蛍光insituハイブリダイゼーション。蛍光insituハイブリダイゼーション（FISH）

場合によっては、細胞遺伝学的研究では核型について結論を出すのに十分ではありません。これらの場合、分子細胞遺伝学的方法、特に蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）が使用されます。

主に核酸のinsituハイブリダイゼーションに基づく分子細胞遺伝学の新技術の出現により、染色体診断の可能性が大幅に拡大しました。インサイチュハイブリダイゼーション法は、特定のDNA配列を細胞学的調製物に直接局在化するために開発されました。染色体と染色体領域の同定には、染色体の細胞学的組織の分析から、それらを構成するDNA配列の分析への移行がありました。示差的染色体染色などの染色体再配列を検出および分析するための古典的な細胞学的方法の有効性を最新の分子細胞遺伝学的技術と比較すると、血液障害では、染色体の細胞学的分析が、スペクトル核型分析（SKY）..。再配列の約3分の1は細胞学的方法によって誤って識別され、3分の1は完全に見過ごされています。細胞遺伝学的分析の古典的な方法は、SKYによって同定された染色体再配列の約15％しか明らかにすることができません。

FISH法では、蛍光分子を使用して、invivoで遺伝子または染色体を染色します。この方法は、遺伝子をマッピングし、染色体異常を特定するために使用されます。

この手法は、プローブと呼ばれる、研究対象のDNA配列に相補的な短いDNA配列の準備から始まります。プローブは相補的DNA領域にハイブリダイズ（結合）し、蛍光標識で標識されているため、DNAまたは染色体内の目的の遺伝子の局在を確認できます。活発な細胞分裂を必要とする染色体を研究する他の方法とは異なり、FISHは非分裂細胞で実行できるため、方法が柔軟になります。

FISHは、次の3種類のプローブを使用してさまざまな目的に使用できます。

*染色体の特定の領域に結合する遺伝子座特異的プローブ。これらのプローブは、単離されたDNAの利用可能な短い配列を特定するために使用されます。これは、標識プローブの調製と、それに続く染色体セットとのハイブリダイゼーションに使用されます。
*アルフォイドまたはセントロメア反復プローブは、染色体のセントロメア領域の反復配列です。彼らの助けを借りて、各染色体を異なる色で着色することができます。これにより、染色体の数と通常の数からの逸脱をすばやく判断できます。
*染色体全体のプローブは、染色体の個々の領域に相補的な小さなプローブのセットですが、通常は染色体の全長をカバーします。このようなプローブのライブラリを使用すると、染色体全体を「着色」し、個体の微分スペクトル核型を取得することができます。このタイプの分析は、ある染色体の一部が別の染色体の肩に移されるときに、転座などの染色体異常を分析するために使用されます。

蛍光insituハイブリダイゼーション（FISH）

研究の材料は、血液、骨髄、腫瘍生検、胎盤、胚組織、または羊水です。研究用のサンプルは、新鮮な状態で研究室に届ける必要があります。スライド（スライド）は、組織サンプルから直接、または培養後に調製されます。中期および間期の細胞調製物の両方を使用することができます。蛍光標識された特定のDNAプローブは染色体DNAにハイブリダイズし、複数のプローブを異なる遺伝子座で同時に使用できます。

FISHは、欠失（微小欠失を含む）、転座、倍加、異数性などの定量的および定性的な染色体異常を検出するための細胞遺伝学的分析の有用で感度の高い方法です。間期染色体上のFISHは、トリソミー21、18、または13染色体または性染色体異常の出生前診断のための迅速な方法です。腫瘍学では、FISHは血液学的悪性新生物に関連するさまざまな転座（bcr / abl、MLL、PML / RARA、TEL / AML1）を検出できます。この方法は、化学療法および骨髄移植後の癌の残存効果を監視し、一部の腫瘍の予後不良に関連する癌遺伝子の増強（c-myc / n-myc）を特定するためにも使用できます。 FISHは、異性の個人から得られた骨髄同種移植片の生存率を監視するためにも使用されます。

FISHは、染色体異常を特定し、大きな（> 500）細胞数をワンステップで迅速に分析するための高感度な方法です。この方法は、染色体の性質と染色体DNAの未知の断片を特定するのに非常に正確です。

伝統的な細胞遺伝学核型を研究するとき、それは常にバンド解像度レベルによって制限されていました。高解像度の染色体微分染色法を使用しても、染色体上でより多くのバンドが検出されただけでしたが、分子レベルの解像度に到達しているかどうかはわかりませんでした。 DNA技術と細胞遺伝学の最近の進歩により、FISH法を使用して染色体DNAの変化を分子レベルで分析することが可能になりました。分子細胞遺伝学は、細胞遺伝学に革命的なブレークスルーをもたらし、以下を可能にしました。

10〜100キロベースの範囲のDNA染色体の構造を分析します。
出生前診断および着床前遺伝子診断（PGD）に大きな影響を与えた非分裂間期細胞の診断を実施する。

FISHテクノロジー染色体内の特定のDNA配列に結合またはアニーリングするDNAプローブを使用します。変性したプローブは、細胞のネイティブDNAとインキュベートされ、これも一本鎖状態に変性します。プローブは、ビオチン-デオキシウリジン三リン酸またはジゴキシゲニン-ウリジン三リン酸をチミジンに置き換えます。ネイティブDNAプローブをプローブで再生した後、ビオチンに結合する蛍光色素標識アビジンまたは蛍光色素標識抗ジゴキシゲニンを添加することにより、プローブ-DNA複合体を検出できます。シグナルの追加の増幅は、アンチアビジンを添加し、蛍光顕微鏡を使用して得られた複合体を研究することによって得ることができます。異なるDNAプローブをいくつかの異なる蛍光色素でマーキングすることにより、1つの細胞内の複数の染色体または染色体セグメントをマルチカラー信号の形で同時に視覚化することができます。

決定の可能性 特定の遺伝子セグメント、染色体上に存在するか存在しないかにより、DNAレベルで遺伝子配列症候群を診断すること、および間期核、多くの場合個々の細胞での転座を診断することが可能になりました。

の材料魚分裂中の細胞から得られた中期染色体、または分裂の段階にない細胞からの間期核のいずれかである可能性があります。切片をRNaseおよびプロテイナーゼで前処理してRNAを除去します。RNAはプローブおよびクロマチンとクロスハイブリダイズする可能性があります。次に、ホルムアミド中で加熱してDNAを変性させ、氷冷アルコールで固定します。次に、プローブを加熱することによりハイブリダイゼーション用に準備する。その後、プローブと染色体調製物を混合し、ハイブリダイゼーションのために37℃でカバースリップで密封します。ハイブリダイゼーション溶液のインキュベーション温度または塩組成を変えることにより、結合特異性を高め、バックグラウンド標識を減らすことができます。

蛍光insituハイブリダイゼーションの応用-FISHテクノロジー

FISHテクノロジーの効率上の遺伝子の局在化で最初に実証されました。蛍光標識法の導入により、従来のバンディング法では検出されなかった染色体異常の診断には、insituハイブリダイゼーションが不可欠であることが証明されました。 FISHはまた、現代の遺伝学における最も驚くべき発見の1つであるゲノム刷り込みにおいて重要な役割を果たしました。

その開発技術魚 3つの形式で受け取りました。セントロメアまたはアルファサテライトプローブは、相対的な染色体特異性を特徴とし、間期細胞の遺伝学で最も頻繁に使用されます。これらのプローブは、セントロメア領域で適切な強度のいくらか拡散したシグナルを生成しますが、同様のセントロメア配列を持つ染色体とクロスハイブリダイズしません。現在、染色体の特定のバンドから離散信号を出し、クロスハイブリダイゼーションの現象を回避することを可能にするシングルコピープローブが開発されています。これらのプローブは、おそらく特定の症候群に関連する染色体のコピー数と特定の領域を決定するためにも使用できます。 13番染色体、18番染色体、21番染色体、X番染色体およびY番染色体用に設計されたシングルコピーおよびセントロメアプローブは、出生前診断に使用されます。

染色体全体を「染色」することも可能です。魚..。異なる蛍光色素の混合物を使用するスペクトル核型分析技術のおかげで、24の別々の色で個々の染色体ごとに固有の蛍光パターンを作成することが可能になりました。この技術は、従来の細胞遺伝学的手法を使用した場合には見えない複雑な染色体再配列を決定することを可能にします。

方法魚出生前診断で。生殖年齢の高い女性にとって、妊娠は不安よりも喜びの原因ではありません。女性の年齢とともに、胎児の染色体異常を発症するリスクが関連付けられています。妊娠16週目に羊水穿刺を行い、その後核型分析を行うには、10〜14日かかります。予備検査でFISHを使用すると、診断をスピードアップし、待ち時間を短縮できます。ほとんどの遺伝学者や研究所は、妊娠の将来の管理について決定を下すためにFISH法を単独で使用すべきではないとの意見です。 FISH法は核型分析によって補完されなければならず、その結果は少なくとも母親の血液に基づく超音波検査（US）または生化学的スクリーニングの病理学的画像と相関している必要があります。

遺伝子症候群 シーケンス微小欠失症候群、または分節性異数性症としても知られています。これらは隣接する染色体断片の欠失であり、通常は多くの遺伝子が関与しています。遺伝子配列症候群は、古典的な細胞遺伝学的手法を使用して1986年に最初に記述されました。現在、FISHのおかげで、DNAレベルで超顕微鏡的欠失を特定することが可能であり、これにより、クリティカル領域と呼ばれる特定の症候群の発症に関連する最小の欠失領域を特定することが可能になりました。症候群の重要な領域が特定されると、特定の遺伝子を特定することが可能になることが多く、その遺伝子がないと、症候群に関連していると認識されます。最近公開された遺伝子配列症候群のマニュアルでは、14の染色体に関連する18の欠失および微小欠失症候群が報告されています。最も一般的な遺伝子配列症候群のいくつかとそれらの臨床症状を表に示します。 5-2。

テロメア-染色体の長い腕と短い腕の端を覆う形成。それらは反復的なTTAGGG配列で構成されており、染色体の末端が互いに融合するのを防ぎます。テロメアプローブは、従来の細胞遺伝学的方法では検出できない複雑な転座の認識において重要な役割を果たします。さらに、ヒトゲノムプロジェクトの発見の1つは、テロメアに隣接する染色体の領域が遺伝子に富んでいるという事実でした。現在、超顕微鏡的サブテロメア欠失が多くの遺伝的に決定された疾患の発生の原因であることが示されています。

核酸のinsituハイブリダイゼーションこの方法は、一本鎖配列（リボまたはデオキシリボ、オリゴまたはポリヌクレオチド）および標的におけるそれらの相補的配列に基づいて人工的に作成された標識プローブ間で二本鎖ハイブリッドを形成する可能性に基づく。 -分析されたDNAまたはRNA分子。ハイブリダイゼーションの領域を特定するために、DNAサンプル（DNAプローブ）はレポーターグループでラベル付けされます：ü放射性同位元素、ü蛍光色素、ü色または発光生成物を与える酵素、üラベル付けされた体が結合するハプテン、等

プローブ内にレポーターグループが存在するためにハイブリッドを検出することにより、特定のタイプのRNAをコードする遺伝子の数を推定し、ゲノム内の転写されていないDNAの割合を決定し、リンケージを確立することができます。特定の遺伝子の相互の関係-および染色体上のそれらの正確な位置。分子ハイブリダイゼーションの方法は、感度が高く（少量の標識プローブ（10-15および10-19 M）を検出できるため、ターゲット内の相補配列を検出できます）、分析が迅速であるため、この方法は、研究活動と、医学、獣医学、植物栽培における遺伝性および感染症の診断の両方に使用できます。

主に核酸のinsituハイブリダイゼーションに基づく分子細胞遺伝学の新技術の出現により、染色体診断の可能性が大幅に拡大しました。

間期細胞遺伝学：1。多色染色体バンディング（MCB）。 2.蛍光insituハイブリダイゼーション（FISH）。 3. FISHと他の方法の組み合わせ：-細胞診+ FISH; -組織学+魚; -免疫表現型検査+ FISH（FICTION）; 中期細胞遺伝学：1。全体の絵。 2.比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）。 3.色変化核型分析（CCK）。 4.多色核型分析：スペクトル核型分析（SKY）。マルチカラーFISH（M-FISH、M-BAND）。

FISH-蛍光insituハイブリダイゼーションは、染色体、m。RNAなどの特定のDNA配列を検出および局在化するために使用される細胞遺伝学的方法です。この方法は、蛍光標識されたDNA / RNAプローブと相補的なDNA / RNA配列のハイブリダイゼーションに基づいています。ラベルは、蛍光顕微鏡を使用して識別されます。 FISHメソッドは30年以上前に導入されました。染色体上の遺伝子を物理的にマッピングする方法として広く受け入れられるようになりました。その後、他の研究分野（臨床遺伝学、生殖医学、毒物学、進化生物学、比較および細胞ゲノミクス、染色体生物学の分野）に適用されました。現在、FISHは主に染色体の物理的および遺伝的地図を作成し、間期および中期染色体の構造的再配列、転座、微小欠失、遺伝子増幅を特定するために使用されています。科学の発展（核酸とクロマチンの化学的および物理的特性のより良い理解）、ならびに蛍光顕微鏡学およびデジタルイメージングの発展の結果として、方法は絶えず改善されてきました（感度、特異性、解像度の改善）、およびこの方法の多くのバリエーションが開発されています。

1）細胞をスライドガラスに落とし、染色体を広げます。4）DAPIを使用して染色体を対比染色します。2）蛍光標識プローブを染色体上に置き、密封します。 3）プローブと染色体を変性させ、ハイブリダイズさせてから洗浄します。5）スライドを蛍光顕微鏡で観察します。

FISHを病期分類するためのプロトコルの一般的な見解は、以下のように提示することができます。1。組織学的または細胞学的標本の調製。組織学的標本の準備は、標準的なスキームに従って実行されます：切断、マーキング、配線、充填、ミクロトーム、スライドガラス上への切片の配置、および脱ロウ。細胞学的調製物を調製する際には、特別な沈殿溶液と遠心分離が使用され、細胞の濃縮懸濁液を得ることができます。 2.前処理（必要な場合）。薬剤はプロテアーゼで処理され、ハイブリダイゼーションを妨げるタンパク質の存在を排除します。 3.調製およびその後の変性へのDNAプローブの適用。プローブとサンプルDNAを変性させるために、それらをホルムアミドで処理し、約85〜900℃の温度に加熱します。

4.ハイブリダイゼーション。変性後、調製物を特定の温度（臨床試験の場合は370℃）に冷却し、加湿チャンバー内で数時間インキュベートします（インキュベーション時間は各特定のプロトコルに示されています）。現在、自動ハイブリダイザーは変性とハイブリダイゼーションに使用されています。 5.フラッシング。ハイブリダイゼーションが完了した後、結合していないプローブを洗い流す必要があります。そうしないと、FISH分析の結果を評価するのが困難になるバックグラウンドが作成されます。すすぎには、通常、クエン酸塩と塩化ナトリウム（SSC）を含む溶液が使用されます。 6.カウンターステイン。すべての核DNAは、蛍光色素（DAPI-4、6-ジアミジン-2フェニルインドール;ヨウ化プロピジウム）を使用して染色されます。 7.蛍光顕微鏡を使用した結果の分析。日常の操作（脱ロウ、前処理、洗浄）を自動化できます。

蛍光顕微鏡を使用したテロメア領域の研究。間期（核）と中期（別々の染色体）の段階で得られた画像を組み合わせます。青色-DAPI。

FISH法の利点：1。間期核の遺伝物質を研究する能力。 2.「はい/いいえ」の原則に従って客観的な結果を得るのは定量的方法です; 3。結果の比較的簡単な解釈;高解像度。FISH法の欠点：1。蛍光色素はすぐに「退色」します; 2。高-結果を分析するには、高品質の蛍光色素が必要です。顕微鏡。

FISH法は、限られたサイズのヌクレオチド配列である特別な技術を使用して作成されたDNAプローブと、研究中の細胞遺伝学的調製物の核DNAの相補部分との間のハイブリダイゼーション反応に基づいています。 FISHの主要要素であるDNAプローブには「タグ」が付いています。つまり、蛍光色素または蛍光色素を運ぶ抗体でさらに視覚化するためのハプテンに直接関連するヌクレオチドが含まれています。結合していない標識DNAを洗い流し、次にハイブリダイズしたDNAプローブを蛍光顕微鏡で検出します。

DNA標識は直接と間接に分けられます。レポーターエレメントのDNAへの直接標識の導入---蛍光色素（ローダミン、ジエチルアミノクマリン、テキサスレッドなど）。間接標識法-DNAサンプルは中間リガンド（ビオチン、ジオキシゲニン、2,4-ジニトロフェノール）と事前に結合されており、細胞学的調製物上での存在が蛍光色素を使用して検出されます。この場合、リガンドは蛍光色素と相互作用するためのいくつかの部位を含むことができるため、メソッドの感度は大幅に向上します。 32P標識プローブとのinsituハイブリダイゼーションが1969年に初めて報告されました。 DNAプローブを標識および検出するための非放射性システムの開発により、insituハイブリダイゼーション法は安全で、実装が簡単で、結果の処理にかかる労力が少なくなりました。蛍光色素は柔らかくて使いやすく、無期限に保存でき、高解像度が得られ、複数のDNA配列を同時に検査できます。

プローブ：一本鎖/二本鎖DNA / RNA一次/二次標識プローブ。プローブは次のように標識されます：1）直接：蛍光色素が付着しているヌクレオチドを挿入することにより（PCRまたはニックトランスレーション）2）蛍光標識抗体が付着しているレポーター分子（例：ジゴキシゲニン、ビオチン）を介して。シグナルを増幅するために、蛍光標識で標識された二次、三次などの抗体を使用できます。 DNase nicks DNA Nick TranslationDNAポリメラーゼIは3 'ヒドロキシルDNAポリメラーゼに新しいヌクレオチドを追加しますIは5'末端から個々の塩基を除去します染色体の視覚化：DAPI（2 mg / ml）を使用します。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール; A-TリッチDNA領域への強い結合; UV光による励起; 発光461nm（青）。

現在、現代の分子細胞遺伝学で広く使用されているいくつかの主要なアプローチがあります。拡張された染色体領域と染色体全体の材料の同定。関心のある領域での特定のDNA配列の検出。個々の染色体領域の不均衡の分析。染色体特異的および領域特異的DNAプローブ（「ペインティングプローブ」）は、拡張された染色体領域および染色体全体の材料を識別するために広く使用されています。

さまざまなタイプのプローブの特徴1.遺伝子座固有の識別子（LSI-遺伝子座-染色体の特定の領域に結合する特定の識別子）これらのプローブは、使用される単離されたDNAの利用可能な短い（非反復）配列を識別するために使用されます標識されたプローブとそれに続く染色体のセットとのハイブリダイゼーションを準備します。それらは、さまざまな病的状態（個々の染色体の一染色体およびトリソミー）における診断的および予後的に重要な染色体異常を検出するように設計されています。これらのサンプルの最も広い分布は、出生前の細胞遺伝学的診断、特に絨毛組織の細胞、羊膜細胞の間期核の研究で得られました。

2. DNA-染色体のテロメア領域へのプローブ（TELテロメアプローブ）は、染色体の腕の端に影響を与える欠失と再配列を検出するように設計されています。このようなプローブは、染色体のpアームまたはqアームに特異的であり、長さが約300kbの領域に相補的です。染色体の終わりから。原則として、染色体の短いアームと長いアームのDNAプローブは、異なる蛍光色素に関連付けられています。これにより、1つの細胞遺伝学的調製物で染色体の両方のテロメア領域を特定できます。

3.セントロメアプローブ-リピート、アルフォイドまたは染色体分子（CEP-セントロメア。列挙。プローブ）は、タンデムアルファおよびベータサテライトリピートのシーケンスによって表される染色体特異的DNAプローブです。これらのリピートは、主に染色体のセントロメアまたはセントロメア周辺のヘテロクロマチン領域にあります。彼らの助けを借りて、各染色体を異なる色に着色することができます。これにより、染色体の数と通常の数からの逸脱をすばやく判断できます。4。染色体全体のプローブ、染色体全体のプローブ（WCP-Whole-Chromosome-Paintingは、染色体の個々の部分に相補的な小さなプローブのセットですが、通常はその全長をカバーします。このようなプローブのライブラリを使用すると、染色体全体を「着色」し、個体の微分スペクトル核型を取得することができます。このタイプの分析は、ある染色体の一部が別の染色体の肩に移されるときに、転座などの染色体異常を分析するために使用されます。

適用分野FISHは、以下の臨床診断タスクを解決するために広く使用されています。1。出生前の移植および染色体異常の診断。体外受精（IVF）クリニックや周産期センターで使用されています。体外受精の場合は胚着床前、または胎児の発育の初期段階で、胎児の遺伝性疾患をタイムリーに特定し、必要な措置を講じることができます。 2.腫瘍血液学。腫瘍血液疾患はさまざまな染色体異常の結果として発生するため、適切なCEPおよびLSIプローブを使用してそれらを診断します。 3.固形腫瘍の診断。現在、特定の腫瘍性疾患の発症とそれらに特有のゲノムの変化との間に、ますます多くの因果関係が確立されています。したがって、適切なDNAプローブを使用して、腫瘍学的FISH診断を実行できます。

間期細胞遺伝学：FISHと他の方法の組み合わせ：-FISH免疫表現型検査（FICTION）; + FICTION（新生物の調査のためのツールとしての蛍光免疫表現型検査および間期細胞遺伝学）-腫瘍細胞の研究用。この検査では、血液、骨髄、またはその他の組織標本の染色されていない塗抹標本が使用されます。ステージ1-調製物を特定のモノクローナル抗体とインキュベートし、ステージ2-フルオロフォアとの結合を実行して、抗原-モノクローナル抗体複合体のその後の可視化を行います。ステージ3-DNAプローブとのinsituハイブリダイゼーションを実行します。モノクローナル抗体とDNAプローブを検出するために、色の異なるフルオロフォアが使用されます。必要なフィルターのセットの存在下で蛍光顕微鏡下で調製物を研究することにより、ハイブリダイゼーションの免疫表現型と間期核におけるシグナルの同時分析が可能になります。

cにおけるTNFAIP3の染色体欠失。相間細胞遺伝学によって検出されたHL。のフィクション分析。代表者c。 HLケースの組み合わせ。 CD 30の発現（赤）およびTNFAIP 3および第6染色体セントロメアのFISHプローブ（青[b]）。 A – CおよびEとFの2色アッセイでは、TNFAIP 3プローブは緑色（g）でラベル付けされています。 Dで適用されたトリプルカラーアッセイでは、TNFAIP 3プローブはg /オレンジの共局在（co）シグナルを示します。 CD 30免疫蛍光抗体法と組み合わせて、2色および3色のFISHアッセイを表示するために2つの異なる戦略が使用されます。私。 e。、2色アッセイ（A – CおよびEおよびF）は3色ディスプレイを使用して表示されますが、Isisソフトウェアによって取得された偽の多色ディスプレイは3色アッセイ（D）に適用され、4色を同時に表示します（すなわち、CD 30 [r]、TNFAIP 3 [g]とオレンジ、および染色体6セントロメア[b]）。

ミクロ画像のデジタル記録は、フルオロフォアの組み合わせを疑似色に変換するだけでなく、それらの比率、強度も変換する可能性を開きました。

マルチカラー染色体染色（Muli。ColorBanding-MCB）この方法は、すべての染色体を完全に分析することを目的としたものではなく、個々の染色体を詳細に分析することを目的としています。遺伝子座特異的DNAプローブは、異なるフルオロフォアまたはフルオロフォアの組み合わせで標識されているため、各DNAプローブのシグナルレベルの強度は異なります。 DNAプローブのシグナルの強度プロファイルのオーバーラップは、染色体に沿ったさまざまなフルオロフォアの蛍光強度の比率の変化を提供します。強度比は疑似色に変換できるため、画像の各ポイント、したがって各染色体遺伝子座は独自の疑似色を持ちます。マルチカラーFISH法のこの変種は、癌の染色体間だけでなく染色体内再配列の分析にも非常に効果的であることが証明されました。ただし、アプリケーションを成功させるには、最初に検査する染色体を決定する必要があります。この分子細胞遺伝学の方法は、特定の染色体に関連する核型異常の分析に適しています。

現在までに、すべてのヒト染色体にMSVを提供するDNAプローブのセットが作成されています。5番目のヒト染色体のマルチカラーバンディング（図Meta。SystemsGmb。H）（染色体5の領域特異的DNAライブラリーのinsituハイブリダイゼーション; 5番染色体上の領域特異的DNAライブラリー; 5番染色体の多色バンディング; 5番染色体のイディオグラム; MCVに使用される蛍光色素）。

歴史的に間期よりも早く出現した中期細胞遺伝学は、広範囲の染色体異常を決定することを可能にしますが、これは研究中の細胞が減数分裂中期の段階にあることを必要とします。

マルチカラー核型分析分析は、腕または染色体全体を連続的に染色するためのDNAプローブ（WCPプローブ-染色体全体のペイント）を使用して実行されます。このようなプローブは、染色体の全長に沿って配置された多数の短いDNA配列にハイブリダイズします。したがって、蛍光顕微鏡で調べると、染色体は特定の色で均一に着色されているように見えます。

この分析に使用されるDNAプローブは、いくつかの蛍光色素の組み合わせを使用して標識された、ヒト染色体の完全なセットの固体染色プローブの混合物で構成され、その比率は染色体の各ペアに対して個別に選択されます。画像の各ポイントのすべての蛍光色素の蛍光強度を評価する画像分析のための適切な登録方法とコンピュータプログラムの使用により、染色体の各ペアが独自の「疑似色」を持つ核型分析が可能になります。

M-FISH（マルチターゲットマルチフルオルマルチカラーまたはマルチプレックス。FISH）は、蛍光色素固有のフィルターキットを使用する従来のマルチカラーFISHの総称です。 M-FISHの原理は、使用されているすべての蛍光色素の信号を個別にデジタル登録することで構成されています。これは、フィルターセットを連続して交換することで実現されます。すべての画像は別々のファイルに記録されます。これにより、信号とバックグラウンドの分離に関連する効率的な処理、および信号の定量的評価が可能になります。特別なソフトウェアを使用して記録されたすべての情報を処理すると、画像の各ポイントでの蛍光色素信号のレベルに関する情報が疑似カラーに変換されます。使用されるDNAプローブの数に関する主な制限の1つは、利用可能な蛍光色素の数、重複しない励起および発光スペクトル、および適切なフィルターセットの利用可能性です。

24色の魚M-FISHは、すべてのヒト染色体の材料を同時に識別するための24色の魚として最も広く使用されています。染色体転座の検出には非常に効果的ですが、欠失や逆位を検出するようには設計されていません。しかし、この問題は、DAPIで染色体を同時に染色することで部分的に解決できます。これにより、材料の染色体の所属がすでに特定されている染色体の異なる線条を分析することができます。残念ながら、M-FISH後の染色体のDAPIバンディングの品質は、従来のinsituハイブリダイゼーション後のGTGディファレンシャル染色やDAPIバンディングよりも大幅に劣ることに注意する必要があります。

処方箋。 FISH M-FISHの原理は、ヒト染色体の多色バーコードと種間insituハイブリダイゼーションに基づく多色染色体バンディング法を生成するために使用されてきました。 24色のFISHとは対照的に、この方法では、染色体内再配列の一部を直接検出することができます。 Rxで使用されるDNAプローブ。 FISHは、3つの蛍光色素の組み合わせでラベル付けされ、7つの疑似色になります。それらは染色体の個々の領域を特異的に染色し、それらの色の縞模様を作成します。これは、Rx用のDNAプローブの機能です。 FISHは、それらが取得される方法によって決定されます。それらは2つのテナガザル種の染色体特異的DNAライブラリーです：HylobatesconcolorとHylobatessyndactylus。

テナガザルの現代種の形成中に起こった集中的な染色体再配列の結果として、それらの染色体の材料は、その染色体が保守的であることが知られている人間の染色体の組織と比較して強くシャッフルされていることが判明しました。ヒト1番染色体とギボン染色体の比率を図1に示します。

図2は、Rxの結果として得られたヒト染色体の概観を示しています。魚。 a）中期プレートb）染色体のレイアウト。

ただし、RXFISHにはかなり深刻な制限があります。つまり、1つのカラーRXバンド内で発生した染色体再配列は、このバンドのサイズに有意で簡単に見える変化をもたらさない場合、この方法を使用して検出することはできません。 -プローブは、異なる染色体のいくつかの染色体領域を1つの疑似色で染色します。ただし、使用する蛍光色素の数が増えると、RXFISHメソッドは間違いなく通常の24色FISHよりも有益になります。

RXFISHの利点には、現在、次の点が含まれます。この方法では、1回の多色FISH実験でヒトゲノム全体を分析できます。ラベル付きDNAプローブの市販キットと必要な検出システムが利用可能です。この方法により、染色体内および染色体間の再配列の重要な部分を迅速に特定できます。「カラーバンディング」中期染色体の自動識別が可能です。人間の染色体ごとに固有のカラーバーコードがあります。 RXFISHはCytoワークステーションに統合されています。ビジョンおよび標準的な蛍光顕微鏡システム。

スペクトル核型分析（SKY-スペクトル核型分析）スペクトル核型分析における顕微鏡画像の分析の基本原理は、M-FISHで使用されているものと実質的に同じです。違いは、画像の登録方法に関連しています。 SKYテクノロジーを使用すると、落射蛍光または従来の光学顕微鏡に関連しているかどうかに関係なく、1回の測定ですべての画像ポイントのスペクトル曲線を取得できます。すべてのヒト染色体のスペクトル核型分析には、5つの蛍光色素が使用されます。1つは緑のスペクトル、2つは赤、2つは赤外線です。 DNAプローブのラベリングに使用されるすべての蛍光色素の励起と発光は、1セットのフィルターで行われ、フィルターの連続的な変化、中間の焦点合わせ、およびその結果として、空間画像シフト、しきい値の決定、セグメンテーションマスクなどの関連する問題が回避されます..。。スペクトル曲線の分析に基づいて、特定のポイントでの特定の蛍光色素の有無が決定されます。

次のステップは分類手順です。これにより、分析された材料の染色体の同一性を直接かつ明確に決定できます。これにより、マーカー染色体の材料、およびさまざまな再配列から生じる染色体の派生物の信頼性の高い識別（染色体の精度まで）が提供されます。 SKYの大きな利点は、DAPIカラーがスペクトル画像と平行に記録されることです。 DAPIバンディングソフトウェアの改善により、GTGバンディングに近い品質で異なる縞模様を実現できます。スペクトル画像の並行分析と染色体の定性的示差染色の可能性により、SKY結果の解釈が大幅に簡素化され、染色体切断点のより正確な決定が可能になります。 SKYの疑いのない利点には、励起スペクトルと発光スペクトルが重複する蛍光色素を使用できる可能性があります。これにより、使用に適した蛍光色素のリストが大幅に拡大し、同時に使用できる蛍光色素の数も増えます。 SKYにはスペクトルFISH用の1つのフィルターブロックとDAPI用の1つのフィルターブロックで十分であるため、新しい蛍光色素のリストには、新しいフィルターセットを購入する必要はありません。

SKYの欠点は次のとおりです。-顕微鏡画像の記録に必要な長時間露光。 -比較的小さなDNAプローブで研究を行う必要がある場合、SKYはM-FISHよりも効果がやや劣ります。

色を変える核型分析この方法は、蛍光色素に結合したDNAプローブと抗体を運ぶDNAプローブとハイブリダイズしたDNAサンプル間のシグナル長の違いの分析に基づいています。この方法は、3つのフィルターのみで実行可能であり、特別なカメラやソフトウェアは必要ありません。染色体を特定するために、1回のハイブリダイゼーションが実行され、2つの画像が取得されます。抗体に結合したDNAサンプルの曝露時間は蛍光色素に結合したサンプルの曝露時間より80〜90％短いため、この方法は蛍光シグナルの長さの違いに基づいています。ハイブリダイゼーション反応後、塗抹標本は対応する一次抗体に曝露され、次に視覚化されて、最初の画像が得られます。次に、調製物は、同じ蛍光色素に結合した二次抗体およびアビジンに曝露されます。ストロークは、DAPIを使用して逆染色することができます。

将来的には、3つのフィルターを順番に使用して、準備の画像が再び取得されます。これらの画像は特別なソフトウェアを使用して比較され、特定の抗体に関連する染色体のみが表示される2番目の画像が取得されます。したがって、一部の染色体は最初または2番目の画像でのみ蛍光を発しますが、他の染色体は異なる画像で色が変化します。

比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）この方法は、ゲノムの定量的異常を検出するために開発されました。これは、ゲノム全体をDNAプローブとして使用するinsituハイブリダイゼーション反応に基づいています。分離された正常なドナーDNAは、さまざまな色の蛍光色素で標識されているため、DNAプローブに変換されます。等量のこれらのプローブを混合し、対照の細胞遺伝学的調製物とのハイブリダイゼーションに使用します。 FISH後、中期は蛍光顕微鏡で分析され、専用のコンピューター画像分析プログラムを使用して、各染色体の全長に沿った2つの蛍光色素の蛍光強度が決定されます。

試験サンプルの核型に定量的な変化がない場合、2つの蛍光色素の発光強度の特定の比率が観察されます。遺伝子増幅の場合、対応する蛍光色素のシグナルの強度が増加し、逆に、遺伝物質の一部が失われる場合、それは弱まります。したがって、CGHはゲノムの不均衡を検出できますが、この方法を使用してバランスの取れた転座と逆位を検出することはできません。トリソミーと欠失は、不均衡な領域のサイズが少なくとも1,000万塩基対である場合にのみ決定できます。

試験サンプルの染色体の不均衡は、蛍光比（FR）を計算することにより、2つの異なる蛍光色素の蛍光強度の差によって評価されます。

CGH法には、ゲノム変化を分析する他の方法に比べて多くの利点があります。まず、研究対象の材料の出所に依存せず、アーカイブ材料を含む少量のテスト済みDNAで正常に実行できます。第二に、1回の実験でゲノム全体の遺伝物質のコピー数の減少または増加に関する詳細情報を取得できます。第三に、CGH法は、研究中の組織から中期染色体の調製物を調製する必要がありません。つまり、細胞培養のプロセスや関連するアーティファクトに依存しません。

（GISH）のゲノムsituハイブリダイゼーションは、固定サンプルとのハイブリダイゼーションの場合、生物の1つの種の全ゲノムDNAが蛍光標識プローブとして使用され、全ゲノムが使用されるという事実からなる、situハイブリダイゼーション法の変形です。別の生物種のDNAが競合します。ゲノム、染色体再配列、欠失および置換における種間および種内の違いを決定するために使用されます。

FISHバリエーション1）Q-FISH-定量的FISH：Lansdorpらによって開発されました：U。M。Martens、J。M。Zijlmans、S。S。Poon、W。Dragowska、J。Yui、E。A。Chavez、R。K。Ward、およびP. M.Lansdorp。 1998年。ヒト17番染色体上の短いテロメア。ナットジェネット。 18：76-80。定量的方法。フローサイトメトリーアプリケーション用に設計されています。もともとは、テロメアの繰り返し数を数えることで染色体の長さ（分解能：200 bp）を測定するために使用されていました。 PNAコンジュゲートプローブが使用されます。当初、中期染色体（QFISH自体）を研究しましたが、現在、この方法は間期染色体（IQ-FISH）に適用できます。 Q-FISHは、細胞培養、組織切片（両方ともスライド）で実行されます。現在、Q-FISHは、老化と癌におけるテロメアの役割を研究する上で重要なツールです。

PNA-FISH-ペプチド核酸FISH：ペプチド核酸（PNA）は、窒素塩基をサポートするリン酸デオキシリボースの糖骨格が非荷電ペプチド骨格に置き換えられたDNAの合成類似体です。この構造の結果として、PNAオリゴマープローブが相補的DNA / RNAとハイブリダイズする場合、静電反発は発生しません。 PNA-DNA（PNA-RNA）二重鎖は、天然のホモ/ヘテロ二本鎖よりもはるかに安定しています。 PNA-DNA結合の高い特異性：PNA-DNAハイブリダイゼーションは、DNA-DNAハイブリダイゼーションよりも塩基対のミスマッチに対してはるかに敏感です。したがって、PNAプローブを使用すると、1つの塩基対のみが異なる2つのセントロメアリピートを区別することができます。 PNAは（DNAと比較して）比較的疎水性であるため、PNAは細胞壁を介してよりよく拡散します=>微生物学で広く使用されています。結合の高い特異性に基づく：PNA技術は、insituハイブリダイゼーション用の対立遺伝子特異的プローブを作成するための基礎になるとすぐに信じられています。遺伝学、細胞遺伝学、エピジェネティクス、微生物学などで使用されます。

3）Flow-FISH-フローサイトメトリー用のFISH：1998年に提案：Rufer、N.、Dragowska、W.、Thornbury、G.、Roosnek、E。＆Lansdorp、PMフローサイトメトリーによって測定されたヒトリンパ球亜集団におけるテロメア長の動態。ネイチャーバイオテクノロジー。 16、743-747（1998）。 Q-FISHとフローサイトメトリーを組み合わせて、シグナルを分析（測定）およびソートします。フローFISHの場合、細胞懸濁液（染色体テロメアの長さを測定するため）、染色体スプレッド、および単離された染色体（さらなるマッピングのため）が使用されます。 Q-FISHと同様に、PNA標識テロメアプローブが使用されます（たとえば、テロメア反復長の視覚化と測定）。主な利点は、より高速な方法（多数の細胞/染色体の分析/ソート）です。老化、テロメアの保存、ex vivoでの造血幹細胞の懸濁液の研究、細菌の研究など、さまざまな問題の研究に広く使用されています。

マルチパラメトリック分析により、1つのサンプル内の細胞型の分化が可能になり、内部統制と白血球サブタイプの分析が可能になります。

フローフィッシュの利点：再現性の高い結果物理的免疫蛍光抗体法とマーカーを使用して集団内の細胞のサブグループを分析する機能Q-FISHよりも優れたパフォーマンス数千の細胞の蛍光を定量化する機能。

フローサイトメトリー法を使用した分離染色体の研究1.フローサイトメトリーを使用した染色体の分類-フローサイトメトリーを使用した核型分析を使用して、遺伝子をさらにマッピングし、染色体ライブラリーを構築します。 -ソートされた染色体上の遺伝子の同定と局在化は、FISH / PRINS（プライムインサイチュラベリング）法またはそのバリエーションと染色体特異的PCRのその後の適用で実行されます。 -2011年までに、17種の栽培植物の染色体のみが正常に分類されました。 -分裂指数の高い中期またはパキテン染色体の分類。

蛍光標識：-染色体は、核酸に特異的な蛍光色素で標識されています。 -蛍光色素は、1）窒素塩基に対する特異性、2）実験条件（利用可能なレーザーの波長を考慮に入れることを含む）に従って選択されます。 1.単変量解析には、ATまたはGC蒸気に固有ではない色素を使用します：ヨウ化プロピジウム（励起ピーク：535 nm、発光：617 nm、必要なレーザー：488 nm-アルゴンレーザーまたはランプ+ロングパスフィルター）臭化エチジウム（励起ピーク：300および520 nm、発光：600 nm、必要なレーザー：488 nm-アルゴンレーザーまたはランプ+ロングパスフィルター）これらのタグは、A、G、T、または窒素塩基の含有量に関係なくDNAを着色します。 2.二変量解析の用途：クロモマイシン（G-C塩基対に特異的）、ピークA 3励起：458 nm、発光580nm。レーザー：、458nm最小400m.V出力。 Hoechst 33258（A-T塩基対に固有）、励起：351 -364 nm、発光：470nm。レーザー：351-364nm（強力）。蛍光色素スペクトルが部分的に重複しているため、レーザーは時間と空間で分離する必要があります。

2.選別後の染色体/ヌクレオチド配列の研究（物理的および遺伝的地図の作成など）FISH BAC-FISH PRINSC-PRINS長い染色体を持つ大きなゲノムの研究。多数のリピートを持つ配列のマッピング（例：テロメアおよびセントロメア領域）。短いプローブの使用。繰り返し回数が多いため、信号は強いです。標準プローブサイズ：15〜30ヌクレオチド。魚

FISHの問題：標準の短いプローブを使用するとシグナルが非常に弱くなるため、単一遺伝子座のDNA配列（つまり、繰り返されない固有のDNA配列）を特定することは困難です。シグナルを増幅するためにプローブの長さを数キロベースに増やすと、感度が低下し、=>非特異的結合につながります。解決策：BAC-FISH -BAC-FISH-FISH法と、人工染色体（BAC）に埋め込まれたゲノムDNAのクローンの使用を組み合わせて、大きなDNA配列を挿入できるようにします。 -小さなゲノムを持つ生物の個々の染色体を識別してマッピングするための効果的な方法。 BACプローブ、オーバーゴー（重複するオリゴヌクレオチド）がプローブとして使用されます。

FISHの代替：PRINS PRINS（primed in situ labeling）は、オリゴヌクレオチドDNAプライマーを変性染色体DNAの相同配列でアニーリングし、続いて標識ヌクレオチドでプライマーをinsituで酵素的に伸長することにより染色体を標識する方法です。 Kochらによって最初に記述されました。 1989年（Koch、JE、Kølvraa、S。、Petersen、KB、Gregersen、N.、and Bolund、I。（1989）in situでのアルファサテライトDNAの染色体特異的標識のためのオリゴヌクレオチドプライミング法。Chromosoma98、259 -265）。 PRINSはFISHの代替です。これは、ヌクレオチド配列の局在化、中期または間期の染色体または染色体ペア（染色体異数性を含む）の認識およびカウントに使用されます。非標識プライマー（プライマー-プライマー）と研究中のDNAとのアニーリング熱安定性DNAポリメラーゼと標識ヌクレオチドを使用したプライマーの伸長（3 '末端へのブロッキング分子の付着）プライマー：制限フラグメントPCR産物オリゴヌクレオチドの標識ヌクレオチド：直接-間接（ビオチン/ dig蛍光色素結合アビジン/ anti-dig）-各PRINS反応の結果では、1対の相同染色体（1つの染色体）のみを識別できます。同じガラス上での次のPRINS反応は、前の反応をブロックした後にのみ実行できます。 -繰り返し回数の多いDNA配列に適用されます。

PRINSの利点：1。オリゴヌクレオチドプライマーを合成するために必要な最小限の配列情報が必要です。 2.染色体上で目的の配列を検出するための最も速くて簡単な方法（FISHに重いプローブを使用する場合と比較して、非常に長期間ハイブリダイズします）。 3.プローブのタグ付け段階の排除。 4.短い固有の配列を検出するときに、c-PRINSシグナルを増強するために、標識ヌクレオチドでプライマーを伸長する能力。低コピーの繰り返しまたは短い一意のシーケンスを検出するには、より感度の高い方法を使用します-サイクリングPRINS（c-PRINS）。ゴスデンらによって提案されたC-PRINS。 1991年、Kubalákováらによって広く使用されている改良されたプロトコル。、2001（KubalákováM、VránaJ、CíhalíkováJ、LysákMA、Dole J（2001）。PRINSおよびC-PRINSを使用した植物染色体上のDNA配列の局在。MethodsinCellScience 23：71-82）。 C-PRINSには、PCRと同様の一連の熱サイクルが含まれています。

FISHのシース液：-BD Bioscience Standard（GM Baerlocher、I Vulto、G de Jong、PM Lansdorp。フローサイトメトリーおよびテロメアの平均長を測定するためのFISH（フローFISH）。2006。NatureProtocols 1、-2365-2376） -40メートル。 M KCl +10メートル。 MNa。 Cl（VránaJ、KubalákováM、SimkováH、CíhalíkováJ、LysákMA、Dolezel J.一般的なコムギ（Triticum aestivum L.）の有糸分裂染色体のフローソーティング。Genetics.2000; 156（4）：2033-41）-Mg ..。。したがって、ジチオスレイトールを含まない4つのバッファー（Lj。Li、L。Ma、K。Arumuganathan、YC Song。フローソートされた染色体：植物遺伝子の物理的マッピングのための優れた材料。Caryologia.2006、vol。59、No。2：99-103 ）-オートクレーブ処理された0.1％（wt / vol）Na。 Cl -50 m MNa。 Cl（MKubaláková、PKovářová、PSuchánková、JČíhalíková、JBartoš、S Lucretti、N Watanabe、SF Kianian、JDoležel。四倍体コムギの染色体選別とゲノム解析の可能性。遺伝学.2005、170（2）823 -829）-染色体安定化ポリアミンバッファー（タンパク質含有シース液）（Darzynkiewics Z、Robinson JP、Crissman H. Flow Cytometry、第2版パートB. San Diego、CA。Academic Press、Inc。1994）

蛍光insituハイブリダイゼーション

蛍光ハイブリダイゼーション。 その場で 、またはFISHメソッド（eng。蛍光その場で ハイブリダイゼーション-FISH ）は、中期染色体または間期核における特定のDNA配列の位置を検出および決定するために使用される細胞遺伝学的手法です。 その場で..。さらに、FISHは組織サンプル中の特定のmRNAを検出するために使用されます。後者の場合、FISH法により、細胞や組織における遺伝子発現の時空間的特徴を確立することが可能になります。

プローブ

蛍光ハイブリダイゼーションあり その場でサンプル内の相補的なターゲットに結合するDNAプローブ（DNAプローブ）を使用します。 DNAプローブには、フルオロフォアで標識されたヌクレオシド（直接標識）またはビオチンやジゴキシゲニンなどのコンジュゲート（間接標識）が含まれています。直接標識を使用すると、ハイブリダイゼーションが完了した直後に、ターゲットに結合したDNAプローブを蛍光顕微鏡で観察できます。間接標識の場合、追加の染色手順が必要です。その間、ビオチンは蛍光標識されたアビジンまたはステプタビジンを使用して検出され、ジゴキシゲニンは蛍光標識された抗体を使用して検出されます。 DNAプローブの標識の間接的な変形には追加の試薬と時間の費用が必要ですが、この方法では通常、抗体またはアビジン分子に3〜4個の蛍光色素分子が存在するため、より高いシグナルレベルを達成できます。さらに、間接標識の場合、シグナルのカスケード増幅が可能です。

DNAプローブを作成するには、クローン化されたDNA配列、ゲノムDNA、PCR反応産物、標識オリゴヌクレオチド、および顕微解剖によって得られたDNAを使用します。

プローブの標識は、ニックトランスレーションや標識ヌクレオチドを用いたPCRなど、さまざまな方法で実行できます。

ハイブリダイゼーション手順

蛍光ハイブリダイゼーション実験スキーム その場で核内の遺伝子の位置を特定する

最初の段階は、プローブの構築です。プローブサイズは、ハイブリダイゼーションが特定の部位で発生するのに十分な大きさである必要がありますが、ハイブリダイゼーションプロセスを妨げないように大きすぎない（1,000 bp以下）必要があります。特定の遺伝子座が特定された場合、または染色体全体が染色された場合、ハイブリダイゼーション混合物に非標識DNAリピート（Cot-1 DNAなど）を追加することにより、DNAプローブと非固有のリピートDNA配列とのハイブリダイゼーションをブロックする必要があります。 DNAプローブが二本鎖DNAの場合、ハイブリダイゼーションの前に変性させる必要があります。

次の段階では、間期核または中期染色体の準備が行われます。細胞は基板上、通常はスライドガラス上に固定され、その後DNAが変性します。染色体や核の形態を維持するために、ホルムアミドの存在下で変性が行われ、変性温度を70°に下げることができます。

結合したDNAプローブは、蛍光顕微鏡を使用して視覚化されます。蛍光シグナルの強度は、プローブによる標識の効率、プローブの種類、蛍光色素の種類など、多くの要因に依存します。

文献

Rubtsov N.B. 哺乳類の染色体を扱う方法：教科書。マニュアル/ Novosib。状態 un-t。ノボシビルスク、2006.152p。

Rubtsov N.B. 核酸ハイブリダイゼーション その場で染色体異常の分析において。本「分子診断入門」の章T.2。「遺伝性および腫瘍性疾患の診断における分子遺伝学的方法」/ Ed。 M.A. Paltseva、D.V。 Zaletaeva。医科大学の学生のための教育文学。 M 。：医学、2011年。T。2。S.100-136。

メモ（編集）

ウィキメディア財団。 2010年。

他の辞書にある「蛍光insituハイブリダイゼーション」とは何かをご覧ください。

この用語には他の意味があります。ハイブリダイゼーションを参照してください。 DNAハイブリダイゼーション、相補的な一本鎖核酸の1つの分子へのinvitroでの核酸ハイブリダイゼーションの組み合わせ。完全な相補性で......ウィキペディア

決定方法蛍光insituハイブリダイゼーション。

教材詳細参照

自宅訪問可能

この研究は、乳がんまたは胃がんに対する個別の補助化学療法を選択するために使用されます。

乳がん（BC）は、女性の腫瘍性疾患の中で第1位です。乳房腫瘍細胞には、特定の物質（ホルモンまたは他の生物学的に活性な分子）に敏感なさまざまな種類の受容体が含まれている可能性があります。腫瘍細胞におけるホルモン受容体（エストロゲンおよびプロゲステロン）またはヒト上皮成長因子受容体2型（ヒト上皮成長因子受容体2、HER2）の存在に応じて、ホルモン受容体陽性、HER2陽性およびトリプルネガティブ乳がんが分離されます。個々の治療法の選択においてこれを考慮に入れ、治療の成功を予測することが重要です。

HER2は組織に存在し、通常は細胞分裂と分化の調節に関与する受容体です。腫瘍細胞の表面でのその過剰（過剰発現）は、新生物の急速な制御されていない成長、転移のリスクが高いこと、およびいくつかのタイプの治療の効率が低いことを事前に決定します。乳がんのいくつかのサブタイプにおけるHER2の過剰発現は、増殖と血管新生の増加、およびアポトーシスの調節不全（遺伝的にプログラムされた細胞の自己破壊）を引き起こします。現在、HER2受容体を標的とする薬剤があります。これは特に、HER2 / neu受容体に対するモノクローナル抗体であるハーセプチン（トラスツズマブ）です。

HER2癌遺伝子（ErbB-2）の増幅と過剰発現は、乳がんに比較的特異的なイベントであり、他の局在の腫瘍では実際には発生しません。胃がん（GC）は、数少ない例外の1つです。HER2の活性化は、この臓器の悪性新生物の症例の約10〜15％で観察され、疾患の進行過程と相関しています。 HER2陽性乳がんでは、腫瘍細胞の表面に過剰なHER2受容体が存在する可能性があります（HER2陽性またはHercept陽性と呼ばれます）。この現象は、乳がんの女性の15〜20％で観察されます。 HER2の状態の評価は、治療戦術を決定する上で重要です。

HER2 / neuの過剰発現および/またはHER2 / neu遺伝子の増幅を検出するための主な標準化された方法は、免疫組織化学的（IHC）法および蛍光insituハイブリダイゼーション（FISH）です。両方の研究は、ポリクローナル抗体（IHC）、蛍光プローブ（FISH）、およびさまざまなイメージングシステムを使用して、組織学的標本（パラフィンに埋め込まれた腫瘍材料の切片）で実施されます。

IHC反応の結果を評価する際には、腫瘍の浸潤性成分での発現のみが考慮されます。反応結果の評価は、テストメーカーによって開発され、専門家の承認を受けた0、1 +、2 +、3 +のポイントスケールを使用して実行されます。 0および1+と評価されたHerceptステータスは、陰性と見なす必要があります。タンパク質の過剰発現はなく、その遺伝子の増幅がないことと相関しています。 3+と評価されたHerceptステータスは陽性です。つまり、タンパク質の過剰発現が存在し、これは遺伝子増幅の存在と一致しています。ハーセプトステータス2+は不確実であると考えられています。つまり、免疫組織化学反応に基づいて決定されたタンパク質の発現は、遺伝子増幅について自信を持って判断できないため、増幅の有無を直接明らかにする研究が必要です。 FISH法は、免疫組織化学的研究が行われたのと同じサンプル（ブロック）の切片に使用されます。 FISHハイブリダイゼーションでは、HER2遺伝子の増幅の存在の評価は、17番目の染色体のセントロメア領域をマークする赤色蛍光（標識されたHER2遺伝子に対応）と緑色蛍光シグナルの比率を計算することによって実行されます。 2より大きい比率は、HER2増幅の存在を示します。 FISHは、増幅の有無を直接評価できるため、IHCよりも感度が高くなります。

研究資料：腫瘍生検によるパラフィンブロック。

注意！必須：

HER2 / neuIHC染色スライド
Her-2 / neuに対する抗体を用いた組織学的およびIHC研究の結果を伴う医師からの紹介または退院

文献

Zavalishina L.E.、Frank G.A. HER2状態の形態学的研究。方法論とアトラス。 --M。：Ed。「メディアメディカ」。 2006：98。
2011年のロシアの悪性疾患（罹患率と死亡率）。エド。 ANDで。 Chissova、V.V。スタリンスキー、G.V。ペトロワ。 --M。：FGBU "MNIOIim。 P.A. ロシア保健省のヘルツェン»。 2013：289。
腫瘍学。臨床ガイドライン。ロシアの腫瘍学者協会。エド。 ANDで。 Chissova、S.L。ダリヤロワ。 --M。：Ed。「GEOTAR-メディア」。 2008：702。
Bang Y. J.、Van Cutsem E.、Feyereislova A.、Chung H. C.、Shen L.、Sawaki A. etal。 HER2陽性進行胃癌または胃食道接合部癌（ToGA）の治療のための化学療法と化学療法単独の併用によるトラスツズマブ：第3相非盲検ランダム化比較試験。ランセット。 2010; 376：687-697。
ダブスD.J. 診断免疫組織化学：セラノスティックおよびゲノムアプリケーション。 Elsevier、第4版。 2013：960。
Ferlay J.、Shin H.R.、Bray F.、Forman D.、Mathers C.、Parkin D.M. GLOBOCAN 2008、世界中のがんの発生率と死亡率：IARCがんベース第10号。フランス、リヨン：国際がん研究機関。 2010年。http：//globocan.iarc.frから入手可能。
Goldhirsch A.、Glick J.H.、Gelber R.D.、Coates A.S.、Thurlimann B.、Senn H.J. 会議のハイライト：2005年早期乳がんの一次治療に関する国際専門家のコンセンサス。腫瘍学年報。 2005; 16（10）：1569-1583
Kurman R.J.、Carcangiu M.L.、Herrington C.S.、Young R.H. 女性生殖器の腫瘍のWHO分類。 WHO Press、第4版。 2014; 4：316。
NordiQC。 http://www.nordiqc.org。
Park D.I.、Yun J.W.、Park J.H. etal。 Her2 / neu増幅は、胃癌の独立した予後因子です。消化器疾患と科学。 2006; 51（8）：1371-1379
Slamon D. etal。 HER2陽性乳がんにおけるアジュバントトラスツズマブ。ニューイングランドジャーナルオブメディシン。 2011; 365：1273-1283。

蛍光insituハイブリダイゼーション。 蛍光insituハイブリダイゼーション（FISH）