Флуоресцентна in situ хибридизация. Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH)

В някои случаи цитогенетичното изследване не е достатъчно, за да се направи заключение за кариотипа, в тези случаи се използват молекулярно-цитогенетични методи, по-специално флуоресцентна in situ хибридизация (на английски - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).

Появата на нови технологии на молекулярната цитогенетика, базирани главно на in situ хибридизация на нуклеинови киселини, значително разшири възможностите на хромозомната диагностика. Методът на хибридизация in situ е разработен за локализиране на специфични ДНК последователности директно върху цитологични препарати. Има преход в идентифицирането на хромозоми и хромозомни области от анализа на цитологичната организация на хромозомата към анализа на ДНК последователностите, които ги съставят. Сравнението на ефективността на класическите цитологични методи за откриване и анализиране на хромозомни пренареждания, като диференциално оцветяване на хромозоми, със съвременните молекулярни цитогенетични технологии показа, че при хематологични нарушения цитологичният анализ на хромозомите открива и идентифицира правилно само около една трета от повторно открити хромозомни диапазони спектрално кариотипиране (SKY). Около една трета от пренарежданията се идентифицират неправилно чрез цитологични методи, а една трета остава напълно незабелязана. Класическите методи на цитогенетичен анализ позволяват да се открият само около 15% от хромозомните пренареждания, идентифицирани от SKY.

Методът FISH използва флуоресцентни молекули за оцветяване на гени или хромозоми in vivo. Методът се използва за генно картиране и идентифициране на хромозомни аберации.

Техниката започва с подготовката на къси ДНК последователности, наречени сонди, които са комплементарни на ДНК последователностите, които представляват обекта на изследване. Пробите хибридизират (свързват се) с комплементарни ДНК региони и поради факта, че са маркирани с флуоресцентен етикет, ви позволяват да видите локализацията на интересните гени в ДНК или хромозомите. За разлика от други методи за изследване на хромозоми, които изискват активно клетъчно делене, FISH може да се извърши върху неделящи се клетки, което прави метода гъвкав.

FISH може да се прилага за различни цели с помощта на три различни типа сонди:

* локус-специфични сонди, които се свързват с определени части на хромозомите. Тези сонди се използват за идентифициране на наличната къса последователност от изолирана ДНК, която се използва за приготвяне на белязана сонда и нейната последваща хибридизация с набор от хромозоми;
* Пробите за алфа или центромерни повторения са повтарящи се последователности от центромерни области на хромозоми. С тяхна помощ всяка хромозома може да бъде боядисана в различен цвят, което ви позволява бързо да определите броя на хромозомите и отклоненията от нормалния им брой;
* Сондите за цялата хромозома са набор от малки сонди, които са комплементарни към отделните участъци от хромозомата, но като цяло покриват цялата й дължина. Използвайки библиотека от такива сонди, човек може да "оцвети" цялата хромозома и да получи диференциален спектрален кариотип на индивид. Този тип анализ се използва за анализ на хромозомни аберации, като транслокации, когато част от една хромозома се прехвърля в ръката на друга.

Флуоресцентно-маркирана in situ хибридизация (FISH)

Материалът за изследването е кръв, костен мозък, туморна биопсия, плацента, фетални тъкани или околоплодна течност. Пробите за анализ трябва да се доставят пресни в лабораторията. Препаратите (предметни стъкла) се приготвят директно от тъканни проби или след тяхното култивиране. Могат да се използват както метафазни, така и интерфазни клетъчни препарати. Специфични ДНК сонди, белязани с флуоресцентни етикети, хибридизират с хромозомна ДНК и множество сонди могат да се използват едновременно в различни локуси.

FISH е полезен и чувствителен метод за цитогенетичен анализ при откриване на количествени и качествени хромозомни аберации като делеции (включително микроделеции), транслокации, удвояване и анеуплоидия. FISH върху интерфазни хромозоми е бърз метод за пренатална диагностика на тризомия 21, 18 или 13 или аберации на половите хромозоми. В онкологията FISH може да открие редица транслокации (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), свързани с хематологични злокачествени заболявания. Методът може да се използва и за проследяване на остатъчните ефекти от рак след химиотерапия и трансплантация на костен мозък и за откриване на повишени онкогени (c-myc/n-myc), свързани с лоша прогноза за някои тумори. FISH се използва и за наблюдение на оцеляването на алографт на костен мозък, получен от индивид от противоположния пол.

FISH е чувствителен метод за идентифициране на хромозомни аберации и за бърз анализ на голям (> 500) брой клетки наведнъж. Методът е много точен при идентифициране на природата на хромозомите и неизвестни фрагменти от хромозомна ДНК.

Традиционна цитогенетикапри изучаване на кариотипа той винаги е бил ограничен от нивото на разделителна способност на лентата. Дори при диференциално оцветяване с висока разделителна способност на хромозоми, ние открихме само повече ленти на хромозома, но не бяхме сигурни, че стигаме до молекулярното ниво на разделителна способност. Последните постижения в ДНК технологията и цитогенетиката направиха възможно използването на FISH методи за анализиране на промените в хромозомната ДНК на молекулярно ниво. Молекулярната цитогенетика осигури революционен пробив в цитогенетиката, позволявайки:

Да анализира ДНК структурата на хромозомите в диапазона от 10-100 килобази;
за диагностициране на неделящи се интерфазни клетки, които имат огромно влияние върху пренаталната диагностика и предимплантационна генетична диагностика (PGD).

Технология FISHизползва ДНК сонда, която свързва или ренатурира специфични ДНК последователности в рамките на хромозома. Денатурираната сонда се инкубира с нативна клетъчна ДНК, също денатурирана до едноверижно състояние. Сондата замества биотин дезоксиуридин трифосфат или дигоксигенин уридин трифосфат с тимидин. След ренатуриране на нативната ДНК от сондата, комплексът проба-ДНК може да бъде открит чрез добавяне на белязан с флуорохром биотин-свързващ авидин или белязан с флуорохром антидигоксигенин. Допълнително усилване на сигнала може да се получи чрез добавяне на антиавидин и изследване на получения комплекс с помощта на флуоресцентна микроскопия. Чрез етикетиране на различни ДНК сонди с няколко различни флуорохрома, няколко хромозоми или хромозомни сегмента в една клетка могат да бъдат визуализирани едновременно като многоцветни сигнали.

Способност за дефиниране специфични генни сегменти, присъстващи или отсъстващи в хромозомите, направи възможно диагностицирането на синдроми на генни последователности на ниво ДНК, както и транслокации в интерфазни ядра, често в отделни клетки.

материал за РИБАмогат да служат или метафазни хромозоми, получени от делящи се клетки, или интерфазни ядра от клетки, които не са в етап на делене. Секциите са предварително третирани с РНКаза и протеиназа за отстраняване на РНК, която може да се хибридизира със сондата и хроматина. След това те се нагряват във формамид за денатуриране на ДНК и се фиксират с ледено студен алкохол. След това сондата се подготвя за хибридизация чрез нагряване. След това, сондата и хромозомният препарат се смесват и се запечатват с покривно стъкло при 37 °C за хибридизация. Чрез промяна на температурата на инкубация или състава на солта на хибридизационния разтвор, специфичността на свързване може да се увеличи и фоновото маркиране може да бъде намалено.

Приложение на флуоресцентна in situ хибридизация - FISH технология

Ефективността на технологията FISHбеше демонстрирано за първи път чрез локализиране на гени към . С въвеждането на метода за флуоресцентно маркиране, in situ хибридизацията стана незаменима за диагностицирането на хромозомни аномалии, които не се откриват чрез традиционните методи за лентовост. FISH също изигра ключова роля в едно от най-необикновените открития в съвременната генетика, геномното отпечатване.

Технологията на неговото развитие РИБАполучава се в три форми. Центромерните или алфа-сателитните сонди се характеризират с относителна хромозомна специфичност; те са били използвани най-често в генетиката на интерфазните клетки. Тези сонди генерират донякъде дифузни сигнали с достатъчна сила в областта на центромера, но не се хибридизират с хромозоми, имащи подобни центромерни последователности. Понастоящем са разработени сонди с едно копие, които дават дискретен сигнал от специфична хромозомна лента и позволяват избягване на феномена на кръстосана хибридизация. Тези сонди могат да се използват и за определяне на броя на копията и специфични хромозомни региони, за които се предполага, че са свързани с определен синдром. Единично копие и центромерни сонди, предназначени за хромозоми 13, 18, 21, X и Y, се използват за пренатална диагностика.

Възможно е също така да се "оцветят" цели хромозоми с РИБА. Благодарение на технологията за спектрално кариотипиране, която използва смес от различни флуорохроми, сега е възможно да се създаде уникален флуоресцентен модел за всяка отделна хромозома с 24 индивидуални цвята. Тази технология дава възможност да се определят сложни хромозомни пренареждания, които не се виждат с помощта на традиционните цитогенетични техники.

Метод РИБАпри пренатална диагностика. За жените в по-възрастна репродуктивна възраст бременността може да бъде причина не толкова за радост, колкото за безпокойство. С възрастта на жената се свързва рискът от развитие на хромозомни аномалии на плода. Амниоцентезата, извършена на 16-та седмица от бременността, последвана от анализ на кариотипа, отнема 10-14 дни. Използването на FISH при предварителен преглед позволява по-бърза диагноза и намалено време на изчакване. Повечето генетици и лаборатории са на мнение, че методът FISH не трябва да се използва изолирано за вземане на решения относно бъдещото управление на бременността. Методът FISH трябва да бъде допълнен с кариотипен анализ, като резултатите му трябва поне да корелират с патологичната картина на ултразвук (ултразвук) или биохимичен скрининг на кръвта на майката.

Синдроми на гените последователностиизвестни също като микроделеционни синдроми или сегментарна анеузомия. Това са делеции на съседни фрагменти от хромозома, обикновено включващи много гени. Синдромите на генната последователност са описани за първи път през 1986 г. с помощта на класически цитогенетични техники. Сега, благодарение на FISH, е възможно да се идентифицират субмикроскопични делеции на ниво ДНК, което направи възможно идентифицирането на най-малкия изтрит регион, свързан с развитието на конкретен синдром, наречен критична област. След като се идентифицира критичната област за синдрома, често е възможно да се идентифицират специфични гени, чието отсъствие се счита за свързано със синдрома. Скорошно ръководство за синдроми на генна последователност съобщава за 18 синдрома на делеция и микроделеция, свързани с 14 хромозоми. Някои от най-често срещаните синдроми на генната последователност и техните клинични прояви са показани в табл. 5-2.

теломери- образувания, които покриват краищата на дългите и късите рамена на хромозомите. Те се състоят от повтарящи се TTAGGG последователности и предотвратяват сливането на краищата на хромозомите. Теломерните сонди играят важна роля в разпознаването на сложни транслокации, които не могат да бъдат определени чрез традиционни цитогенетични методи. В допълнение, едно от откритията на проекта за човешкия геном е фактът, че регионите на хромозомите, съседни на теломерите, са богати на гени. Сега е доказано, че субмикроскопичните субтеломерни делеции са отговорни за появата на много генетично обусловени заболявания.

In situ хибридизация на нуклеинови киселини Методът се основава на възможността за образуване на двуверижни хибриди между белязани сонди, изкуствено създадени на базата на едноверижни последователности (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидни) и последователности, комплементарни към тях в мишени - анализирани ДНК или РНК молекули. За идентифициране на местата на хибридизация, ДНК сонда (ДНК сонда) се маркира с репортерна група: ü радиоактивен изотоп, ü флуорохром, ü ензим, който дава петно или луминесцентен продукт, ü хаптен, с който се свързва белязаното тяло, и т.н.

Чрез откриване на хибрид поради наличието на репортерна група в сондата, е възможно - да се оцени броят на гените, кодиращи определен тип РНК, - да се определи дела на нетранскрибирана ДНК в генома, - да се установи връзката на определени гени един с друг - и тяхното точно местоположение в хромозомите. Методът на молекулярна хибридизация има висока чувствителност (малко количество белязана сонда (10 -15 и 10 -19 M) и съответно може да бъде открита нейната комплементарна последователност в целта) и скорост на анализ, което позволява използването на този метод както за изследване дейности и за диагностика на наследствени и инфекциозни болести в медицината, ветеринарната медицина и растениевъдството.

Интерфазна цитогенетика: 1. Многоцветни хромозомни ленти (MCB). 2. Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). 3. Комбинация на FISH с други методи: -цитология + FISH; -хистология + РИБИ; -имунофенотипиране + РИБИ (ФИКТАЦИЯ); Метафазна цитогенетика: 1. Твърдо оцветяване на хромозоми (Цяла картина). 2. Сравнителна геномна хибридизация (CGH). 3. Кариотипиране с промяна на цвета (CCK). 4. Многоцветно кариотипиране: Спектрално кариотипиране (SKY); многоцветни РИБИ (M - FISH, M - BAND).

FISH - флуоресцентна in situ хибридизация - е цитогенетичен метод, използван за откриване и локализиране на специфични ДНК последователности върху хромозоми, иРНК и др. Техниката се основава на хибридизацията на флуоресцентно белязана ДНК/РНК сонда с комплементарна ДНК/РНК последователност. Етикетът се открива с помощта на флуоресцентен микроскоп. Методът FISH е въведен преди повече от 30 години. Той стана широко разпространен като метод за физическо картографиране на гени върху хромозоми. По-късно се прилага и в други области на изследвания (в областта на клиничната генетика, репродуктивната медицина, токсикологията, еволюционната биология, сравнителната и клетъчна геномика и хромозомната биология). В момента FISH се използва основно за изграждане на физически и генетични карти на хромозоми, за откриване на структурни пренареждания, транслокации, микроделеции, генни амплификации в интерфазни и метафазни хромозоми. В резултат на напредъка в науката (по-добро разбиране на химичните и физичните свойства на нуклеиновите киселини и хроматина), както и развитието на флуоресцентната микроскопия и дигиталните изображения, методът непрекъснато се усъвършенства (подобрения в чувствителността, специфичността, разделителната способност) и са разработени много вариации на този метод.

1) Клетките се пускат върху предметно стъкло, което води до разпространение на хромозомите. 4) Хромозомите се оцветяват с помощта на DAPI 2) Флуоресцентно маркирана сонда се поставя върху хромозомите и се запечатва. 3) Сондата и хромозомите се денатурират, хибридизират и след това се промиват 5) Слайдът се разглежда под флуоресцентен микроскоп

Общият изглед на протокола за настройка на FISH може да бъде представен по следния начин: 1. Изготвяне на хистологична или цитологична проба. Приготвянето на хистологичен препарат се извършва по стандартната схема: изрязване, маркиране, окабеляване, изливане, микротомия, поставяне на разреза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаяващи разтвори и центрофугиране, което прави възможно получаването на концентрирана клетъчна суспензия. 2. Предварителна обработка (ако е необходимо). Препаратът се обработва от протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които пречат на хибридизацията. 3. Прилагане на ДНК сонда върху препарата и последваща денатурация. За да се денатурират пробата и ДНК на пробата, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-900 С.

4. Хибридизация. След денатурация лекарството се охлажда до определена температура (370 С в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем автоматичните хибридизатори се използват за денатурация и хибридизация. 5. Измиване. След като хибридизацията приключи, несвързаните сонди трябва да бъдат измити, което иначе би създало фон, който затруднява оценката на резултатите от FISH. За промиване обикновено се използва разтвор, съдържащ цитрат и натриев хлорид (SSC). 6. Противно оцветяване. С помощта на флуоресцентни багрила (DAPI - 4, 6-диамидин-2 фенилиндол; пропидиев йодид) се оцветява цялата ядрена ДНК. 7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафиниране, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

Изследване на теломерни области с помощта на флуоресцентен микроскоп. Изображенията, получени на етапа на интерфаза (ядро) и метафаза (отделни хромозоми), се комбинират. син цвят - DAPI.

Предимства на FISH-метода: 1. Възможност за изследване на генетичен материал в интерфазни ядра; 2. Получаването на обективни резултати на база да/не е количествен метод 3. Сравнително проста интерпретация на резултатите висока разделителна способност Недостатъци на метода FISH: 1. Флуоресцентните багрила бързо „избледняват“ микроскоп.

Методът FISH се основава на реакцията на хибридизация между ДНК сонда, създадена по специални технологии, която представлява нуклеотидна последователност с ограничен размер, и комплементарна секция от ядрената ДНК на изследвания цитогенетичен препарат. ДНК сондата е основният елемент за създаване на FISH и носи "етикет", т.е. съдържа нуклеотиди, които са директно свързани с флуорохром или хаптен за по-нататъшна визуализация от антитела, носещи флуорохром. Несвързаната белязана ДНК се отмива и след това хибридизираната ДНК проба се открива с помощта на флуоресцентен микроскоп.

ДНК етикетирането се разделя на пряко и непряко. Директното етикетиране въвежда репортерни елементи в ДНК - флуорохроми (родамин, диетиламинокумарин, тексаско червено и др.). Метод на индиректно маркиране - ДНК проба се конюгира предварително с междинни лиганди (биотин, диоксигенин, 2, 4-динитрофенол), чието присъствие върху цитологичен препарат след това се открива с помощта на флуорохроми. В този случай чувствителността на метода се увеличава значително, тъй като лигандът може да съдържа няколко места на взаимодействие с флуорохрома. In situ хибридизация с 32 P-белязана сонда е описана за първи път през 1969 г. Разработването на нерадиоактивни системи за маркиране и откриване на ДНК сонди направи метода на хибридизация in situ безопасен, лесен за изпълнение и по-малко трудоемък при обработката на резултатите. Флуоресцентните багрила са меки и лесни за използване, могат да се съхраняват за неопределено време, дават висока разделителна способност и позволяват едновременно изследване на множество ДНК последователности.

Сонди: едноверижни/двуверижни ДНК/РНК първични/вторично белязани сонди. Пробите се маркират: 1) директно: чрез вмъкване на нуклеотиди, към които е прикрепен флуорохром (PCR или ник транслация) 2) чрез репортерна молекула (напр. дигоксигенин, биотин), към която са прикрепени флуоресцентно белязани антитела. За да подобрите сигнала, можете да използвате вторични, третични и т.н. антитела, белязани с флуоресцентен етикет. ДНКаза прорязва ДНК Nick Translation ДНК полимераза I добавя нови нуклеотиди към 3' хидроксил ДНК полимераза I премахва отделни бази от 5' крайната хромозомна образна картина: като се използва DAPI (2 mg/ml). 4',6-диамидино-2-фенилиндол; силно свързване към богати на A-T ДНК региони; възбуждане с UV светлина; емисия 461 nm (синьо).

Понастоящем има няколко основни подхода, които се използват широко от съвременната молекулярна цитогенетика: Идентифициране на материала на разширени хромозомни региони и цели хромозоми. Откриване в областта на интерес на специфична ДНК последователност. Анализ на дисбаланса на отделните хромозомни области. За идентифициране на материала на разширени хромозомни региони и цели хромозоми широко се използват хромозомно-специфични и специфични за региона ДНК сонди („проби за рисуване“).

Характеристики на различните видове сонди 1. Локус-специфични сонди (LSI - локус - специфични идентификатори, които се свързват с определени области на хромозомите.) Тези сонди се използват за идентифициране на наличната къса (неповтаряща се) последователност от изолирана ДНК, която се използва за приготвяне на белязана сонда и нейната последваща хибридизация с набор от хромозоми. Те са предназначени да откриват диагностично и прогностично значими хромозомни аберации при различни патологични състояния (монозомия и тризомия за отделни хромозоми). Най-широко разпространеното използване на тези проби е получено в пренаталната цитогенетична диагностика, особено при изследванията на клетките на хорионната тъкан и интерфазните ядра на амниоцитите.

2. ДНК сонди към теломерни участъци на хромозомите (TEL telomericprobe) са предназначени да откриват делеции и пренареждания, засягащи крайните участъци на хромозомните рамена. Такива сонди са специфични за p- или q-рамена на хромозомите и са комплементарни към област с дължина около 300 kb. от края на хромозомата. По правило ДНК сондите за къси и дълги рамена на хромозоми са свързани с различни флуорохроми, което прави възможно откриването на двата теломерни области на хромозомата на един цитогенетичен препарат.

3. Центромерни повторни сонди, алфа или хромозомни числители (CEP - centromere. Enumeration. Probe) са специфични за хромозомите ДНК сонди, представени от последователности от тандемни алфа и бета сателитни повторения. Тези повторения са локализирани предимно в центромерните или перицентромерните хетерохроматинови области на хромозомите. С тяхна помощ всяка хромозома може да бъде боядисана в различен цвят, което ви позволява бързо да определите броя на хромозомите и отклоненията от нормалния им брой, допълващи отделните участъци на хромозомата, но като цяло покриващи цялата й дължина. Използвайки библиотека от такива сонди, човек може да "оцвети" цялата хромозома и да получи диференциален спектрален кариотип на индивид. Този тип анализ се използва за анализ на хромозомни аберации, като транслокации, когато част от една хромозома се прехвърля в ръката на друга.

Приложения FISH се използва широко за решаване на следните клинични диагностични задачи: 1. Перимплантация пренатална и диагностика на хромозомни аномалии. Използва се в клиники за ин витро оплождане (IVF) и перинатални центрове. Позволява своевременно (преди имплантиране на ембриона в случай на IVF или в ранните етапи на развитие на плода) да се идентифицират генетични нарушения в нероденото дете и да се вземат необходимите мерки. 2. Онкохематология. Онкохематологичните заболявания възникват в резултат на различни хромозомни аберации, поради което за тяхната диагностика се използват подходящи CEP и LSI сонди. 3. Диагностика на солидни тумори. В момента се установяват все повече и повече причинно-следствени връзки между развитието на специфични ракови заболявания и специфични промени в генома. Следователно, когато се използват подходящи ДНК сонди, е възможно да се извърши онкологична FISH диагностика.

Интерфазна цитогенетика: Комбинация на FISH с други методи: - Имунофенотипиране на FISH (FICTION); + ФИКЦИЯ (Флуоресцентно имунофенотипиране и интерфазна цитогенетика като инструмент за изследване на неоплазми) - за изследване на туморни клетки. За този анализ се използват неоцветени намазки от кръв, костен мозък или препарати от други тъкани. Етап 1 - препаратите се инкубират със специфични моноклонални антитела, етап 2 - конюгиране с флуорофори се извършва за последваща визуализация на комплекса антиген-моноклонално антитяло. Етап 3 - извършване на in situ хибридизация с ДНК сонди. Флуорофори, които се различават по цвят, се използват за откриване на моноклонални антитела и ДНК сонди. Изследването на препарата под флуоресцентен микроскоп с необходимия набор от филтри позволява едновременен анализ на имунофенотипа на хибридизацията и сигналите в интерфазните ядра.

Хромозомна делеция на TNFAIP 3 в c. HL се открива чрез интерфазна цитогенетика. ФЕКЦИЯ анализи на. представител c. HL случаи комбинирани. CD 30 експресия (червено) и FISH сонди за TNFAIP 3 и центромер на хромозома 6 (синьо [b]). В двуцветните анализи в A–C и E и F, сондата TNFAIP 3 е маркирана в зелено (g); в трицветния анализ, приложен в D, сондата TNFAIP 3 дава g/оранжев колокализиран (co) сигнал. Две различни стратегии се използват за показване на двоен и троен цвят FISH анализи в комбинация с CD 30 имунофлуоресценция; и д. , двуцветните анализи (A–C и E и F) са показани с помощта на трицветен дисплей, докато фалшив многоцветен дисплей, получен от софтуера Isis, се прилага за трицветния анализ (D), за да покаже едновременно четири цвята ( т.е., CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] и оранжево, и центромер на хромозома 6 [b]).

Цифровото записване на микроизображения отвори възможността за преобразуване в псевдоцветове не само комбинации от флуорофори, но и техните съотношения, интензитети

Многоцветно оцветяване на хромозоми (Muli. Color Banding - MSV) Този метод не е предназначен за пълен анализ на всички хромозоми, а за подробен анализ на една хромозома. Специфичните за локуса ДНК сонди са маркирани с различни флуорофори или комбинации от флуорофори, така че нивото на сигнала на всяка от ДНК сондите да варира по интензитет. Припокриващите се профили на интензитета на сигналите на ДНК сондата осигуряват вариации в съотношенията на интензитетите на флуоресценция на различни флуорофори по протежение на хромозомата. Съотношенията на интензитета могат да бъдат преведени в псевдоцветове и по този начин всяка точка от изображението и следователно всеки от хромозомните локуси ще има свой собствен псевдоцвят. Тази версия на многоцветния метод FISH се оказа много ефективна при анализа не само на интерхромозомни, но и на интрахромозомни пренареждания при онкологични заболявания. За успешното му прилагане обаче е необходимо първо да се определи хромозомата, която ще бъде изследвана. Този метод на молекулярна цитогенетика е подходящ за анализ на кариотипни нарушения, свързани с определени хромозоми.

Към днешна дата са създадени набори от ДНК сонди, които осигуряват MCV за всички човешки хромозоми на хромозома 5; многоцветни ленти на хромозома 5; идиограма на хромозома 5; флуорохроми, използвани за MSV).

Метафазната цитогенетика, която исторически е възникнала по-рано от интерфазната цитогенетика, позволява да се определи широк спектър от хромозомни нарушения, но това изисква изследваните клетки да са в метафазния стадий на мейоза.

Многоцветно кариотипиране Анализът се извършва с помощта на ДНК сонди с непрекъснато оцветяване на ръцете или цели хромозоми (WCP сонди - боя за цяла хромозома). Такива сонди хибридизират с множество къси ДНК последователности, разположени по цялата дължина на хромозомата. По този начин, когато се гледа под флуоресцентен микроскоп, хромозомата изглежда равномерно оцветена в определен цвят.

ДНК сондите, използвани за този анализ, се състоят от смес от твърди сонди за оцветяване за пълния набор от човешки хромозоми, белязани с комбинация от няколко флуорохрома, чието съотношение се избира индивидуално за всяка двойка хромозоми. Използването на подходящи методи за регистрация и компютърни програми за анализ на изображението, които оценяват интензитета на луминесценцията на всички флуорохроми за всяка точка на изображението, дава възможност за извършване на кариотипиране, при което всяка двойка хромозоми има свой собствен уникален "псевдоцвет". ".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor или multiplex. FISH) е общото име за традиционните многоцветни FISH, използващи специфични за флуорохром набори филтри. Принципът M-FISH се състои в отделно цифрово записване на сигнала на всички използвани флуорохроми, което се постига чрез последователна смяна на комплекти филтри. Всички изображения се записват в отделни файлове, което прави възможно извършването на тяхната ефективна обработка, свързана с разделяне на сигнала и фона, както и количествено определяне на сигнала. Обработката на цялата записана информация с помощта на специален софтуер превежда информацията за нивото на флуорохромните сигнали във всяка точка на изображението в псевдоцветове. Едно от основните ограничения на броя на използваните ДНК сонди е броят на наличните флуорохроми с неприпокриващи се възбуждащи и емисионни спектри и наличието на подходящи комплекти филтри.

24-цветна FISH Най-широко използваната M-FISH е 24-цветна FISH за едновременно идентифициране на материал от всички човешки хромозоми. Той е много ефективен при откриване на хромозомни транслокации, но не е предназначен за откриване на делеции и инверсии. Този проблем обаче може да бъде частично решен чрез едновременно оцветяване на хромозоми с DAPI, което прави възможно анализирането на диференциалната набраздяване на хромозомите, чийто хромозомен материал вече е идентифициран. За съжаление, трябва да се отбележи, че качеството на хромозомната DAPI лента след M-FISH е значително по-ниско от GTG диференциалното оцветяване и дори DAPI лентите след конвенционална in situ хибридизация.

Rx. FISH Принципът M-FISH е използван за генериране на многоцветен баркод за човешки хромозоми и метод на многоцветно хромозомно обвързване, базиран на междувидова in situ хибридизация. За разлика от 24 цвята FISH, този метод дава възможност за директно откриване на част от интрахромозомните пренареждания. ДНК сонди, използвани в Rx. FISH, етикетирана с комбинация от 3 флуорохрома, която осигурява 7 псевдо цвята. Те специално оцветяват отделни области на хромозомите, създавайки тяхната цветна ивица. Тази характеристика на ДНК проби за Rx. РИБИТЕ се определят от начина, по който са получени. Те са специфични за хромозомите ДНК библиотеки на два вида гибони: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus.

В резултат на интензивните хромозомни пренареждания, настъпили при формирането на съвременните видове гибони, материалът на техните хромозоми се оказа силно разбъркан в сравнение с организацията на хромозомите при хората, чиито хромозоми са известни със своя консерватизъм. Съотношението на човешката хромозома 1 към гибон хромозомите е показано на фигура 1,

Фигура 2 показва общ изглед на човешки хромозоми, получени в резултат на Rx. РИБА. а) Метафазна плочка б) Подреждане на хромозомите.

Въпреки това, RXFISH има сериозни ограничения - хромозомните пренареждания, които са се случили в рамките на една цветна RX лента, не могат да бъдат открити с помощта на този метод, освен ако не доведат до значителни и лесно видими промени в размера на тази лента. - сондите оцветяват няколко хромозомни области на различни хромозоми в един псевдоцвет. Въпреки това, тъй като броят на използваните флуорохроми се увеличава, методът RXFISH несъмнено ще бъде по-информативен от рутинния 24-цветен FISH.

Предимствата на RXFISH в момента включват следните точки: Методът позволява анализ на целия човешки геном в един многоцветен FISH експеримент. Предлагат се в търговската мрежа набори от белязани ДНК сонди и необходимите системи за откриване. Методът позволява бързо идентифициране на значителна част от интра- и интерхромозомните пренареждания. Възможна е автоматична идентификация на метафазни хромозоми с „цветни ленти“. Всяка човешка хромозома има уникален цветен баркод. RXFISH е интегриран в работната станция Cyto. Системи за зрение и стандартна флуоресцентна микроскопия.

Спектрално кариотипиране (SKY-спектралкариотипиране) Основните принципи на анализа на микроскопични изображения при спектралното кариотипиране са практически същите като тези, използвани в M-FISH. Разликите са свързани с начина на регистриране на изображението. Технологията SKY дава възможност за получаване на спектрални криви за всички точки на изображението по време на едно измерване, независимо дали е свързано с епифлуоресценция или с традиционна светлинна микроскопия. За спектрално кариотипиране на всички човешки хромозоми се използват пет флуорохрома, един в зеления спектър, два в червения и два в инфрачервения. Възбуждането и излъчването на всички флуорохроми, използвани при етикетирането на ДНК сонди, се осъществява с един набор от филтри, което позволява да се избегне тяхната последователна промяна, междинно фокусиране и следователно свързани проблеми, като пространствено изместване на изображението, определяне на праговите стойности. и маски за сегментиране. Въз основа на анализа на спектралните криви се определя наличието или отсъствието на специфични флуорохроми в дадена точка.

Следващата стъпка е процедурата за класификация, която ви позволява директно и недвусмислено да определите хромозомната принадлежност на анализирания материал. Това гарантира надеждна идентификация (до хромозома) на маркерния хромозомен материал, както и на производните на хромозомите, произтичащи от различни пренареждания. Голямото предимство на SKY е, че DAPI оцветяването се регистрира успоредно на спектралното изображение. Софтуерното подобрение на DAPI лентата позволява да се постигне диференциално набраздяване в качеството, близко до GTG лентите. Възможността за паралелен анализ на спектралното изображение и качествено диференциално оцветяване на хромозомите значително опростява интерпретацията на резултатите от SKY и позволява по-точно определяне на точките на хромозомни прекъсвания. Несъмнените предимства на SKY включват възможността за използване на флуорохроми с припокриващи се спектри на възбуждане и излъчване, което значително разширява списъка на използваемите флуорохроми, а също така увеличава броя на флуорохромите, които могат да се използват едновременно. Изброяването на нов флуорохром не изисква закупуването на нов комплект филтри, тъй като един филтърен модул за спектрална FISH и един филтър за DAPI са достатъчни за SKY.

Недостатъците на SKY включват: - дълго време на експозиция, необходимо за записване на микроскопични изображения. - SKY е малко по-малко ефективен от M-FISH, когато става въпрос за изследвания с относително малки ДНК сонди.

Кариотипиране с промяна на цвета (CCKs Кариотипиране с промяна на цвета) Този метод се основава на анализа на разликата в дължината на сигнала между ДНК проби, хибридизирани с ДНК сонди, свързани с флуорохроми, и ДНК сонди, носещи антитела. Методът е осъществим само с 3 филтъра и не изисква специални камери и софтуер. За идентифициране на хромозоми се извършва една хибридизация и се получават две изображения. Методът се основава на разликата в дължината на флуоресцентния сигнал, тъй като времето на експозиция на ДНК проби, свързани с антитела, е с 80 - 90% по-малко от това на пробите, свързани с флуорохроми. След реакцията на хибридизация, тампоните се излагат на съответните първични антитела и след това се визуализират, за да се получи първото изображение. След това слайдовете се излагат на вторични антитела и авидин, свързан със същите флуорохроми. Штрихите могат да бъдат противооцветени с помощта на DAPI.

В бъдеще изображенията на препаратите отново се получават с помощта на 3 филтъра на свой ред. Тези изображения се сравняват с помощта на специален софтуер и се получава второ изображение, в което ще се виждат само хромозомите, свързани с определени антитела. По този начин някои хромозоми ще флуоресцират само при първото или второто сканиране, докато други ще променят цвета си при различни сканирания.

Сравнителна геномна хибридизация (CGH) Методът е създаден за идентифициране на количествени нарушения в генома. Тя се основава на провеждане на реакция на хибридизация in situ, използвайки целия геном като ДНК проба. Изолираната и нормална донорна ДНК се маркира с флуорохроми с различни цветове, като по този начин се превръща в ДНК сонди. Еквивалентни количества от тези сонди се смесват и се използват при хибридизация с контролен цитогенетичен препарат. След FISH, метафазите се анализират на флуоресцентен микроскоп, като се използва специализирана програма за компютърен анализ на изображения за определяне на интензитета на флуоресценция на два флуорохрома по цялата дължина на всяка хромозома.

При липса на количествени промени в кариотипа на тестовата проба ще се наблюдава определено съотношение на интензитета на луминесценция на двата флуорохрома. В случай на генно усилване интензитетът на сигнала на съответния флуорохром ще се увеличи, а в случай на загуба на част от генетичния материал, напротив, ще отслабне. По този начин CGH прави възможно откриването на геномен дисбаланс, но този метод не може да се използва за откриване на балансирани транслокации и инверсии, а тризомиите и делециите могат да бъдат открити само ако размерът на небалансирания регион е най-малко 10 милиона базови двойки.

Хромозомният дисбаланс в тестовата проба се оценява от разликата в интензитета на флуоресценция на два различни флуорохрома чрез изчисляване на флуоресцентното съотношение (FR).

Методът CGH има редица предимства пред други методи за анализиране на промените в генома: Първо, той не зависи от източника на тестовия материал и може успешно да се извърши с малко количество тествана ДНК, включително архивен материал. Второ, позволява получаването на подробна информация за загубата или увеличаването на броя на копията на генетичен материал в целия геном в един експеримент. На трето място, методът CGH не изисква приготвянето на метафазни хромозомни препарати от изследваната тъкан, тоест не зависи от процеса на клетъчна култура и свързани артефакти.

Геномна ситу хибридизация (genomicin situ hybridization in, GISH) е вариант на метода на ситу хибридизация, който се състои във факта, че за хибридизация с фиксирани проби, общата геномна ДНК на един вид организъм се използва като флуоресцентно белязана сонда, с с което се конкурира общата геномна ДНК на друг вид организми; използва се за определяне на междувидови и вътрешновидови разлики в геномите, хромозомни пренареждания, делеции и замествания.

FISH вариации 1) Q-FISH – количествена FISH: Разработено от Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward и P. M. Lansdorp. 1998. Къси теломери на човешка хромозома 17 стр. Нац. Genet. 18:76-80. количествен метод. Проектиран за работа с поточна цитометрия. Първоначално се използва за измерване на дължината на хромозомата (резолюция: 200 bp) чрез преброяване на броя на теломерните повторения. Използват се PNA-конюгирани сонди. Първоначално бяха изследвани метафазни хромозоми (QFISH), сега този метод е приложим и за интерфазни хромозоми (IQ-FISH). Q-FISH се провежда върху клетъчна култура, тъканни срезове (и двете върху очила). В момента Q-FISH е важен инструмент в изследването на ролята на теломерите в процесите на стареене и образуване на рак.

PNA-FISH - Пептидни нуклеинови киселини FISH: Пептидните нуклеинови киселини (PNAs) са синтетични аналози на ДНК, в които захарният гръбнак на дезоксирибозния фосфат, който поддържа азотната основа, е заменен от незареден пептиден гръбнак. В резултат на тази структура: когато PNA-олигомерната проба хибридизира с комплементарна ДНК/РНК, не настъпва електростатично отблъскване. Дуплексите на PNA-DNA (PNA-RNA) са много по-стабилни от естествените хомо/хетеродуплекси. Висока специфичност на свързването на PNA-DNA: хибридизацията на PNA-DNA е много по-чувствителна към несъответствие на базовите двойки, отколкото хибридизацията на ДНК-ДНК. По този начин, използвайки PNA сонда, могат да се разграничат два центромерни повторения, които се различават само в една базова двойка. PNA има относителна хидрофобност (в сравнение с ДНК), в резултат на което PNA дифундира по-добре през клетъчните стени => широко приложение в микробиологията. Въз основа на висока специфичност на свързване: Смята се, че PNA технологията скоро ще стане основа за създаването на алел-специфични сонди за in situ хибридизация. Използва се в генетиката, цитогенетиката, епигенетиката, микробиологията и др.

3) Flow-FISH - FISH за поточна цитометрия: Предложено през 1998 г. от: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, PM Динамика на дължината на теломерите в субпопулациите на човешки лимфоцити, измерена чрез потока на потока . природа биотехнология. 16, 743–747 (1998). Комбинация от Q-FISH и поточна цитометрия, която позволява анализ (измерване) и сортиране на сигнала. За flow-FISH се използва клетъчна суспензия (за измерване на дължината на хромозомните теломери), хромозомни разпределения и изолирани хромозоми (за по-нататъшно картографиране). Както при Q-FISH, се използват PNA-маркирани теломерни сонди (например за изобразяване и измерване на дължината на теломерните повторения).Основното предимство е по-бърз метод (анализ/сортиране на голям брой клетки/хромозоми). Той се използва широко за изследване на различни проблеми: стареене, запазване на теломерите, изследване на суспензии на хематопоетични стволови клетки ex vivo, изследване на бактерии.

Мултипараметричният анализ позволява диференциране на клетъчни типове в рамките на една проба, позволявайки вътрешен контрол и анализ на левкоцитни подтипове.

Предимства на flow-FISH: Лесно възпроизводими резултати Възможност за анализиране на подгрупи от клетки в популация с помощта на физическа имунофлуоресценция и маркери По-добра производителност от Q-FISH Възможност за количествено определяне на флуоресценцията на хиляди клетки.

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ИЗОЛИРАНИ ХРОМОЗОМИ ЧРЕЗ ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРИЯ 1. Сортиране на хромозоми чрез поточна цитометрия - Кариотипирането чрез проточна цитометрия се използва за по-нататъшно генно картографиране и изграждане на хромозомни библиотеки. - Идентификацията и локализацията на гени върху сортирани хромозоми се извършва с последващо използване на FISH методи / PRINS метод (primed in situ маркиране) или негови вариации и хромозомно-специфичен PCR. - До 2011 г. досега са успешно сортирани само хромозомите на 17 вида културни растения. - Сортиране на метафазни или пахитени хромозоми с висок индекс на делене.

Флуоресцентно етикетиране: - Хромозомите са белязани със специфични за нуклеинова киселина флуорохроми. - Флуорохромите се избират в съответствие с 1) специфичност за азотни основи, 2) експериментални условия (включително като се вземат предвид дължините на вълната на наличните лазери). 1. За моновариантен анализ използвайте багрила, които не са специфични за AT или GC пари: пропидиев йодид (пик на възбуждане: 535 nm, емисии: 617 nm, необходим лазер: 488 nm аргонов лазер или лампа + дългопропускащ филтър) етидиев бромид ( пикове на възбуждане: : 300 и 520 nm, емисии: 600 nm, необходим лазер: 488 nm аргонов лазер или лампа + дългопропускащ филтър) Тези етикети оцветяват ДНК, независимо от съдържанието на A, G, T или азотни основи. 2. За бивариатен анализ използвайте: хромомицин (специфичен за G-C базови двойки), пик A 3 възбуждане: 458 nm, емисия 580 nm. Лазер: , 458 nm минимум 400 m. V мощност. Hoechst 33258 (специфичен за A-T bp), възбуждане: 351-364 nm, излъчване: 470 nm. Лазер: 351 -364 nm (мощен). Лазерите трябва да бъдат разделени във времето и пространството поради частичното припокриване на флуорохромните спектри.

2. Изследване на хромозоми/нуклеотидни последователности след сортиране (за изграждане на физически и генетични карти и др.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Изследване на големи геноми с дълги хромозоми. Картиране на последователности с голям брой повторения (напр. теломерни и центромерни области). Използване на къси сонди. Поради големия брой повторения сигналът е силен. Стандартен размер на сондата: 15 - 30 нуклеотида. РИБА

Проблеми с FISH: Трудно е да се локализират еднолокусни ДНК последователности (т.е. неповтарящи се уникални ДНК последователности), тъй като сигналът ще бъде много слаб при използване на стандартни къси сонди. Увеличаването на дължината на сондата до няколко килобази за подобряване на сигнала ще доведе до намалена чувствителност и => неспецифично свързване. Решение: BAC-FISH -BAC-FISH е комбинация от метода FISH и използването на геномни ДНК клонове, интегрирани в бактериални изкуствени хромозоми (BACs), което позволява вмъкването на големи ДНК последователности. - Ефикасен метод за идентифициране и картографиране на отделни хромозоми на организми с малки геноми. BAC сонди, overgos (припокриващи се олигонуклеотиди) се използват като сонда.

Алтернатива на FISH: PRINS PRINS (маркиране in situ) е метод за маркиране на хромозоми чрез отгряване на олигонуклеотиден ДНК праймер с хомоложна последователност от денатурирана хромозомна ДНК и последващо ензимно удължаване на праймера in situ с белязани нуклеотиди. Първо описан от Koch et al. през 1989 г. (Koch, JE, Kølvraa, S., Petersen, KB, Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) Методи за праймиране на олигонуклеотиди за хромозомно-специфично маркиране на алфа сателитна ДНК in situ. Хромозома 9598, 2 –265). PRINS е алтернатива на FISH. Използва се за локализация на нуклеотидни последователности, разпознаване и преброяване на метафазни или интерфазни хромозоми или хромозомни двойки (включително хромозомна анеуплоидия). отгряване на немаркирания праймер (праймер-праймер) с ДНК от интерес; удължаване на праймера с помощта на термостабилна ДНК полимераза и белязани нуклеотиди; прекратяване на реакцията (прикрепване на блокираща молекула към 3'-края) Праймер: PCR рестрикционен фрагмент; - индиректен (биотин/диг флуорохром-конюгиран авидин/анти-диг) - Само една двойка хомоложни хромозоми (една хромозома) може да бъде идентифицирана в резултатите от всяка PRINS реакция. Следващата PRINS реакция на същия слайд може да се извърши само след блокиране на предишната. - Използва се за ДНК последователности с голям брой повторения.

Предимства на PRINS: 1. Изисква минимална информация за последователността, необходима за синтеза на олигонуклеотиден праймер. 2. Най-бързият и прост метод за откриване на интересна последователност на хромозома (в сравнение с използването на тежки FISH сонди, които хибридизират за много дълъг период от време). 3. Изключване на стъпката за етикетиране на сондата. 4. Способността за удължаване на праймера с белязани нуклеотиди за подобряване на c-PRINS сигнала при откриване на къси уникални последователности. За идентифициране на повторения с ниско копие или къси уникални последователности се използва по-чувствителен метод - циклиране на PRINS (c-PRINS). C-PRINS е предложен от Gosden et al. през 1991 г., подобрен широко използван протокол от Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Локализация на ДНК последователности върху растителни хромозоми с помощта на PRINS и C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS включва серия от термични цикли, подобни на PCR.

Обвивна течност за FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Проточна цитометрия и FISH за измерване на средната дължина на теломерите (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 м. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Поточно сортиране на митотични хромозоми в обикновена пшеница (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033-41) -M . Така че 4 буфер без дитиотреитол (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, YC Song. Поточно-сортирани хромозоми: фин материал за физическо картиране на растителни гени. Caryologia. 2006, том 59, бр. 2: 99 -103 ) -автоклавиран 0,1% (тегло/обем) Na. Cl-50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Čihalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Сортиране на хромозоми в тетраплоидна пшеница и нейният потенциал за анализ на генома. Генетика, 1705 г., 2005 г. 823–829) -Хромозомно стабилизиращ полиаминов буфер (течност, съдържаща протеини) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Флуоресцентна in situ хибридизация

Флуоресцентна хибридизация на място , или метода FISH (англ. Флуоресценция на място хибридизация - FISH ) - цитогенетичен метод, който се използва за откриване и определяне на позицията на специфична ДНК последователност върху метафазни хромозоми или в интерфазни ядра на място. В допълнение, FISH се използва за откриване на специфични иРНК в тъканна проба. В последния случай методът FISH дава възможност да се установят пространствено-времеви характеристики на генната експресия в клетките и тъканите.

Сонди

С флуоресцентна хибридизация на мястоизползвайте ДНК сонди (ДНК сонди), които се свързват с комплементарни цели в пробата. ДНК сондите съдържат нуклеозиди, белязани с флуорофори (директно маркиране) или с конюгати като биотин или дигоксигенин (непряко маркиране). При директно маркиране, ДНК сондата, свързана с целта, може да бъде наблюдавана с помощта на флуоресцентен микроскоп веднага след завършване на хибридизацията. В случай на индиректно маркиране е необходима допълнителна процедура за оцветяване, по време на която се открива биотин с помощта на флуоресцентно белязан авидин или степавидин и дигоксигенин с помощта на флуоресцентно белязани антитела. Въпреки че индиректният вариант на маркиране на ДНК проби изисква допълнителни реагенти и времеви разходи, този метод обикновено постига по-високо ниво на сигнал поради наличието на 3-4 флуорохромни молекули върху антитяло или молекула на авидин. Освен това, в случай на индиректно маркиране, е възможно каскадно усилване на сигнала.

За създаване на ДНК проби се използват клонирани ДНК последователности, геномна ДНК, PCR реакционни продукти, белязани олигонуклеотиди и ДНК, получена чрез микродисекция.

Етикетирането на сондата може да се извърши по различни начини, например чрез ник-транслация или чрез PCR с белязани нуклеотиди.

Процедура за хибридизация

Схема на експеримента за флуоресцентна хибридизация на мястоза локализиране на позицията на гена в ядрото

Първата стъпка е проектирането на сондите. Размерът на сондата трябва да е достатъчно голям, за да се осъществи хибридизация на определено място, но не твърде голям (не повече от 1 kb), за да не се намесва в процеса на хибридизация. При идентифициране на специфични локуси или при оцветяване на цели хромозоми е необходимо да се блокира хибридизацията на ДНК сонди с неуникални повтарящи се ДНК последователности чрез добавяне на немаркирани ДНК повторения (например Cot-1 ДНК) към хибридизационната смес. Ако ДНК сондата е двуверижна ДНК, тя трябва да бъде денатурирана преди хибридизация.

На следващия етап се приготвят препарати от интерфазни ядра или метафазни хромозоми. Клетките се фиксират върху субстрат, обикновено върху предметно стъкло, последвано от денатурация на ДНК. За да се запази морфологията на хромозомите или ядрата, денатурацията се извършва в присъствието на формамид, което дава възможност да се намали температурата на денатурация до 70°.

Визуализацията на свързани ДНК сонди се извършва с помощта на флуоресцентен микроскоп. Интензитетът на флуоресцентния сигнал зависи от много фактори - ефективността на етикетиране на сондата, вида на сондата и вида на флуоресцентното багрило.

литература

Рубцов Н.Б. Методи за работа с хромозоми на бозайници: Proc. надбавка / Новосиб. състояние не-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

Рубцов Н.Б. Хибридизация на нуклеинови киселини на мястопри анализа на хромозомни аномалии. Глава в книгата "Въведение в молекулярната диагностика" Т. 2. "Молекулярно-генетични методи в диагностиката на наследствени и онкологични заболявания" / Изд. M.A. Пальцева, Д.В. Залетаев. Учебна литература за студенти от медицински университети. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Бележки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е "Флуоресцентна in situ хибридизация" в други речници:

Този термин има други значения, вижте хибридизация. ДНК хибридизация, хибридизация на нуклеинови киселини in vitro комбинация от комплементарни едноверижни нуклеинови киселини в една молекула. С пълно допълване ... ... Уикипедия

Метод на определяне флуоресцентна in situ хибридизация.

Изучаван материал Вижте в описанието

Възможност за домашно посещение

Изследването се използва за избор на индивидуална адювантна химиотерапия за рак на гърдата или рак на стомаха.

Ракът на гърдата (BC) е на първо място сред онкологичните заболявания при жените. Туморните клетки на гърдата могат да съдържат различни видове рецептори, които са чувствителни към определени вещества (хормони или други биологично активни молекули). В зависимост от наличието на хормонални рецептори (естроген и прогестерон) или рецептор на човешки епидермален растежен фактор тип 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2) в туморните клетки се изолират хормон-рецептор-положителен, HER2-положителен и тройно отрицателен рак на гърдата . Това е важно да се вземе предвид при индивидуалния избор на терапия и за прогнозиране на успеха на лечението.

HER2 е рецептор, който присъства в тъканите и нормално, участващ в регулирането на клетъчното делене и диференциация. Неговият излишък върху повърхността на туморните клетки (хиперекспресия) предопределя бързия неконтролиран растеж на тумора, високия риск от метастази и ниската ефективност на някои видове лечение. Хиперекспресията на HER2 при някои подтипове рак на гърдата води до повишена пролиферация и ангиогенеза, както и до дисрегулация на апоптозата (генетично програмирано самоунищожаване на клетките). В момента има лекарства, които са насочени към HER2 рецептора. Това по-специално е Herceptin (трастузумаб), което е моноклонално антитяло срещу HER2/neu рецептори.

Амплификацията и свръхекспресията на HER2 онкогена (ErbB-2) са относително специфични събития за карцином на гърдата и практически не се срещат при тумори с други локализации. Ракът на стомаха (GC) е едно от малкото изключения: активирането на HER2 се забелязва в около 10-15% от случаите на злокачествени новообразувания на този орган и корелира с агресивния ход на заболяването. При HER2-положителен рак на гърдата, излишък от HER2 рецептори може да присъства на повърхността на туморните клетки (наричани HER2 позитивни или Hercept положителни). Това явление се наблюдава при 15-20% от жените, страдащи от рак на гърдата. Оценката на HER2 статуса е важна за определяне на тактиката на лечение.

Основните стандартизирани методи за откриване на свръхекспресия на HER2/neu и/или амплификация на HER2/neu гена са имунохистохимичният (IHC) метод и флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). И двете изследвания се провеждат върху хистологични препарати (секции от туморния материал, вградени в парафин) с помощта на поликлонални антитела (IHC), флуоресцентни сонди (FISH) и различни системи за изображения.

При оценка на резултатите от IHC реакцията експресията се взема предвид само в инвазивния компонент на тумора. Резултатите от реакцията се оценяват с помощта на скала за оценка: 0, 1+, 2+, 3+, разработена от производителя на теста и одобрена от експерти. Статусът на Hercept, оценен като 0 и 1+, трябва да се счита за отрицателен - няма свръхекспресия на протеина, което корелира с липсата на амплификация на неговия ген. Статусът на Hercept, оценен 3+, е положителен, т.е. налице е свръхекспресия на протеин, в съответствие с наличието на генна амплификация. Hercept статус 2+ се счита за неопределен, т.е. експресията на протеин, определена на базата на имунохистохимична реакция, не може да бъде уверено преценена за генната амплификация, следователно е необходимо изследване, което директно разкрива наличието или отсъствието на амплификация. Методът FISH се използва върху срезове от същата проба (блок), върху която е извършено имунохистохимичното изследване. При FISH хибридизация присъствието на HER2 генна амплификация се оценява чрез преброяване на съотношението на червените флуоресцентни (съответстващи на белязани HER2 гени) и зелените флуоресцентни сигнали, които маркират центромерната област на 17-та хромозома. Съотношение по-голямо от 2 показва наличието на HER2 амплификация. Методът FISH е по-чувствителен от метода IHC, тъй като ви позволява директно да оцените наличието или отсъствието на амплификация.

Материал за изследване: парафинов блок с туморна биопсия.

Внимание! НЕОБХОДИМО:

предметно стъкло с IHC-оцветяване с антитела към HER2/neu
направление от лекар или извлечение с резултатите от хистологично и IHC изследване с антитела срещу Her-2/neu

литература

Завалишина Л.Е., Франк Г.А. Морфологично изследване на HER2 статус. Методология и атлас. - М.: Изд. Медия Медика. 2006:98.
Злокачествени заболявания в Русия през 2011 г. (заболеваемост и смъртност). Изд. В И. Чисова, В.В. Старински, Г.В. Петрова. - М.: ФГБУ „МНИОИ им. П.А. Херцен" от Министерството на здравеопазването на Русия. 2013:289.
онкология. Клинични насоки. Асоциация на онколозите на Русия. Изд. В И. Чисова, С.Л. Дарялова. - М.: Изд. „ГЕОТАР-Медия”. 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. et al. Трастузумаб в комбинация с химиотерапия срещу химиотерапия самостоятелно за лечение на HER2-положителен напреднал рак на стомаха или гастро-езофагеалната връзка (ToGA): фаза 3, отворено, рандомизирано контролирано проучване. Ланцет. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Диагностична имунохистохимия: тераностични и геномни приложения. Elsevier, 4-то издание. 2013:960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Заболеваемост и смъртност от рак в световен мащаб: база за рак на IARC № 10. Лион, Франция: Международна агенция за изследване на рака; 2010. Достъпно от: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. Акценти на срещата: Международен експертен консенсус относно първичната терапия на ранен рак на гърдата 2005 г. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. Класификация на СЗО на туморите на женските репродуктивни органи. WHO Press, 4-то издание. 2014;4:316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. et al. Амплификацията на Her2/neu е независим прогностичен фактор при рак на стомаха. Храносмилателни заболявания и науки. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D. et al. Адювант Трастузумаб при HER2-положителен рак на гърдата. The New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.