, čiji su hromozomi poznati po svojoj konzervativnosti. Odnos ljudskog hromozoma 1 i gibon hromozoma prikazan je na slici 1,

Slika 2 prikazuje opšti prikaz ljudskih hromozoma dobijenih kao rezultat Rx. RIBA. a) Metafazna ploča b) Raspored hromozoma.

Međutim, RXFISH ima ozbiljna ograničenja - hromozomska preuređivanja koja su se dogodila unutar jedne RX trake u boji ne mogu se otkriti ovom metodom osim ako ne dovedu do značajnih i lako vidljivih promjena u veličini ove trake. - sonde boje nekoliko hromozomskih regiona različitih hromozoma u jednoj pseudoboji. Međutim, kako se broj korištenih fluorohroma povećava, RXFISH metoda će nesumnjivo biti informativnija od rutinske FISH u 24 boje.

Prednosti RXFISH-a trenutno uključuju sljedeće: Metoda omogućava analizu cjelokupnog ljudskog genoma u jednom višebojnom FISH eksperimentu. Dostupni su komercijalno dostupni setovi označenih DNK sondi i potrebni sistemi za detekciju. Metoda omogućava brzu identifikaciju značajnog dijela intra- i interhromozomskih preuređivanja. Moguća je automatska identifikacija metafaznih hromozoma „pojasa u boji“. Svaki ljudski hromozom ima jedinstveni bar kod u boji. RXFISH je integrisan u Cyto radnu stanicu. Vision i standardni fluorescentni mikroskopski sistemi.

Spektralna kariotipizacija (SKY-spektralkariotipizacija) Osnovni principi mikroskopske analize slike u spektralnoj kariotipizaciji su praktično isti kao oni koji se koriste u M-FISH. Razlike su vezane za način na koji je slika registrovana. SKY tehnologija omogućava dobijanje spektralnih krivulja za sve tačke slike tokom jednog merenja, bez obzira da li je povezano sa epifluorescencijom ili tradicionalnom svetlosnom mikroskopijom. Za spektralnu kariotipizaciju svih ljudskih hromozoma koristi se pet fluorohroma, jedan u zelenom spektru, dva u crvenom i dva u infracrvenom. Ekscitacija i emisija svih fluorohroma koji se koriste u obeležavanju DNK sondi odvija se sa jednim setom filtera, što omogućava da se izbegnu njihova sekvencijalna promena, srednje fokusiranje i, posledično, povezani problemi, kao što su prostorni pomak slike, određivanje graničnih vrednosti i maske za segmentaciju. Na osnovu analize spektralnih krivulja utvrđuje se prisustvo ili odsustvo specifičnih fluorohroma u datoj tački.

Sljedeći korak je postupak klasifikacije, koji vam omogućava da direktno i nedvosmisleno odredite kromosomsku pripadnost analiziranog materijala. Ovo osigurava pouzdanu identifikaciju (do hromozoma) materijala markera hromozoma, kao i derivata hromozoma koji su rezultat različitih preuređivanja. Velika prednost SKY-a je da se DAPI bojenje registruje paralelno sa spektralnom slikom. Softversko poboljšanje DAPI bandinga omogućava postizanje diferencijalne pruge u kvalitetu blizu GTG pojasa. Mogućnost paralelne analize spektralne slike i kvalitativnog diferencijalnog bojenja hromozoma uvelike pojednostavljuje interpretaciju SKY rezultata i omogućava preciznije određivanje tačaka lomova hromozoma. Nesumnjive prednosti SKY-a uključuju mogućnost upotrebe fluorohroma sa preklapajućim spektrom ekscitacije i emisije, što značajno proširuje listu upotrebljivih fluorohroma, a takođe povećava broj fluorohroma koji se mogu koristiti istovremeno. Listing novog fluorohroma ne zahteva kupovinu novog seta filtera, jer je za SKY dovoljna jedna filterska jedinica za spektralnu FISH i jedna filterska jedinica za DAPI.

Nedostaci SKY-a uključuju: - dugo vrijeme ekspozicije, neophodno za snimanje mikroskopskih slika. - SKY je nešto manje efikasan od M-FISH kada je u pitanju istraživanje sa relativno malim DNK sondama.

Kariotipizacija sa promenom boje (CCKs Kariotipizacija promene boje) Ova metoda se zasniva na analizi razlike u dužini signala između uzoraka DNK hibridizovanih sa DNK sondama povezanim sa fluorohromima i DNK sondama koje nose antitela. Metoda je izvodljiva sa samo 3 filtera i ne zahtijeva posebne kamere i softver. Da bi se identificirali hromozomi, provodi se jedna hibridizacija i dobivaju se dvije slike. Metoda se zasniva na razlici u dužini fluorescentnog signala, budući da je vrijeme izlaganja DNK uzoraka povezanih s antitijelima 80 - 90% kraće od vremena izlaganja uzoraka povezanih s fluorohromima. Nakon reakcije hibridizacije, brisevi se izlažu odgovarajućim primarnim antitijelima, a zatim se vizualiziraju kako bi se dobila prva slika. Stakalca se zatim izlažu sekundarnim antitijelima i avidinu vezanom za iste fluorohrome. Potezi se mogu protivbojiti pomoću DAPI.

U budućnosti, slike preparata se ponovo dobijaju korišćenjem 3 filtera naizmjence. Ove slike se upoređuju pomoću specijalnog softvera i dobija se druga slika na kojoj će biti vidljivi samo hromozomi povezani sa određenim antitelima. Dakle, neki hromozomi će fluorescirati samo na prvom ili drugom skeniranju, dok će drugi promijeniti boju na različitim skeniranjima.

Komparativna genomska hibridizacija (CGH) Metoda je kreirana za identifikaciju kvantitativnih poremećaja u genomu. Zasniva se na izvođenju in situ reakcije hibridizacije koristeći cijeli genom kao DNK sondu. Izolovana i normalna DNK donora je označena fluorohromima različitih boja, čime se pretvaraju u DNK sonde. Ekvivalentne količine ovih sondi se miješaju i koriste u hibridizaciji sa kontrolnim citogenetskim preparatom. Nakon FISH-a, metafaze se analiziraju na fluorescentnom mikroskopu, koristeći specijalizovani kompjuterski program za analizu slike kako bi se odredio intenzitet fluorescencije dva fluorohroma duž cijele dužine svakog hromozoma.

U nedostatku kvantitativnih promjena u kariotipu ispitivanog uzorka, uočit će se određeni omjer intenziteta luminiscencije dva fluorohroma. U slučaju amplifikacije gena, intenzitet signala odgovarajućeg fluorohroma će se povećati, au slučaju gubitka dijela genetskog materijala, naprotiv, oslabiti. Dakle, CGH omogućava otkrivanje genomske neravnoteže, ali ova metoda se ne može koristiti za otkrivanje balansiranih translokacija i inverzija, a trizomije i delecije se mogu detektovati samo ako je veličina neuravnotežene regije najmanje 10 miliona parova baza.

Hromozomska neravnoteža u test uzorku se procjenjuje na osnovu razlike u intenzitetu fluorescencije dva različita fluorohroma izračunavanjem fluorescentnog omjera (FR).

CGH metoda ima niz prednosti u odnosu na druge metode za analizu promjena genoma: Prvo, ne ovisi o izvoru materijala za testiranje i može se uspješno izvesti s malom količinom DNK testirane, uključujući i arhivski materijal. Drugo, omogućava dobivanje detaljnih informacija o gubitku ili povećanju broja kopija genetskog materijala u cijelom genomu u jednom eksperimentu. Treće, CGH metoda ne zahtijeva pripremu metafaznih hromozomskih preparata iz proučavanog tkiva, odnosno ne zavisi od procesa ćelijske kulture i srodnih artefakata.

Genomska situ hibridizacija (genomicin situ hybridization in, GISH) je varijanta metode situ hibridizacije, koja se sastoji u tome da se za hibridizaciju sa fiksnim uzorcima koristi ukupna genomska DNK jedne vrste organizma kao fluorescentno označena sonda, sa kojima se takmiči ukupna genomska DNK druge vrste organizma; koristi se za određivanje međuvrstskih i intraspecijskih razlika u genomima, kromosomskim preuređenjima, delecijama i supstitucijama.

Varijacije RIBE 1) Q-FISH – kvantitativna RIBA: razvili Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward i P. M. Lansdorp. 1998. Kratke telomere na ljudskom hromozomu 17 str. Nat. Genet. 18:76-80. kvantitativna metoda. Dizajniran za rad sa protočnom citometrijom. Prvobitno korišten za mjerenje dužine hromozoma (rezolucija: 200 bp) brojanjem broja telomernih ponavljanja. Koriste se PNA-konjugirane sonde. U početku su se proučavali metafazni hromozomi (QFISH pravi), sada je ova metoda primenljiva i na interfazne hromozome (IQ-FISH). Q-FISH se izvodi na kulturi ćelija, presecima tkiva (oboje na čašama). Q-FISH je trenutno važan alat u proučavanju uloge telomera u procesima starenja i formiranja raka.

PNA-FISH - Peptidne nukleinske kiseline RIBA: Peptidne nukleinske kiseline (PNA) su sintetički analozi DNK u kojima je šećerna kičma dezoksiriboza fosfata, koja podržava azotnu bazu, zamijenjena nenabijenom peptidnom kičmom. Kao rezultat ove strukture: kada se PNA-oligomerna sonda hibridizira sa komplementarnom DNK/RNA, ne dolazi do elektrostatičkog odbijanja. Dupleksi PNA-DNK (PNA-RNA) su mnogo stabilniji od prirodnih homo/heterodupleksa. Visoka specifičnost vezivanja PNA-DNK: PNA-DNK hibridizacija je mnogo osjetljivija na nepodudarnost parova baza nego hibridizacija DNK-DNK. Tako se pomoću PNA sonde mogu razlikovati dva centromerna ponavljanja, koja se razlikuju samo u jednom paru baza. PNA ima relativnu hidrofobnost (u poređenju sa DNK), zbog čega PNA bolje difundira kroz ćelijske zidove => široka primena u mikrobiologiji. Zasnovano na visokoj specifičnosti vezivanja: Vjeruje se da će PNA tehnologija uskoro postati osnova za stvaranje alel-specifičnih sondi za in situ hibridizaciju. Koristi se u genetici, citogenetici, epigenetici, mikrobiologiji itd.

3) Flow-FISH - FISH za protočnu citometriju: Predložio 1998. godine: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Dinamika dužine telomera u subpopulacijama limfocita ljudi izmjerena dinamikom protoka limfocita . biotehnologije prirode. 16, 743–747 (1998). Kombinacija Q-FISH i protočne citometrije koja omogućava analizu (mjerenje) i sortiranje signala. Za flow-FISH se koristi ćelijska suspenzija (za mjerenje dužine telomera hromozoma), hromozomske širine i izolovani hromozomi (za dalje mapiranje). Kao i kod Q-FISH, koriste se telomerne sonde označene PNA (na primjer, za vizualizaciju i mjerenje dužine telomernih ponavljanja).Glavna prednost je brža metoda (analiza/sortiranje velikog broja ćelija/hromozoma). Široko se koristi za proučavanje različitih problema: starenje, očuvanje telomera, proučavanje suspenzija hematopoetskih matičnih stanica ex vivo, proučavanje bakterija.

Multiparametrijska analiza omogućava diferencijaciju tipova ćelija unutar jednog uzorka, omogućavajući internu kontrolu i analizu podtipova leukocita.

Prednosti flow-FISH: Lako ponovljivi rezultati Sposobnost analize podgrupa ćelija u populaciji koristeći fizičku imunofluorescenciju i markere Bolje performanse od Q-FISH Sposobnost kvantifikacije fluorescencije hiljada ćelija.

ISTRAŽIVANJE IZOLOVANIH HROMOSOMA PROTOČNOM CITOMETRIJOM 1. Sortiranje hromozoma protočnom citometrijom - Kariotipizacija protočnom citometrijom se koristi za dalje mapiranje gena i izgradnju hromozomskih biblioteka. - Identifikacija i lokalizacija gena na sortiranim hromozomima se vrši uz naknadnu upotrebu FISH metoda / PRINS metode (primed in situ labeling) ili njenih varijacija i hromozom-specifičnog PCR-a. - Do 2011. do sada su uspješno sortirani samo hromozomi 17 vrsta gajenih biljaka. - Razvrstavanje metafaznih ili pahitenskih hromozoma sa visokim indeksom diobe.

Fluorescentna oznaka: - Hromozomi su označeni fluorohromima specifičnim za nukleinske kiseline. - Fluorohromi se biraju u skladu sa 1) specifičnošću za azotne baze, 2) eksperimentalnim uslovima (uključujući i uzimanje u obzir talasnih dužina dostupnih lasera). 1. Za monovarijantnu analizu koristite boje koje nisu specifične za A-T ili G-C parove: propidijum jodid (pik ekscitacije: 535 nm, emisija: 617 nm, potreban laser: 488 nm argonski laser ili lampa + dugoprolazni filter) etidij bromid (pobuda vrhovi: : 300 i 520 nm, emisije: 600 nm, potreban laser: 488 nm argonski laser ili lampa + dugopropusni filter) Ove oznake boje DNK bez obzira na sadržaj A, G, T ili azotnih baza. 2. Za bivarijantnu analizu koristite: hromomicin (specifičan za G-C bazne parove), ekscitacija pika A 3: 458 nm, emisija 580 nm. Laser: 458 nm minimalno 400 m. V snaga. Hoechst 33258 (specifičan za A-T bp), ekscitacija: 351-364 nm, emisija: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (snažan). Laseri moraju biti odvojeni u vremenu i prostoru zbog djelomičnog preklapanja spektra fluorohroma.

2. Proučavanje hromozoma/nukleotidnih sekvenci nakon sortiranja (za pravljenje fizičkih i genetskih mapa, itd.) RIBA BAC-FISH PRINS C-PRINS Studija velikih genoma sa dugim hromozomima. Mapiranje sekvenci sa velikim brojem ponavljanja (npr. telomerni i centromerni regioni). Upotreba kratkih sondi. Zbog velikog broja ponavljanja signal je jak. Standardna veličina sonde: 15 - 30 nukleotida. RIBA

Problemi sa RIBAMA: Teško je lokalizirati sekvence DNK sa jednim lokusom (tj. neponovljene jedinstvene DNK sekvence) jer će signal biti vrlo slab kada se koriste standardne kratke sonde. Povećanje dužine sonde na nekoliko kilobaza radi poboljšanja signala će rezultirati smanjenom osjetljivošću i => nespecifičnim vezivanjem. Rješenje: BAC-FISH -BAC-FISH je kombinacija FISH metode i upotrebe genomskih DNK klonova integriranih u bakterijske umjetne hromozome (BAC), omogućavajući umetanje velikih sekvenci DNK. - Efikasna metoda za identifikaciju i mapiranje pojedinačnih hromozoma organizama sa malim genomima. BAC sonde, overgos (oligonukleotidi koji se preklapaju) se koriste kao sonde.

Alternativa FISH: PRINS PRINS (primed in situ označavanje) je metoda označavanja hromozoma žarenjem oligonukleotidnog DNK prajmera sa homolognom sekvencom denaturisane hromozomske DNK i naknadnim enzimskim proširenjem prajmera in situ sa obeleženim nukleotidima. Prvi put opisali Koch et al. 1989. (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N., i Bolund, I. (1989) Metode oligonukleotidnog prajminga za hromozom-specifično označavanje alfa satelitske DNK in situ. Hromosom 259 98 –265). PRINS je alternativa FISH-u. Koristi se za lokalizaciju nukleotidnih sekvenci, prepoznavanje i brojanje metafaznih ili interfaznih hromozoma ili parova hromozoma (uključujući hromozomsku aneuploidiju). žarenje neobilježenog prajmera (primer-primer) sa DNK od interesa; elongacija prajmera uz pomoć termostabilne DNK polimeraze i označenih nukleotida; završetak reakcije (vezivanje blokirajuće molekule na 3'-kraj) Primer : PCR restrikcijski fragment - indirektno (biotin/dig fluorohrom-konjugovani avidin/ anti-dig) - Samo jedan par homolognih hromozoma (jedan hromozom) može biti identifikovan u rezultatima svake PRINS reakcije. Sljedeća PRINS reakcija na istom slajdu može se izvesti samo nakon blokiranja prethodne. - Koristi se za DNK sekvence sa velikim brojem ponavljanja.

Prednosti PRINS-a: 1. Zahteva minimalne informacije o sekvenci potrebne za sintezu oligonukleotidnog prajmera. 2. Najbrži i najjednostavniji metod za detekciju sekvence od interesa na hromozomu (u poređenju sa upotrebom teških FISH sondi koje se hibridizuju tokom veoma dugog vremenskog perioda). 3. Isključivanje koraka označavanja sonde. 4. Sposobnost produživanja prajmera sa obeleženim nukleotidima radi poboljšanja c-PRINS signala prilikom detekcije kratkih jedinstvenih sekvenci. Za identifikaciju ponavljanja s malom količinom kopija ili kratkih jedinstvenih sekvenci koristi se osjetljivija metoda - ciklični PRINS (c-PRINS). C-PRINS su predložili Gosden et al. 1991. godine, poboljšani široko korišćeni protokol Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Lokalizacija DNK sekvenci na biljnim hromozomima pomoću PRINS-a i C-PRINS-a. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS uključuje niz termičkih ciklusa sličnih PCR-u.

Tečnost omotača za RIBE: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Protočna citometrija i FISH za mjerenje prosječne dužine telomera (flow FISH). 2006. Protokoli prirode 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Protočno sortiranje mitotičkih hromozoma u obične pšenice (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -M . Dakle 4 pufera bez ditiotreitola (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Kromosomi sortirani protokom: fini materijal za fizičko mapiranje biljnih gena. Caryologia. 2006, vol. 59, br. 2: 99-103 ) -autoklavirano 0,1% (wt/vol) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Čihalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Sortiranje hromozoma u tetraploidnoj pšenici i njen potencijal za analizu genoma. Genetika, 1705. (2005.) 823–829) - Poliaminski pufer koji stabilizira hromozome (tečnost omotača koja sadrži proteine) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2. izdanje, dio B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994.)

Fluorescentna in situ hibridizacija

Fluorescentna hibridizacija in situ , ili FISH metoda (eng. Fluorescencija in situ hibridizacija - RIBA ) - citogenetska metoda koja se koristi za otkrivanje i određivanje položaja specifične DNK sekvence na metafaznim hromozomima ili u interfaznim jezgrama in situ. Osim toga, FISH se koristi za otkrivanje specifičnih mRNA u uzorku tkiva. U potonjem slučaju, FISH metoda omogućava utvrđivanje prostorno-vremenskih karakteristika ekspresije gena u ćelijama i tkivima.

Sonde

Sa fluorescentnom hibridizacijom in situ koristite DNK sonde (DNK sonde) koje se vezuju za komplementarne mete u uzorku. DNK sonde sadrže nukleozide označene fluoroforima (direktno obilježavanje) ili konjugate kao što su biotin ili digoksigenin (indirektno obilježavanje). Sa direktnim obeležavanjem, DNK sonda vezana za metu može se posmatrati pomoću fluorescentnog mikroskopa odmah nakon završetka hibridizacije. U slučaju indirektnog obeležavanja, potrebna je dodatna procedura bojenja, tokom koje se detektuje biotin pomoću fluorescentno obeleženog avidina ili stepavidina, a digoksigenin korišćenjem fluorescentno obeleženih antitela. Iako indirektna verzija obeležavanja DNK uzoraka zahteva dodatne reagense i vreme, ova metoda obično postiže viši nivo signala zbog prisustva 3-4 fluorohroma molekula na antitelu ili molekulu avidina. Osim toga, u slučaju indirektnog označavanja moguće je kaskadno pojačanje signala.

Za kreiranje uzoraka DNK koriste se klonirane DNK sekvence, genomska DNK, produkti PCR reakcije, obilježeni oligonukleotidi i DNK dobivena mikrodisekcijom.

Obeležavanje sonde se može izvesti na različite načine, na primer, nick-translacijom ili PCR-om sa obeleženim nukleotidima.

Postupak hibridizacije

Šema eksperimenta fluorescentne hibridizacije in situ kako bi se lokalizirao položaj gena u jezgru

Prvi korak je dizajn sondi. Veličina sonde treba biti dovoljno velika da se hibridizacija dogodi na određenom mjestu, ali ne prevelika (ne više od 1 kb) kako ne bi ometala proces hibridizacije. Prilikom identifikacije specifičnih lokusa ili kod bojenja cijelih hromozoma, potrebno je blokirati hibridizaciju DNK sondi s nejedinstvenim repetitivnim sekvencama DNK dodavanjem neobilježenih DNK ponavljanja (na primjer, Cot-1 DNK) hibridizacionoj smjesi. Ako je DNK sonda dvolančana DNK, ona mora biti denaturirana prije hibridizacije.

U sljedećoj fazi pripremaju se preparati interfaznih jezgara ili metafaznih hromozoma. Ćelije se fiksiraju na podlogu, obično na stakalcu, nakon čega slijedi denaturacija DNK. Da bi se očuvala morfologija hromozoma ili jezgara, denaturacija se provodi u prisustvu formamida, što omogućava smanjenje temperature denaturacije na 70°.

Vizualizacija vezanih DNK sondi se izvodi pomoću fluorescentnog mikroskopa. Intenzitet fluorescentnog signala zavisi od mnogih faktora - efikasnosti obeležavanja sonde, tipa sonde i vrste fluorescentne boje.

Književnost

Rubcov N.B. Metode rada sa hromozomima sisara: Proc. dodatak / Novosib. stanje un-t. Novosibirsk, 2006. 152 str.

Rubcov N.B. Hibridizacija nukleinskih kiselina in situ u analizi hromozomskih abnormalnosti. Poglavlje u knjizi "Uvod u molekularnu dijagnostiku" tom 2. "Molekularno genetičke metode u dijagnostici nasljednih i onkoloških bolesti" / Ed. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaev. Obrazovna literatura za studente medicinskih univerziteta. M.: Medicina, 2011. T. 2. S. 100–136.

Bilješke

Wikimedia fondacija. 2010 .

Pogledajte šta je "Fluorescentna in situ hibridizacija" u drugim rječnicima:

Ovaj izraz ima druga značenja, vidi hibridizacija. DNK hibridizacija, hibridizacija nukleinskih kiselina in vitro kombinacija komplementarnih jednolančanih nukleinskih kiselina u jednu molekulu. Sa potpunom komplementarnošću ... ... Wikipedia

Metoda određivanja fluorescentna in situ hibridizacija.

Materijal koji se proučava Vidi u opisu

Mogućnost kućne posjete

Studija se koristi za odabir individualne adjuvantne kemoterapije za rak dojke ili rak želuca.

Rak dojke (BC) zauzima prvo mjesto među onkološkim bolestima kod žena. Ćelije tumora dojke mogu sadržavati različite vrste receptora koji su osjetljivi na određene tvari (hormone ili druge biološki aktivne molekule). U zavisnosti od prisustva hormonskih receptora (estrogena i progesterona) ili receptora humanog epidermalnog faktora rasta tipa 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2) u tumorskim ćelijama, izoluju se hormonski-receptorski, HER2-pozitivni i trostruko negativni karcinom dojke. . Ovo je važno uzeti u obzir pri individualnom odabiru terapije i za predviđanje uspjeha liječenja.

HER2 je receptor koji je prisutan u tkivima i normalno, učestvuje u regulaciji diobe i diferencijacije ćelija. Njegov višak na površini tumorskih ćelija (hiperekspresija) određuje brzi nekontrolisani rast neoplazme, visok rizik od metastaza i nisku efikasnost nekih vrsta lečenja. Hiperekspresija HER2 kod nekih podtipova raka dojke dovodi do povećane proliferacije i angiogeneze, kao i do disregulacije apoptoze (genetski programirano samouništenje ćelija). Trenutno postoje lijekovi koji ciljaju na HER2 receptor. To je posebno Herceptin (trastuzumab), koji je monoklonsko antitijelo protiv HER2/neu receptora.

Amplifikacija i prekomjerna ekspresija onkogena HER2 (ErbB-2) su relativno specifični događaji za karcinom dojke i praktično se ne javljaju kod tumora drugih lokalizacija. Rak želuca (GC) je jedan od rijetkih izuzetaka: aktivacija HER2 je zabilježena u otprilike 10-15% slučajeva malignih neoplazmi ovog organa i korelira s agresivnim tokom bolesti. Kod HER2-pozitivnog karcinoma dojke, višak HER2 receptora može biti prisutan na površini tumorskih ćelija (koji se nazivaju HER2 pozitivni ili Hercept pozitivni). Ovaj fenomen se opaža kod 15-20% žena koje boluju od raka dojke. Procjena HER2 statusa je važna za određivanje taktike liječenja.

Glavne standardizovane metode za otkrivanje prekomerne ekspresije HER2/neu i/ili amplifikacije HER2/neu gena su imunohistohemijska (IHC) metoda i fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). Obje studije se izvode na histološkim preparatima (odsječci tumorskog materijala ugrađeni u parafin) korištenjem poliklonskih antitijela (IHC), fluorescentnih sondi (FISH) i različitih sistema za snimanje.

Prilikom procjene rezultata IHC reakcije, ekspresija se uzima u obzir samo u invazivnoj komponenti tumora. Rezultati reakcije se ocjenjuju pomoću bodovne skale: 0, 1+, 2+, 3+, koju je razvio proizvođač testa i odobrili stručnjaci. Hercept status, ocijenjen kao 0 i 1+, treba smatrati negativnim - nema prekomjerne ekspresije proteina, što je u korelaciji s odsustvom amplifikacije njegovog gena. Hercept status, ocijenjen kao 3+, je pozitivan, odnosno prisutna je prekomjerna ekspresija proteina, što je u korelaciji sa prisustvom amplifikacije gena. Hercept status 2+ smatra se neodređenim, tj. ekspresija proteina određena na osnovu imunohistohemijske reakcije ne može se pouzdano suditi o amplifikaciji gena, stoga je potrebna studija koja direktno otkriva prisustvo ili odsustvo amplifikacije. FISH metoda se koristi na rezovima iz istog uzorka (bloka) na kojem je rađena imunohistohemijska studija. U FISH hibridizaciji, prisustvo amplifikacije HER2 gena se procjenjuje prebrojavanjem omjera crvenih fluorescentnih (koje odgovaraju obilježenim HER2 genima) i zelenih fluorescentnih signala koji obilježavaju centromernu regiju 17. hromozoma. Omjer veći od 2 ukazuje na prisustvo HER2 amplifikacije. FISH metoda je osjetljivija od IHC, jer omogućava direktnu procjenu prisustva ili odsustva amplifikacije.

Materijal za istraživanje: parafinski blok sa biopsijom tumora.

Pažnja! OBAVEZNO:

stakleni predmet sa IHC bojenjem sa antitelima na HER2/neu
uputnica od ljekara ili izvod sa rezultatima histološke i IHC studije s antitijelima na Her-2/neu

Književnost

Zavalishina L.E., Frank G.A. Morfološka studija HER2 statusa. Metodologija i atlas. - M.: Ed. Media Medica. 2006:98.
Maligne bolesti u Rusiji 2011. (morbiditet i mortalitet). Ed. IN AND. Chissova, V.V. Starinski, G.V. Petrova. - M.: FGBU „MNIOI im. P.A. Herzen" Ministarstva zdravlja Rusije. 2013:289.
Onkologija. Kliničke smjernice. Udruženje onkologa Rusije. Ed. IN AND. Chissova, S.L. Daryalova. - M.: Ed. "GEOTAR-Media". 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. et al. Trastuzumab u kombinaciji s kemoterapijom u odnosu na samo kemoterapiju za liječenje HER2-pozitivnog uznapredovalog karcinoma želuca ili gastroezofagealnog spoja (ToGA): faza 3, otvoreno, randomizirano kontrolirano ispitivanje. Lancet. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Dijagnostička imunohistohemija: Theranostic and Genomic Applications. Elsevier, 4. izdanje. 2013:960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Incidencija i smrtnost od raka širom svijeta: IARC baza za rak br. 10. Lyon, Francuska: Međunarodna agencija za istraživanje raka; 2010. Dostupno na: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. Izdvajamo sa sastanka: Međunarodni konsenzus stručnjaka o primarnoj terapiji ranog raka dojke 2005. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. Klasifikacija tumora ženskih reproduktivnih organa SZO. WHO Press, 4. izdanje. 2014;4:316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. et al. Her2/neu amplifikacija je nezavisni prognostički faktor u karcinomu želuca. Probavne bolesti i nauke. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D. et al. Adjuvans Trastuzumab u HER2-pozitivnom karcinomu dojke. The New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.