Флуоресцентная гибридизация in situ. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

В некоторых случаях цитогенетического исследования бывает недостаточно для выдачи заключения о кариотипе, в этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (англ. - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) .

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, базирующихся преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики. Метод in situ гибридизации был разработан для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Произошел переход в идентификации хромосом и хромосомных районов с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной. Классические методы цитогенетического анализа позволяют выявлять лишь около 15 % хромосомных перестроек, идентифицируемых с помощью SKY.

В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

• * локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;
• * альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;
• * зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно «раскрасить» всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (> 500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

Традиционная цитогенетика при изучении кариотипа всегда была ограничена бэндовым уровнем разрешения. Даже при использовании высокоразрешающих методов дифференциального окрашивания хромосом мы всего лишь выявляли большее количество бэндов на хромосоме, но не были уверены, что добираемся до молекулярного уровня разрешения. Последние достижения ДНК-технологий и цитогенетики сделали возможным использование методов FISH для анализа изменений хромосомной ДНК на молекулярном уровне. Молекулярная цитогенетика обеспечила революционный прорыв в цитогенетике, позволив:

Осуществлять анализ структуры ДНК хромосом в диапазоне 10-100 килобаз;
проводить диагностику неделящихся интерфазных клеток, что оказало огромное влияние на пренатальную диагностику и преимплантационную генетическую диагностику (ПГД).

Технология FISH использует ДНК-зонд, который связывается или ренатурирует специфические последовательности ДНК внутри хромосомы. Денатурированный зонд инкубируется с нативной ДНК клетки, также денатурированной до одноцепочечного состояния. Зонд замещает биотин-дезоксиуридинтрифосфат или дигоксигенин-уридинтрифосфат на тимидин. После ренатурации зондом нативной ДНК комплекс «зонд-ДНК» можно обнаружить при добавлении меченного флюорохромом авидина, связывающегося с биотином, или меченного флюорохромом антидигоксигенина. Дополнительное усиление сигнала можно получить, добавив антиавидин и изучив получившийся комплекс с помощью флюоресцентной микроскопии. Пометив несколькими различными флюорохромами разные ДНК-зонды, можно одновременно визуализировать несколько хромосом или хромосомных сегментов внутри одной клетки в виде разноцветных сигналов.

Возможность определения специфических генных сегментов , имеющихся или отсутствующих на хромосомах, позволила диагностировать синдромы генных последовательностей на уровне ДНК, как, впрочем, и транслокации в интерфазных ядрах, зачастую - в отдельных клетках.

Материалом для FISH могут служить или метафазные хромосомы, полученные из делящихся клеток, или интерфазные ядра из клеток, не находящихся в стадии деления. Срезы предварительно обрабатывают РНКазой и протеиназой для удаления РНК, которая может вступать в перекрестную гибридизацию с зондом и хроматином. Затем их нагревают в формамиде, чтобы денатурировать ДНК, и фиксируют ледяным спиртом. Затем зонд подготавливают к гибридизации путем нагревания. После этого зонд и хромосомный препарат смешивают и герметизируют покровным стеклом при 37 °С для гибридизации. Изменяя температуру инкубации или солевой состав раствора для гибридизации, можно повысить специфичность связывания и уменьшить фоновую маркировку.

Применение флюоресцентной гибридизации in situ - технологии FISH

Эффективность технологии FISH впервые была продемонстрирована при локализации генов на . С внедрением метода флюоресцентного мечения, гибридизация in situ оказалась незаменимой для диагностики хромосомных аномалий, не выявляемых традиционными методами бэндинга. FISH также сыграла ключевую роль в совершении одного из самых необычных открытий современной генетики - геномного импринтинга.

Свое развитие технология FISH получила в трех формах. Центромерные, или альфа-сателлитные, зонды характеризуются относительной хромосомной специфичностью, их использовали чаще всего в генетике интерфазных клеток. Эти зонды генерируют в некоторой степени диффузные сигналы адекватной силы в области центромеры, но не вступают в перекрестную гибридизацию с хромосомами, имеющими аналогичные центромерные последовательности. В настоящее время разработаны однокопийные зонды, дающие дискретный сигнал от специфического бэнда хромосомы и позволяющие избежать феномена перекрестной гибридизации. Эти зонды также можно использовать для определения копийности и специфичных регионов хромосомы, предположительно связанных с тем или иным синдромом. Однокопийные и центромерные зонды, разработанные для хромосом 13, 18, 21, X и Y, используют для пренатальной диагностики.

Возможно также «окрашивание» целых хромосом с помощью FISH . Благодаря технологии спектрального кариотипирования, при которой используют смесь различных флюорохромов, теперь стало возможным создание уникального флюоресцентного паттерна для каждой отдельной хромосомы с 24 отдельными цветами. Эта технология позволяет определять сложные хромосомные перестройки, не видимые при использовании традиционных цитогенетических методик.

Метод FISH в пренатальной диагностике. Для женщин старшего репродуктивного возраста беременность может оказаться поводом не столько для радости, сколько для беспокойства. С возрастом женщины связан риск развития хромосомных аномалий плода. Амниоцентез, осуществляемый на 16-й неделе беременности, с последующим анализом кариотипа занимает 10-14 дней. Использование FISH в предварительном обследовании позволяет ускорить диагностику и уменьшить время ожидания. Большинство генетиков и лабораторий придерживаются мнения, что метод FISH не следует использовать изолированно для принятия решения о дальнейшем ведении беременности. Метод FISH обязательно следует дополнять кариотипическим анализом, и его результаты как минимум должны коррелировать с патологической картиной ультразвукового исследования (УЗИ) или биохимического скрининга по крови матери.

Синдромы генных последовательностей известны также под названием синдромов микроделеции, или сегментарной анеусомии. Это делеции смежных фрагментов хромосомы, вовлекающие, как правило, многие гены. Синдромы генных последовательностей были впервые описаны в 1986 г. с использованием классических методик цитогенетики. Теперь, благодаря FISH, возможна идентификация субмикроскопических делеции на уровне ДНК, что позволило выявлять наименьший делецированный регион, связанный с развитием того или иного синдрома, получивший название критического региона. После определения критического региона для синдрома зачастую становится возможным идентифицировать специфические гены, отсутствие которых признают ассоциированным с этим синдромом. В недавно вышедшем руководстве по синдромам генных последовательностей сообщают о 18 синдромах делеции и микроделеции, ассоциированных с 14 хромосомами. Некоторые наиболее часто встречающиеся синдромы генных последовательностей и их клинические проявления приведены в табл. 5-2.

Теломеры - образования, прикрывающие с концов длинные и короткие плечи хромосом. Они состоят из повторяющихся последовательностей TTAGGG и предотвращают слияние концевых участков хромосом между собой. Теломерные зонды играют важную роль в распознавании комплексных транслокаций, которые невозможно определить традиционными цитогенетическими методами. Кроме того, одним из открытий Проекта «Геном человека» был тот факт, что регионы хромосом, прилежащие к теломерам, богаты генами. В настоящее время показано, что субмикроскопические субтеломерные делеции ответственны за возникновение многих генетически обусловленных заболеваний.

Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на возможности образования двуцепочечных гибридов между искусственно создаваемых на основе одноцепочечных последовательностей (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидных) мечеными зондами и комплементарными им последовательностям в мишенях – анализируемых молекулах ДНК или РНК. Для выявления участков гибридизации ДНК-пробу (ДНК-зонд) метят какой-либо репортерной группой: ü радиоактивным изотопом, ü флуорохромом, ü ферментом, дающим окрашивание или люминесцирующий продукт, ü гаптеном, с которым связывается меченое тело и т. д.

Выявляя гибрид благодаря наличию в зонде репортерной группы можно - оценить число генов, кодирующих определенный вид РНК, - определить долю нетранскрибируемой ДНК в геноме, - установить сцепление определенных генов с другом друг - и их точное расположение на хромосомах. Метод молекулярной гибридизации обладает высокой чувствительностью (можно выявить малое количество меченого зонда (10 -15 и 10 -19 М) и соответственно комплементарной ему последовательности в мишени) и быстротой анализа, что позволяет использовать этот метод как для исследовательской деятельность так и для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний в медицине, ветеринарии и растениеводстве.

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, основанных преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики

Интерфазная цитогенетика: 1. Многоцветный бэндинг хромосом (МВС). 2. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). 3. Комбинация FISH с другими методами: -цитология + FISH; -гистология + FISH; -имунофенотипирование + FISH (FICTION); Метафазная цитогенетика: 1. Сплошное окрашивание хромосом (Whole painting). 2. Сравнительная геномная гибридизация (CGH). 3. Кариотипирование с переменой цвета (ССК). 4. Многоцветное кариотипирование: cпекральное кариотипирование (SKY); многоцветная FISH (M - FISH, M - BAND).

FISH – fluorescence in situ hybridization – цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах, м. РНК и др. В основе методики лежит гибридизация флуоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки происходит с помощью флуоресцентного микроскопа. Метод FISH был введен более 30 лет назад. Он широко распространился как метод физического картирования генов на хромосомах. Позднее он стал применяться в других областях исследований (в областях клинической генетики, репродуктивной медицины, токсикологии, эволюционной биологии, сравнительной и клеточной геномики и хромосомной биологии). На данный момент FISH преимущественно используется для построения физических и генетических карт хромосом, для выявления структурных перестроек, транслокаций, микроделеций, генных амплификаций в интерфазных и метафазных хромосомах. В результате развития науки (лучшего понимания химических и физических свойств нуклеиновых кислот и хроматина), а также развития флуоресцентной микроскопии и цифровой визуализации, метод постоянно совершенствовался (произведено улучшение чувствительности, специфичности, разрешения), и было разработано много вариаций данного метода.

1) Cells are dropped on to a glass slide causing chromosomes to spread 4) Chromosomes are counter stained using DAPI 2) Fluorescently labeled probe is placed on chromosomes and sealed. 3) The probe and chromosomes are denatured, hybridised then washed 5) Slide is viewed under a fluorescent microscope

Общий вид протокола для постановки FISH можно представит следующем виде: 1. Подготовка гистологического или цитологического препарата. Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток. 2. Предварительная обработка (если необходимо). Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию. 3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация. Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85 -900 С.

4. Гибридизация. После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (370 С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры. 5. Промывка. После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC). 6. Контр-окрашивание. При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4, 6 -диамидин-2 фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК. 7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

Исследование теломерных участков при помощи флуоресцентного микроскопа. Совмещены изображения, полученные на стадии интерфазы (ядро) и метафазы (отдельные хромосомы). синяя окраска - DAPI.

Преимущества FISH – метода: 1. возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах; 2. получение объективных результатов по принципу “да/нет" - это количественный метод; 3. относительно простая интерпретация результатов; высокая разрешающая способность. Недостатки FISH - метода: 1. флуоресцентные красители быстро "выцветают"; 2. для анализа результатов необходимы высококачественный флуоресцентный микроскоп.

В основе метода FISH лежит реакция гибридизации между созданным по специальным технологиям ДНК - зондом представляющим собой нуклеотидную, последовательность ограниченного размера, и комплементарным ему участком ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата. ДНК–зонд- главный элемент для постановки FISH несет "метку", т. е. содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. Несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция гибридизованного ДНК-зонда с использованием флуоресцентного микроскопа.

Мечение ДНК делят на прямое и непрямое. Прямое мечение введение в ДНК репортерных элементов – – флуорохромов (родамина, диэтиламинокумарина, техасского красного и др.). Непрямой метод мечения - ДНК-пробу предварительно конъюгируют с промежуточными лигандами (биотином, диоксигенином, 2, 4 -динитрофенолом), присутствие которых на цитологическом препарате выявляется затем с помощью флуорохромов. В этом случае чувствительность метода намного возрастает, так как лиганд может содержать несколько сайтов взаимодействия с флуорохромом. Впервые in situ гибридизация с 32 Р-меченным зондом была описана в 1969 году. Разработка нерадиоактивных систем мечения и детекции ДНК зондов сделала метод in situ гибридизации безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов. Флуоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго, дают высокое разрешение, и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.

Зонды: одноцепочечные/двуцепочечные ДНК/РНК первично/вторично меченые зонды. Зонды метятся: 1) напрямую: путем вставки нуклетидов, к которым прикреплен флюорохром (ПЦР или nick translation) 2) через репортерную молекулу (пр: digoxigenin, biotin) к которой крепятся флюоресцентно меченые антитела. Для усиления сигнала можно использовать вторичные, третичные и т. д. антитела, меченые флюоресцентной меткой. DNase nicks DNA Nick Translation DNA polymerase I adds new nucleotides to the 3’ hydroxyl DNA polymerase I removes individual bases from the 5’ end Визуализация хромосом: c помощью DAPI (2 mg/ml). 4’, 6 -diamidino-2 -phenylindole; сильное связывание с A-T богатыми участками ДНК; возбуждение UV светом; эмиссия 461 nm (blue).

В настоящее время можно выделить несколько основных подходов, широко используемых современной молекулярной цитогенетикой: Идентификация материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом. Детекция в интересующем районе конкретной последовательности ДНК. Анализ нарушения баланса отдельных хромосомных районов. Для идентификации материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом широко используются хромосом специфичные и район-специфичные ДНК-зонды (“painting probes”).

Характеристика зондов различных типов 1. локус-специфичные зонды(LSI - locus - specific identifiers, связывающиеся с определенными участками хромосом.) Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой (неповторяющимися) последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом. Они предназначены для выявления диагностически и прогностически значимых хромосомных аберраций при различных патологических состояниях (моносомии и трисомии по отдельным хромосомам). Наиболее широкое распространение этих проб получено в пренатальной цитогенетической диагностике, особенно в исследованиях клеток хориальной ткани, интерфазных ядер амниоцитов.

2. ДНК - пробы к теломерным участкам хромосом (TEL telomericprobe) предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плеч хромосом. Такие зонды специфичны для р- или q- плеч хромосом и комплементарны участку длиной около 300 т. п. н. от конца хромосомы. Как правило, ДНК - зонды для коротких и длинных плеч хромосом связаны с разными флуорохромами, что позволяет выявлять на одном цитогенетическом препарате оба теломерных участка хромосомы.

3. центромерные зонды-повторы, альфоидные или хромосомные нуменаторы (CEP – centromere. Enumeration. Probe) это хромосомо-специфические ДНК-пробы, представленные последовательностями тандемных альфа- и бета-сателлитных повторов. Эти повторы располагаются преимущественно в центромерных или прицентромерных гетерохроматиновых участках хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа, 4. зонды на всю хромосому, цельно-хромосомный зонд (WCP– Whole-Chromosome-Painting являются набором) небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Области применения FISH широко используется для решения следующих клиникодиагностических задач: 1. Перимплантационная пренатальная и диагностика хромосомны аномалий. Используется в клиниках экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и перинатальных центрах. Позволяет своевременно (до имплантации эмбриона в случае ЭКО или на ранних стадиях развития плода) выявить генетические нарушения у будущего ребенка и принять необходимые меры. 2. Онкогематология. Онкогематологические заболевания возникают в результате различных хромосомных аббераций, поэтому для их диагностики используют соответствующие CEP и LSI зонды. 3. Диагностика солидных опухолей. В настоящее время устанавливается все больше причинноследственных связей между развитием конкретных онкологических заболеваний и специфичных для них изменений в геноме. Поэтому при использовании соответствующих ДНКзондов можно проводить онкологическую FISH-диагностику.

Интерфазнаяцитогенетика: Комбинация FISH с другими методами: -имунофенотипирование FISH (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) – для исследования опухолевых клеток. Для этого анализа используют неокрашенные мазки крови, костного мозга или препараты других тканей. 1 этап - препараты инкубируют со специфическими моноклональными антителами, 2 этап - проводят конъюгацию с флуорофорами для последующей визуализации комплекса антиген-моноклональное антитело. 3 этап - осуществляют гибридизацию in situ с ДНК-зондами. Для выявления моноклональных антител и ДНК-зондов используют флуорофоры, различающиеся по цвету. Изучение препарата под флуоресцентным микроскопом при наличии необходимого набора фильтров позволяет одновременно проводить анализ иммунофенотипа гибридизационных и сигналов в интерфазных ядрах.

Chromosomaldeletionof TNFAIP 3 in c. HL detectedby interphasecytogenetics. FICTION analyses of. representative c. HL cases combining. CD 30 expression(red) and FISH probes for TNFAIP 3 and chromosome 6 centromere (blue [b]). In the double-color assays in A–C and E and F, the TNFAIP 3 probe is labeled in green (g); in the triple-color assay applied in D, the TNFAIP 3 probe gives a g/orange colocalized (co) signal. Two different strategies are used to display double- and triple-color FISH assays in combination with CD 30 immunofluorescence; i. e. , double-color assays (A–C and E and F) are shown using a triple-color display, whereas a false multicolor display as obtained by Isis software is applied for the triple-color assay (D) to simultaneously show four colors (i. e. , CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] and orange, and chromosome 6 centromere [b]).

Цифровая запись микроизображений открыла возможность переведения в псевдоцвета не только комбинации флуорофоров но и соотношения их, интенсивностей

Многоцветное окрашивание хромосом (Muli. Color Banding – МСВ) Данный метод предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения детального анализа отдельной хромосомы. Локус-специфичные ДНК-зонды метят различными флуорофорами или комбинациями флуорофоров так, что уровень сигнала каждого из ДНК-зондов варьирует по интенсивности. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-зондов обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценций различных флуорофоров вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей могут быть переведены в псевдоцвета, и, таким образом, каждой точке изображения, а, следовательно, каждому из хромосомных локусов, будет соответствовать свой псевдоцвет. Данный вариант многоцветного FISH-метода оказался высокоэффективным при анализе не только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Однакодля его успешного применения необходимо предварительно определить хромосому, которая будет исследована. Данный метод молекулярной цитогенетики подходит для анализа нарушений кариотипа, ассоциированных с определенными хромосомами.

К настоящему времени созданы наборы ДНК-зондов, обеспечивающ проведение МСВ для всех хромосом человека Многоцветный бэндингпятой хромосомы человека (иллюстрация Meta. Systems Gmb. H) (in situ гибридизация район-специфичных ДНК-библиотек хромосомы 5; профили сигналов район-специфичных ДНК-библиотек на хромосоме 5; многоцветный бэндинг хромосомы 5; идиограмма хромосомы 5; флуорохромы, использованные для МСВ).

Метафазная цитогенетика, исторически возникшая раньше интерфазной, позволяет определять широкий спектр хромосомных нарушений, но для этого необходимо, чтобы исследуемые клетки находились на стадии метафазы мейоза.

Многоцветное кариотипирование Анализ осуществляется при использовании ДНК зондов сплошного окрашивания к плечам или целым хромосомам (зонды WCP - whole chromosome paint). Такие зонды гибридизуются с многочисленными короткими последовательностями ДНК, расположенными по всей длине хромосомы. Таким образом, при изучении под флуоресцентным микроскопом хромосома выглядит равномерно окрашенной в определенный цвет.

ДНК - зонды, используемые для такого анализа, состоят из смеси зондов сплошного окрашивания для полного набора хромосом человека, помеченных с помощью комбинации из нескольких флуорохромов, соотношение которых подобрано индивидуально для каждой пары хромосом. Использование соответствующих методов регистрации и компьютерных программ анализа изображения, оценивающих интенсивность свечения всех флуорохромов для каждой точки изображения, позволяет провести кариотипирование, при котором каждая пара хромосом имеет свой уникальный "псевдоцвет".

M-FISH (multitarget multifluor multicolorили multiplex. FISH) , является общим названием для традиционных многоцветных FISH, использующих комплекты флуорохром-специфичных фильтров. Принцип M-FISHзаключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорохромов, что достигается последовательной сменой комплектов фильтров. Все изображения записываются в отдельные файлы, что позволяет проводить их эффективную обработку, связанную с разделением сигнала и фона, а также количественной оценкой сигнала. Обработка всей записанной информации с помощью специального программного обеспечения переводит информацию об уровне сигналов флуорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений числа используемых ДНК-зондов является число доступных флуорохромов, с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, и наличие соответствующих комплектов фильтров.

24 -цветная FISH Наиболее широко M-FISH используется как 24 -цветная FISH для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Она обладает высокой эффективностью при детекции хромосомных транслокаций, но не предназначена для выявления делеций и инверсий. Однако, эта проблема может быть частично решена одновременной окраской хромосом DAPI, что дает возможность проведения анализа дифференциальной исчерченности хромосом, хромосомная принадлежность материала которых уже идентифицирована. К сожалению, необходимо заметить, что качество DAPI-бэндинга хромосом после M-FISH существенно уступает GTGдифференциальной окраске и даже DAPI-бэндингу после обычной in situ гибридизации.

Rx. FISH Принцип M-FISH был использован для создания многоцвет бар кода хромосом человека и метода многоцветного бэндингахромосом, основанного на межвидовой in situ гибридизации. В отличие от 24 цветной FISH этот метод позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК зонды используемые в Rх. FISH, помечены комбинацией, 3 -х флуорохромов, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. Такая особенность ДНК проб для Rх. FISH обусловлена способом их получения. Они представляют собой хромосом специфичные ДНК библиотеки двух видов гиббонов: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus.

В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека, хромосомы которого известны своим консерватизмом. Отношение хромосомы 1 человека к хромосомам гиббонов приведен рисунке 1,

на рисунке 2 приведен общий вид хромосом человека полученный в результате Rх. FISH. а) Метафазная пластинка б) Раскладка хромосом.

Однако RXFISH имеет достаточно серьезные ограничени - перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного RX-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям размера этого бэнда. - зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. Тем не менее, при увеличении числа используемых флуорохромов несомненно, метод RXFISH, будет более информативным, чем рутинная 24 -цветная FISH.

К достоинствам RXFISH в настоящее время следует отнести следующие пункты: Метод позволяет осуществлять анализ всего генома человека в одном эксперименте многоцветной FISH. Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК проб и необходимых систем детекции. Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной части внутри - и межхромосомных перестроек. Возможна автоматическая идентификация метафазных хромосом “цветного бэндинга”. Для каждой хромосомы человека существует уникальный цветовой бар код. RXFISH интегрирован в рабочую станцию Cyto. Vision и стандартные системы флуоресцентной микроскопии.

Спекральноекариотипирование (SKY-spectralkaryotyping) Основные принципы анализа микроскопических изображений при спектральном кариотипировании практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения. Технология SKY позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости связано ли это с эпифлуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорохромов один в зеленом спектре, : два в красном и два в инфракрасном. Возбуждение и эмиссия всех флуорохромов, используемых при мечении ДНК зондов, проходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать их последовательной смены, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними проблем, таких как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и сегментационных масок. На основании анализа спектральных кривых определяетс наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов.

Следующим шагом является процедура классификации, которая позволяет прямо и однозначно определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала маркерных хромосом, а также дериватов хромосом, являющихся следствием разнообразных перестроек. Большим достоинством SKY является то, что параллельно спектральному имиджу регистрируется окраска DAPI. Программное улучшение DAPI бэндинга позволяет достичь дифференциальной исчерченности по качеству близкой к GTG-бэндингу. Возможность параллельного анализа спектрального имиджа и качественной дифференциальной окраски хромосом значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов. К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что значительно расширяет список пригодных к использованию флуорохромов, а также увеличивает число, флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно. Включение в список нового флуорохрома не требует приобретения нового комплекта фильтров, так как для проведения SKY достаточно одного блока фильтров для спектральной FISH и одного блока фильтров для DAPI.

К недостаткам SKY можно отнести: - длительное время экспонирования, необходим для записи микроскопических изображений. - SKY является несколько менее эффективным чем М-FISH, в случае необходимости проведения исследований с относительно небольшими по разме ДНК-зондами.

Кариотипирование переменой цвета (ССКс Color changing karyotyping) Этот метод основан на анализе различия в длине сигнала между образцами ДНК, гибридизованными с ДНК - зондами, связанными с флуорохромами, и с ДНК - зондами, несущими антитела. Метод осуществим при наличии всего 3 фильтров и не требует специальных камер и программного обеспечения. Для идентификации хромосом проводят одну гибридизацию и получают два изображения. В основе метода лежит различие в длине флуоресцентного сигнала, поскольку время экспозиции проб ДНК, связанных с антителами, на 80 - 90% меньше, чем проб, связанных с флуорохромами. После реакции гибридизации мазки экспонируют с соответствующими первичными антителами, а затем проводят визуализацию, получая первый снимок. Затем препараты экспонируют с вторичными антителами и авидином, связанными с теми же флуорохромами. Мазки можно контрокрасить, используя DAPI.

В дальнейшем снова получают снимки препаратов, используя поочередно 3 фильтра. Эти изображения сопоставляют, используя специальное программное обеспечение, и получают второй снимок, на котором будут видны только хромосомы, связанные с определенными антителами. Таким образом, некоторые хромосомы будут флуоресцировать только на первом или втором снимке, в то время как другие будут изменять свой цвет на разных снимках.

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) Метод был создан для выявления количественных нарушений в геноме. Он основан на проведении реакции гибридизации in situ с использованием в качестве ДНК - зонда всего генома. Выделенную и нормальную донорскую ДНК метят флуорохромами разного цвета, превращая их таким образом в ДНК зонды. Эквивалентные количества этих зондов смешивают и используют при гибридизации с контрольным цитогенетическим препаратом. После проведения FISH метафазы анализируют на флуоресцентном микроскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерного анализа изображения интенсивность флуоресценции двух флуорохромов по всей длине каждой хромосомы.

При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться определенное соотношение интенсивности свечения двух флуорохромов. В случае амплификации генов интенсивность сигнала соответствующего флуорохрома будет усиливаться, а в случае потери части генетического материала, наоборот, - ослабевать. Таким образом, CGH позволяет выявить геномный дисбаланс, но этот метод нельзя использовать для обнаружения сбалансированных транслокаций и инверсий, а трисомии и делеции можно определить только в том случае, если размер несбалансированного участка составляет не менее 10 млн. пар нуклеотидов.

Хромосомный дисбаланс в исследуемом образце оценивают по разнице в интенсивности флуоресценции двух разных флуорохромов с помощью вычисления флуоресцентного отношения (ФО).

Метод CGH имеет ряд достоинств по сравнению с другими методами анализа изменений генома: Во-первых, он не зависит от источника исследуемого материала, и может быть успешно проведен с малым количеством тестируемой ДНК, включая архивный материал. Во-вторых, он позволяет получить детальную информацию о потерях или увеличении числа копий генетического материала по всему геному в одном эксперименте. В третьих, метод CGH не требует приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани, то есть не зависит от процесса культивирования клеток и связанных с ним артефактов.

Геномная гибридизация situ (genomicin situ hybridization in , GISH) – вариант метода гибридизации situ, заключающийся в in том, что для гибридизации с фиксированными образцам качестве флуоресцентно меченного зонда используется суммарная геномная ДНК одного вида организма, с которой конкурирует суммарная геномная ДНК другог вида организма; используется для определения межвидовых и внутривидовых различий геномов, хромосомных перестроек, делецийи замещений.

Вариации FISH 1) Q-FISH – quantitative FISH: Разработан Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward, and P. M. Lansdorp. 1998. Short telomeres on human chromosome 17 p. Nat. Genet. 18: 76 -80. Количественный метод. Разработан для работы с проточной цитометрией. Изначально применялся для измерения длины хромосом (разрешение: 200 bp) путем подсчета числа теломерных повторов. Используются PNA-конъюгированные зонды. Изначально исследовали метафазные хромосомы (собственно QFISH), теперь данный метод применим и для интерфазных хромосом (IQ-FISH). Q-FISH проводится на культуре клеток, срезах тканей (оба на стеклах). На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломеров в процессах старения и ракообразования.

PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH: Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) – синтетические аналоги ДНК, в котором сахарный остов фосфата дезоксирибозы, поддерживающий азотистое основание, заменен на незаряженный пептидный остов. В результате такой структуры: при гибридизации PNA-олигомерного зонда с комплементарной ДНК/ РНК не происходит электростатического отталкивания. PNA-DNA (PNA-RNA) дуплексы гораздо стабильнее натуральных гомо/гетеродуплексов. Высокая специфичность связывания PNA-DNA: PNA-DNA гибридизация намного чувствительнее в отношении несоответствия пар оснований, чем DNA-DNA гибридизация. Так, с помощью PNA-зонда можно различить два центромерных повтора, различающиеся всего по одной паре оснований. PNA обладает относительной гидрофобностью (по сравнению с DNA), вследствие чего PNA лучше диффундирует сквозь клеточные стенки => широкое применение в микробиологии. На основании высокой специфичности связывания: считается, что PNA технология в скором времени станет основой для создания аллель-специфичных зондов для in situ гибридизации. Применяется в генетике, цитогенетике, эпигенетике, микробиологии и др.

3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry: Предложен в 1998 г. : Rufer, N. , Dragowska, W. , Thornbury, G. , Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nature Biotechnol. 16, 743– 747 (1998). Комбинация Q-FISH и проточной цитометрии, позволяющая анализировать (измерять) сигнал и сортировать. Для flow-FISH используется клеточная суспензия (для измерение длины теломеров хромосом), хромосомные спреды и выделенные хромосомы (для дальнейшего картирования). Как и в Q-FISH, используются PNA-меченые теломерные зонды (например, для визуализации и измерения длины теломерных повторов) Главное преимущество – более быстрый метод (анализ/сортировка большого количества клеток/хромосом). Широко применяется для исследования разных проблем: старения, сохранение теломер, исследование суспензий гемотопоетических стволовых клеток ex vivo, исследование бактерий.

Multiparametric analysis allows for differentiation of cell types within one sample, allowing for internal control, and analysis of leukocyte subtypes.

Преимущества flow-FISH: Легко воспроизводимый результат Возможность анализировать подгруппы клеток в популяции используя физические иммунофлюоресцентные и маркеры Лучшая производительность, чем в Q-FISH Возможность получать количественные данные по флюоресценции тысяч клеток.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ХРОМОСОМ с помощью методов проточной цитометрии 1. Сортировка хромосом с помощью проточной цитометрии - Кариотипирование с помощью проточной цитометрии используется для дальнейшего картирования генов и построения хромосомных библиотек. - Идентификация и локализация генов на сортированных хромосомах производится с последующим применением методов FISH/ метода PRINS (primed in situ labeling) или его вариаций и хромосом-специфической ПЦР. - К 2011 г. успешно сортированы пока только хромосомы 17 видов культивированных растений. - Сортировка метафазных или пахитенных хромосом с высоким индексом деления.

Флуоресцентная метка: - Хромосомы метятся флуорохромами, специфичными к нуклеиновым кислотам. - Флюорохромы выбираются в соответствии 1) со специфичностью к азотистыми основаниями, 2) с условиями эксперимента (в том числе учитывая длины волн имеющихся лазеров). 1. Для моновариантного анализа используют краски, не специфичные к A-T или G-C парам: propidium iodide(пик возбуждения: 535 нм, эмиссии: 617 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) ethidiumbromide (пики возбуждения: 300 и 520 нм, эмиссии: 600 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) Данные метки красят ДНК не зависимо от содержания A, G, T или Cазотистых оснований. 2. Для бивариантного анализа используют: chromomycin (специфичен для G-C пар оснований), пик A 3 возбуждения: 458 нм, эмиссии 580 нм. Лазер: , 458 нм минимум 400 м. В мощность. Hoechst 33258(специфичен для A-T пар оснований), возбуждение: 351 -364 нм, эмиссия: 470 нм. Лазер: 351 -364 нм (мощный). Лазеры должны быть разделены во времени и пространстве из-за частичного перекрытия спектров флюорохромов.

2. Исследование хромосом/ нуклеотидных последовательностей после сортировки (для построения физических и генетических карт и т. п.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Исследование больших геномов с длинными хромосомами. Картирование последовательностей с большим количеством повторов (пр: теломерных и центромерных участков). Использование коротких зондов. Благодаря большому количеству повторов сигнал сильный. Стандартная величина зонда: 15 – 30 нуклеотидов. FISH

Проблемы FISH: Сложно локализовать однолокусные последовательности ДНК (т. е. неповторяющиеся уникальные последовательности ДНК), т. к. при использовании стандартных коротких зондов сигнал будет очень слабым. Увеличение длины зонда до нескольких килобаз для усиления сигнала приведет к снижению чувствительности и => к неспецифическому связыванию. Решение: BAC-FISH -BAC-FISH – комбинация метода FISH и использования клонов геномной ДНК, встроенной в бактериальные искусственные хромосомы (BAC), позволяющие встраивать большие последовательности ДНК. -Эффективный метод для идентификации и картирования отдельных хромосом организмов с небольшими геномами. В качестве зонда используется BAC-зонды, overgos (overlapping oligonucleotides).

Альтернатива FISH: PRINS PRINS (primed in situ labeling) – способ мечения хромосом с помощью отжига олигонуклеотидного ДНК-праймера с гомологичной последовательностью денатурированной хромосомной ДНК и последующего энзиматического удлинения праймера in situ мечеными нуклеотидами. Впервые описан Koch et al. в 1989 г. (Koch, J. E. , Kølvraa, S. , Petersen, K. B. , Gregersen, N. , and Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259– 265). PRINS является альтернативой FISH. Применяется для локализации нуклеотидных последовательностей, распознавания и подсчета метафазных или интерфазных хромосом или хромосомных пар (в т. ч. хромосомной анеуплоидии). отжиг немеченого праймера (праймер – затравка) с исследуемой ДНК элонгация затравки с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и меченых нуклеотидов остановка реакции (присоединение блокирующей молекулы на 3’ -конец) Праймер: фрагмент рестрикции ПЦР-продукт олигонуклеотид Мечение нуклеотидов: - прямое (флюорохромами) - непрямое (biotin/ dig флюорохромконъюгированный avidin/ anti-dig) - В результаты каждой PRINS реакции можно идентифицировать только одну пару гомологичных хромосом (одну хромосому). Следующую реакцию PRINS на том же стекле можно проводить только после блокировки предыдущей. - Применяется для последовательностей ДНК с большим количеством повтором.

Преимущества PRINS: 1. Требуется минимальная информация о последовательности, необходимая для синтеза олигонуклеотидного праймера. 2. Наиболее быстрый и простой метод детекции интересующей нас последовательности на хромосоме (по сравнению с использованием тяжелых зондов для FISH, гибридизующихся очень большой промежуток времени). 3. Исключение стадии мечения зонда. 4. Возможность элонгировать праймер мечеными нуклеотидами для усиления c-PRINS сигнала при детекции коротких уникальных последовательностей. Для выявления малокопийных повторов или коротких уникальных последовательностей применяется более чувствительный метод – cycling PRINS (c -PRINS). C-PRINS предложен Gosden et al. в 1991 г. , улучшенный широко используемый протокол – Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localisation of DNA sequences on plant chromosomes using PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71 -82). C-PRINS включает в себя серию термальных циклов, аналогичных ПЦР.

Sheath fluid for FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033 -41) -Mg. So 4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, № 2: 99 -103) -autoclaved 0. 1% (wt/vol) Na. Cl -50 m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823– 829) -Chromosome-stabilizing polyamine buffer (protein-containing sheath fluid) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2 nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Флюоресцентная гибридизация in situ

Флюоресце́нтная гибридиза́ция in situ , или метод FISH (англ. Fluorescence in situ hybridization - FISH ) - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ . Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани . В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Зонды

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды , меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин - при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3-4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР -реакции, меченые олигонуклеотиды , а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции .

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флюоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида , что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов - эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Литература

• Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий. Глава в книге «Введение в молекулярную диагностику» Т. 2. «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний» / Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. Учебная литература для студентов медицинских вузов. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Флюоресцентная гибридизация in situ" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. гибридизация. Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности… … Википедия

Метод определения флуоресцентная гибридизация in situ.

Исследуемый материал Смотрите в описании

Доступен выезд на дом

Исследование применяется для подбора индивидуальной адъювантной химиотерапии при раке молочной железы или при раке желудка.

Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний у женщин. Клетки опухолей молочной железы могут содержать различные типы рецепторов, которые чувствительны к определенным веществам (гормонам или другим биологически активным молекулам). В зависимости от наличия в опухолевых клетках рецепторов гормонов (эстрогенов и прогестерона) или рецептора эпидермального фактора роста человека тип 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2), выделяют гормон-рецептор-положительный, HER2-положительный и тройной негативный РМЖ. Это важно учитывать при индивидуальном подборе терапии и для прогноза успеха лечения.

HER2 - это рецептор, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования и низкую эффективность некоторых видов лечения. Гиперэкспрессия HER2 при некоторых подтипах РМЖ ведет к усилению пролиферации и ангиогенеза, а также к нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). В настоящее время имеются препараты, мишенью которых является рецептор HER2. Это, в частности, герцептин (трастузумаб), представляющий собой моноклональные антитела против HER2/neu рецепторов.

Амплификация и гиперэкспрессия онкогена HER2 (ЕrbB-2) являются относительно специфическими событиями для карциномы молочной железы и практически не встречаются в опухолях других локализаций. Рак желудка (РЖ) – одно из немногих исключений: активация HER2 отмечается примерно в 10-15% случаев злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания. При HER2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток может присутствовать избыток HER2-рецепторов (что обозначается как положительный HER2-статус, или положительный герцепт-статус). Это явление наблюдается у 15-20% женщин, страдающих РМЖ. Оценка HER2-статуса важна для определения тактики лечения.

Основные стандартизованные методы выявления гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu – иммуногистохимический (ИГХ) метод и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Оба исследования проводятся на гистологических препаратах (срезах материала опухоли, залитого в парафин) с использованием поликлональных антител (ИГХ), флуоресцентных зондов (FISH) и разных систем визуализации.

При оценке результатов ИГХ-реакции учитывается экспрессия только в инвазивном компоненте опухоли. Оценка результатов реакции проводится с помощью балльной шкалы: 0, 1+, 2+, 3+, разработанной производителем теста и получившей одобрение экспертов. Герцепт-статус, оцененный как 0 и 1+, следует считать негативным – гиперэкспрессия белка отсутствует, что соотносится с отсутствием амплификации его гена. Герцепт-статус, оцененный как 3+, является позитивным, т. е. гиперэкспрессия белка присутствует, что соотносится с наличием амплификации гена. Герцепт-статус 2+ считается неопределенным, т. е. по экспрессии белка, определенной на основании иммуногистохимической реакции, нельзя уверенно судить об амплификации гена, поэтому требуется исследование, прямо выявляющее наличие или отсутствие амплификации. FISH-метод применяют на срезах с того же образца (блока), на котором проводилось иммуногистохимическое исследование. При FISH-гибридизации оценку наличия амплификации гена HER2 проводят путем подсчета соотношения красных флуоресцентных (соответствующих помеченным генам HER2) и зеленых флуоресцентных сигналов, которыми помечен центромерный участок 17-й хромосомы. Соотношение больше 2 свидетельствует о наличии амплификации HER2. Метод FISH является более чувствительным, чем ИГХ, так как позволяет напрямую оценивать наличие или отсутствие амплификации.

Материал для исследования: парафиновый блок с биоптатом опухоли.

Внимание! ОБЯЗАТЕЛЬНО:

• предметное стекло с ИГХ-окрашиванием с антителами к HER2/neu
• направление от врача или выписка с результатами гистологического и ИГХ-исследования с антителами к Her-2/neu

Литература

• Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Морфологическое исследование HER2 статуса. Методика и атлас. - М.: Изд. «Media Medica». 2006:98.
• Злокачественные заболевания в России в 2011 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. 2013:289.
• Онкология. Клинические рекомендации. Ассоциация онкологов России. Под ред. В.И. Чиссова, С.Л. Дарьяловой. - М.: Изд. «ГЭОТАР-Медиа». 2008:702.
• Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010;376:687-697.
• Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications. Elsevier, 4-th Edition. 2013:960.
• Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base № 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr.
• Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann В., Senn H.J. Meeting Highlights: International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2005. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
• Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. WHO Classification of Tumours of the Female Reproductive Organs. WHO Press, 4-th Edition. 2014;4:316.
• NordiQC. http://www.nordiqc.org.
• Park D.I., Yun J.W., Park J.H. et al. Her2/neu amplification is an independent prognostic factor in gastric cancer. Digestive Diseases and Sciences. 2006;51(8):1371-1379.
• Slamon D. et al. Adjuvant Trastuzumab in HER2-Positive Breast Cancer. The New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.