Morte cellulare programmata. Alexander Shtil

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" Ricerca e Sviluppo "~2

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studio ^4 sviluppo

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Estratto della tesiin medicina sul tema Resistenza ai farmaci delle cellule tumorali mediata dalla glicoproteina P: meccanismi di formazione urgente e approcci al superamento

Come manoscritto

Shtil Alexander Albertovich

RESISTENZA AI FARMACI DELLE CELLULE TUMORALI MEDIATA DALLA P-GLICCOPROTEINA: MECCANISMI DI EMERGENZA E APPROCCI PER SUPERARLO

Mosca 2003

Il lavoro è stato svolto presso l'Istituto statale russo di ricerca oncologica intitolato a N.N. Blokhin Accademia russa delle scienze mediche, Mosca

Avversari ufficiali:

Dottore in Scienze Mediche, Professore A.M. Garin,

Dottore in Scienze Biologiche, Professore, Scienziato Onorato della Federazione Russa A.N. Salrin,

Dottore in Scienze Biologiche, Professore N.S. Sergeeva,

Istituzione principale: Accademia medica russa di istruzione post-laurea del Ministero della sanità della Federazione Russa.

La discussione della tesi avrà luogo il 25 dicembre 2003 nella riunione del Consiglio Accademico specializzato D.001.017.01 presso

RONC dal nome. Accademia Russa delle Scienze Mediche N.N.Blokhin all'indirizzo: 115478, Mosca, autostrada Kashirskoe, 24.

La tesi può essere trovata nella biblioteca del Centro russo per la ricerca sul cancro che porta il suo nome. NN Blokhin RAMS.

Segretario scientifico del Consiglio Accademico specializzato

Dottore in Scienze Mediche

Yu.V. Shishkin

Caratteristiche generali del lavoro La rilevanza dell'argomento

I. Resistenza multifarmaco delle cellule tumorali: meccanismi biologici e significato in oncologia.

Nonostante i significativi progressi in campo farmacologico, compreso lo sviluppo di tecnologie per la creazione di farmaci con proprietà attese, il successo della chemioterapia per i tumori è limitato dalla caratteristica più importante dei sistemi viventi: la capacità di rispondere ai cambiamenti nell'ambiente esterno. Una delle manifestazioni di tale elasticità è lo sviluppo della resistenza delle cellule tumorali ai farmaci [usati nella chemioterapia. L’ampia prevalenza e la natura persistente e a lungo termine dell’adattamento cellulare alle influenze esterne suggeriscono che il superamento della resistenza ai farmaci può essere associato non solo alla ricerca di farmaci più efficaci: probabilmente non esiste farmaco al quale le cellule non siano in grado di sviluppare resistenza. Solo la delucidazione dei meccanismi biologici di resistenza ai vari tipi di stress potrà servire nuovamente a sviluppare strategie per superare la resistenza ai farmaci, condizione necessaria per aumentare l'efficacia del trattamento dei pazienti affetti da cancro.

La resistenza multifarmaco (MDR) dei tumori - la preservazione della vitalità da parte delle cellule tumorali in risposta all'influenza di vari farmaci - è uno dei motivi principali della progressione della malattia: il tumore è insensibile alla chemioterapia, indipendentemente dalla combinazione di diversi farmaci droghe. Il fenomeno MDR ha un carattere stabile e a lungo termine: i meccanismi di resistenza vengono ereditati attraverso generazioni di cellule. Pertanto, l’MDR è uno dei fattori chiave nella progressione del tumore.

Esistono due tipi principali di resistenza cellulare alle tossine. Primario, ad es. resistenza osservata prima dell’esposizione alla chemioterapia) è dovuta all’espressione di meccanismi di difesa durante la progressione del tumore. Sì, attivazione

i meccanismi anti-apoptotici che conferiscono resistenza agli effettori immunitari possono essere correlati alla resistenza ai farmaci. La resistenza secondaria (acquisita) si verifica nelle cellule esposte allo stress. Prima di queste influenze, i meccanismi motori in tali cellule sono scarsamente espressi o assenti; sopravvivendo dopo il trattamento con una tossina, le cellule acquisiscono resistenza a molte sostanze - MDR (Riordan, Ling, 1985). Un'ulteriore selezione consolida il fenotipo acquisito nel corso di generazioni di cellule.

Il meccanismo più importante dell'MDR è il ridotto accumulo di tossine nella cellula, dovuto all'escrezione di sostanze nell'ambiente intercellulare. Tale trasporto è effettuato dalla proteina integrale della membrana plasmatica, la glicoproteina P (Pgp), grazie all'energia di idrolisi dell'ATP (Juliano, Ling, 1984). Numerosi dati indicano che aumenti dell'mRNA di MDRI e Pgp sono spesso fattori di resistenza di più tipi di tumore al trattamento (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).

II. Sviluppo di MDR nelle cellule tumorali: meccanismi biologici come bersagli per la prevenzione

È ragionevole supporre che l'aumento della quantità di mRNA dell'MDRI sia dovuto all'amplificazione di questo gene. Questo meccanismo MDR è stato identificato in linee cellulari in coltura selezionate per la sopravvivenza in presenza di tossine (Roninson, 1991). Tuttavia, analizzando i tumori umani, l'amplificazione del gene MDRI non è stata rilevata né nei tumori primari né nelle neoplasie dopo il trattamento. La causa probabile della MDR clinica è la sovraespressione di MDRI e Pgp con struttura genica invariata (conservazione del numero di copie e della sequenza nucleotidica), cioè risorsa epigenetica! fenotipo. Nelle colture di cellule tumorali umane, è stato notato un aumento del livello dell'mRNA dell'MDRI e della quantità di Pgp dopo un singolo trattamento con il farmaco chemioterapico

diversi nella struttura chimica e nei meccanismi d'azione (Chaillon ed Erwin, 1993). Sono state ottenute prove dell'accumulo di mRNA MOI 1 nelle metastasi del cancro nel tessuto polmonare già 20-50 minuti dopo l'inizio dell'infusione polmonare intraoperatoria con doxorubicina (Abolhoda et al., 1999). Questi risultati suggeriscono la possibilità di attivazione epigenetica di MDR in situazioni sperimentali e cliniche: un aumento dell'mRNA di MDR1 e Pgp nei tumori può verificarsi senza amplificazione del gene MDR1.

Questo tipo di regolazione biologica - attivazione urgente del fenotipo - comporta l'induzione della trascrizione del gene (geni) che codifica il fenotipo corrispondente e/o il controllo post-transizionale (stabilizzazione delle NK, regolazione della sintesi e del funzionamento delle proteine). per MDR, questo tipo di regolazione significa la possibilità di induzione del gene MYR\ (fusioni cellulari e lo sviluppo relativamente rapido di resistenza nelle cellule dell'orecchio in risposta allo stress. L'inducibilità del gene MYR 1 suggerisce lo sviluppo di vie di segnalazione da dalla periferia cellulare al nucleo. Tali percorsi potrebbero essere meccanismi di segnalazione che implementano lo stress: proteina chinasi C KS), fosfolipasi e Ca2+ intracellulare, neuropsinasi attivate dal mitogeno, fattore nucleare kappa B (NkB). Trasmissione del segnale alla regione regolatoria del KYR \ gene e la trascrizione garantisce l'attivazione della compressione genetica.

Lo studio della regolamentazione MDR ha anche un aspetto pratico fondamentale. L’inibizione di questi meccanismi attraverso interventi farmacologici e/o terapeutici preverrebbe lo sviluppo di MDR durante la mioterapia.

III. Superare l'MDR formato delle cellule tumorali.

Se il blocco dei segnali di attivazione del gene MYR può prevenire la formazione di MDR nelle cellule sensibili primarie, allora è così

l'approccio non è applicabile per superare la resistenza già formata. Il metodo tradizionale per combattere l'MDR secondario è l'uso di modulatori Pgp in combinazione con citostatici (Lehne, 2000). Tuttavia, l’uso degli inibitori della Pgp è limitato dagli effetti collaterali (disturbi del ritmo cardiaco, squilibrio immunologico). Altrettanto importante, l'efficacia delle combinazioni modulatore+citostatico può essere ridotta a causa del blocco di almeno alcuni meccanismi di morte cellulare durante la selezione dell'MDR.

Il superamento dell'MDR formato è ottenibile se vengono soddisfatte due condizioni: 1) la concentrazione del farmaco deve essere sufficiente per attivare i meccanismi efficaci di morte cellulare, 2) le funzioni di questi meccanismi devono essere preservate nelle cellule con MDR. La prima condizione è soddisfatta se il farmaco supera la barriera Pgp. Tuttavia, è necessario dimostrare che il raggiungimento di una concentrazione intracellulare critica dell'agente è sufficiente per attivare la morte di una cellula resistente a molti agenti. I meccanismi di sopravvivenza che operano nelle cellule resistenti dovrebbero servire come obiettivi per l'eliminazione di queste ultime.

Per implementare la seconda condizione, gli approcci mirati alla lisi delle cellule resistenti come meccanismo per indurne la morte sembrano promettenti. La vaccinazione di topi con cellule di mieloma singenico trasfettate con cDNA di alcune citochine porta allo sviluppo di una risposta immunitaria mediata dai linfociti T citotossici (CTL) e al rigetto del tumore inoculato negli animali immunizzati (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al ., 1996). I CTL lisano le cellule utilizzando il granzima B e la perforina. Poiché il granzima B attiva la caspasi 3, uno degli effettori distali dell'apoptosi, e la perforina provoca un danno primario alla membrana plasmatica (necrosi), si può sperare che i CTL siano efficaci se i meccanismi di morte prossimale vengono bloccati; attivazione di collegamenti distali di apoptosi in combinazione con necrosi

porta alla morte delle cellule resistenti ai farmaci antitumorali che inducono la morte cellulare programmata.

Formulazione del problema

L'MDR è un fenomeno clinicamente sfavorevole, il cui superamento richiede la conoscenza dei meccanismi del suo sviluppo e delle modalità con cui avviene la morte cellulare; è necessario studiare entrambi gli aspetti del problema. Innanzitutto è necessario studiare i meccanismi di formazione dell'MDR in cellule umane MDR1/Pgp-negative; lo studio di questi meccanismi servirà a prevenire lo sviluppo di resistenza in cellule prevalentemente sensibili. In secondo luogo, l'analisi dei processi di morte che operano nelle cellule MDR creerà le basi per superare la resistenza in situazioni in cui si è formato MDR secondario.

Lo scopo dello studio è stabilire i meccanismi di formazione urgente dei linfonodi nelle cellule tumorali umane e sviluppare approcci per superare questo inferno di resistenza.

1. Ottimizzare modelli per lo sviluppo di MDR in colture di cellule tumorali umane in risposta agli effetti di farmaci chemioterapici e agonisti e antagonisti sperimentali dei meccanismi di segnalazione.

2. Determinare il meccanismo principale per lo sviluppo urgente di MDR quando le cellule vengono trattate con agenti antitumorali: amplificazione del gene MDR, selezione di cellule Pgp-positive o induzione de novo di MDR.

3. Esplorare le vie di trasmissione del segnale intracellulare che regolano l'attivazione di MDR (proteina chinasi C, fosfolipasi C, Ca2+ intracellulare, proteina chinasi attivata dal mitogeno, NFkB).

4. Identificare il ruolo dell'attivazione trascrizionale e della regolazione post-trascrizionale (stabilità dell'mRNA) dell'espressione genica MDR nello sviluppo acuto di MDR in risposta agli effetti della chemioterapia.

5. Sviluppare modi per prevenire lo sviluppo di MDR nelle cellule tumorali combinando farmaci chemioterapici con bloccanti delle vie di segnalazione che attivano CR e inibitori della trascrizione genica

6. Studiare la cinetica di attivazione delle caspe iniziatrici ed effettrici, i cambiamenti nel potenziale transmembrana dei mitocondri, la scissione proteolitica della poli(ADP)ribosio polimerasi, la frammentazione del DNA internucleosomale e l'integrità della membrana plasmatica nelle cellule madri e le varianti con MDR quando trattate con un farmaco non trasportato dalla glicoproteina P.

7. Utilizzare la vaccinazione con cellule tumorali che esprimono

citochine per generare una risposta immunitaria contro le cellule MDR. »

Provvedimenti presentati a difesa.

1. La formazione di MDR mediata da Pgp - una risposta cellulare urgente a molte influenze - è mediata dall'attivazione epigenetica del gene MDR 1. Questa attivazione è dovuta a numerosi meccanismi di trasmissione del segnale intracellulare, induzione del promotore del gene e stabilizzazione dell'mRNA e può essere prevenuto dagli inibitori di questi segnali.

2. Il superamento dell'MDR mediato da Pgp può essere associato a un effetto mirato sulla membrana plasmatica delle cellule resistenti. La Pgp non protegge le cellule dall'interruzione dell'integrità della membrana plasmatica - necrosi.

Conoscenza scientifica

1. Per la prima volta è stata concretizzata l'idea della formazione di MDR come risposta cellulare urgente ad uno stimolo esogeno;

2. Per la prima volta è stato studiato in dettaglio il meccanismo di sviluppo di uno specifico fenotipo di resistenza ai farmaci, MDR mediato da P£p: attivazione epigenetica del gene MYR 1 che codifica per questa proteina.

3. Per la prima volta è stato sviluppato un modello di attivazione urgente del gene MHS,

accompagnato dall'acquisizione di un fenotipo stabile di MDR mediato da Pgp in cellule tumorali umane in coltura; 1. Sono state identificate le vie di trasduzione del segnale, i meccanismi di attivazione della trascrizione e la regolazione post-trascrizionale del gene MOK 1 in cellule esposte a farmaci antitumorali. 5. Per la prima volta sono state caratterizzate classi di sostanze farmacologiche - bloccanti della trasmissione del segnale intracellulare - in grado di prevenire la formazione di MDR mediata da RCR nelle cellule tumorali. 5. Per la prima volta sono stati studiati i meccanismi di morte operanti nelle cellule con MDR mediata da PgP ed è stato sviluppato un approccio per superare la resistenza, che comportava un danno primario all'integrità della membrana plasmatica.

Valore pratico.

1. Sviluppo di metodi per prevenire lo sviluppo urgente di MDR mediato da Pgp in cellule tumorali in coltura esposte a farmaci chemioterapici.

2. Sperimentazioni precliniche di vaccini geneticamente modificati per superare l'MDR.

Approvazione del lavoro.

La tesi è stata discussa il 30 giugno 2003 in una conferenza congiunta dei dipartimenti di genetica delle cellule tumorali, citogenetica con il gruppo di genetica molecolare, oncogeni virali e cellulari, endocrinologia molecolare, immunità antitumorale, farmacologia biochimica, ricerca medica, diagnostica sperimentale e bioterapia dei tumori; Dipartimenti di Schmunologia, Ematologia, Chemioterapia, Farmacologia clinica, Metodi di trattamento avanzati del Centro russo di ricerca sul cancro che porta il nome. N.N.Blokhsha RAMS.

I principali materiali della tesi sono stati presentati alle seguenti conferenze: 2° simposio internazionale "Cylostatic Drug Resistance", (K Germania, 1991); Conferenza Gordon "Advances in Chemotherapy" (New York, Londra, USA, 1994); "Tossicologia molecolare" (Copper Mountain, USA, 1995); "Risposte genomiche inducibili" (Stevenson, USA, 1996); "Acidi nucleici - Integrazione di diagnostica e terapia molecolare" (San Diego, USA, 1996); conferenze annuali dell'American Association of Cancer Research (1994-2001): 6° e 7° congresso "Advances in Oncology", (Hersonissos, Grecia, 2001,2002); "La struttura e le funzioni del nucleo cellulare" (San Pietroburgo, 2002), nonché ai seminari presso Oncotech, Inc. (Irvine, USA, 1996), Salk Institute (LaJolla, USA, 1997), Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, USA, 1997), The Jackson Laborati (Bar Harbor, USA, 1997), Sloan-Kettgering Cancer Center, New Yo ] USA, 1999), le università di Copenhagen (2002), Innsbruck (2002) e Gronings! (2003), Università statale di Mosca. M.V. Lomonosov (2002), Istituto di ricerca di patologia sperimentale, oncologia e radiobiologia dal nome. RE Kavetsky (Kiev, 2002).

Pubblicazioni.

Struttura e ambito della tesi.

La tesi è presentata su 181 pagine dattiloscritte e consiste nell'introduzione dei capitoli “Revisione della letteratura”, “Materiali e metodi di ricerca”, “Risultati della ricerca” (due parti), discussione e conclusioni. L'opera contiene 44 figure e 6 tavole. Il materiale bibliografico include collegamenti a 270 fonti letterarie.

Materiali e metodi di ricerca.

Animali da laboratorio e linee cellulari. Sono stati utilizzati topi Balb/c. Per gli esperimenti sull'attivazione dell'MDR, abbiamo utilizzato le linee cellulari umane H9 (leucemia a cellule T), K562 (leucemia promielocitica), SW<

(cancro del colon), così come la sublinigo K562Í/S9, in cui la Pgp è espressa senza selezionare le cellule per la resistenza alle tossine (Mechetner et al., 1997). Per gli esperimenti sulla creazione dell'immunità antitumorale, sono state utilizzate le linee di mieloma MPC11, J558 e S194. Per ottenere sottolinee con MDR, è stata effettuata una selezione graduale delle cellule MPC11 per la resistenza alla doxorubicina. I sottofili indipendenti MPC1 lDoxlO-1 e MPCllDoxlO-2 proliferavano in presenza di acido doxorubico 100 nM.

Studio MDR: RNA del gene MDRI, quantità e funzione della Pgp.

Per attivare l'MDR, abbiamo utilizzato liggosina-1P-arabinofuranoside (cytosar, Ara C), doxorubicina, vincristina, nocodazolo, blsomicina, sfingomielinasi, ionoforo Ca2+ A23187, tapsigargina, 2-desossiglucosio, tricostatina A e estere del forbolo 12-0-tetradecanoilmiristato.13 -acetato (TPA). Per inibire l'attivazione di MDR, actinomicina D, α-amanitina, ecteinascidina 743 (ET743), cheleritrina, bis-indolilmaleimide I, calfostina C, BARTA/AM, TMB-8, pirrolidindptiocarbammato (PDTC), tosil-L-fenilclorometilchetone ( TPCMK), salicilato di sodio, acido salicilico, PD98095. Gli inibitori sono stati aggiunti alle cellule in 30 minuti. prima di aggiungere gli attivatori. Il livello di MDR\mRNA nelle cellule è stato studiato mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (PCR) (Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000) utilizzando primer: MDRV. dritto: 5"-ССС ATS ATT GCA ATA GCA GG-3"; rovescio: 5"-GTT CAA ACT TCT GCT SCT GA-3". Lunghezza del prodotto 167 bp. p2-microglobulina: diretta: 5"-ASS CCC ACT GAA AAA GAT GA-3"; retro: 5"-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3". Lunghezza del prodotto 120 bp.

La quantità di Pgp e la sua funzione di trasporto sono state determinate mediante citometria a flusso con l'anticorpo monopolistico UIC2 (Mechetner et al., 1997). Come anticorpi secondari sono stati utilizzati anticorpi IgG anti-topo coniugati con fluoresceina isotiocianato (FITC). Per insegnare Pgp-

trasporto dipendente, sono stati utilizzati substrati fluorescenti Pgp-rodamina 123 (in esperimenti sull'induzione MDR) (Neyfakh, 1988) e calceina acetossimetil estere (in esperimenti con cellule di mieloma) (Holló et al., 1996; Shtü et al., 1999).

Saggio di morte cellulare. La sopravvivenza cellulare in presenza di tossine è stata studiata mediante la riduzione del 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2P-tetrazolio (test MTT) (Mossman, 1983; Sidorova et al., 2002). Le annessioni V-FITC sono state utilizzate per determinare il numero di cellule apoptotiche; le cellule necrotiche sono state rilevate con ioduro di propidio (PI). Il potenziale elettrico transmembrana dei mitocondri è stato determinato dalla fluorescenza della sonda JC-1 (Zamzair et al., 1997). Per determinare la frammentazione del DNA genomico, le cellule sono state lisate in un tampone contenente citrato di sodio, NP-40, RNasi A e PI; la sospensione è stata analizzata su un citometro a flusso (Shtil et al., 1999; è stato rilevato DNA frammentato nella regione sub-Gl. Per studiare la formazione di forme libere di ossigeno nelle cellule è stato utilizzato l'estere diacetato di diclorofluoresceina (DCFDA), che penetra il citoplasma ed emette fluorescenza dopo l'ossidazione da parte dei metaboliti intracellulari.

L'attività della PKC nel citosol e nelle frazioni di particelle è stata determinata mediante metodo radioattivo mediante fosforilazione della proteina basica della mielina dopo lisi cellulare e separazione delle frazioni mediante centrifugazione (Shtil et al. 2000).

L'attività delle proteine ​​chinasi attivate dal mitogeno ERK1/2 e JNK1 è stata determinata mediante fosforilazione di substrati specifici (proteina basica della mielina e c-Jun) dopo lisi cellulare e immunoprecipitazione delle chinasi (et al., 1996).

Plasmidi reporter, vettori di espressione, trasfezione.

Le cellule K562 e B\Y620 sono state trifettate con un plasmide che trasportava una regione del promotore trossimale del gene MOL 1 -1202/+118 nt. relativo al sito di inizio della trascrizione, clonato nel vettore pOB2b. La proteina reporter era la luciferasi Pge/1y. Per testare l'ingenuità della transattivazione di NaκB, le cellule sono state trifettate con un costrutto promotore-reporter contenente siti di legame per OTkB (5xNκB-lgociferasi). Per sopprimere l'attività della luciferasi, le cellule sono state simultaneamente iniettate con un sacmide che trasportava la luciferasi di noleggio sotto il controllo del promotore SIV40. In alcuni esperimenti, l'attività della luciferasi Pne]\y era correlata alla concentrazione di SEL totale nelle cellule trasfettate. Per la trasfezione, abbiamo utilizzato Spofeknsh o Lipofectamina, nonché il "gene gun" (per le cellule di mieloma) Nabillevich et al., 1996). I vettori che esprimono le subunità IκB p50 e p65 sotto il controllo del promotore BU40 sono stati utilizzati per la cotrasfezione con il parassita - 1202/+118-luciferasi L'attività delle luciferasi nelle cellule della cellula 1 è stata studiata con il metodo chemiopominescente.

Immunizzazione dei topi. Le cellule MPC11 e le sottolinee con MDR sono state irradiate (40 ~ r), trifettate con un plasmide contenente cDNA del fattore stimolante la salinità dei granulociti-macrofagi (GM-CSF) e iniettate per via sottocutanea nei topi (1,5 x 105 anni per animale). Ai topi controllo è stato iniettato lo stesso numero di cellule irradiate trasfettate con il vettore senza inserto. Dopo 7 giorni, cellule fresche sono state irradiate e trifettate con un plasmide contenente il DNA dell'interleuchina-12 (IL-12) oppure cellule irradiate trasfettate con un casmide senza inserto (controllo). Dopo altri 7 giorni (un totale di 14 giorni dopo la prima vaccinazione), agli animali sono state inoculate cellule fresche per via sottocutanea (10 giorni a settimana) (Tisher et al., 1998).

Attività CTL in coltura mista con cellule di mieloma. Le milze sono state rimosse 11 giorni dopo l'iniezione di cellule di mieloma trasfettate con IL-2 nei topi. Gli splenociti sono stati coltivati ​​per 5 giorni a 37°C, 5%

COg con cellule fresche irradiate della linea utilizzata per l'immunizzazione. Cellule fresche di mieloma sono state quindi caricate con 51Cr (cellule bersaglio CTL). L'attività CTL è stata valutata mediante il rilascio di mSG nel mezzo dopo l'incubazione con i target. Per inibire l'elaborazione della perforina, gli splenociti sono stati incubati con concanamicina A e poi con bersagli (Kataok et al., 1996).

Risultati della ricerca

Attivazione urgente dell'MDR mediato da Pgp.

L'mRNA dell'MDRI si accumula nelle cellule in risposta agli effetti dei farmaci antitumorali (Chaudhary e Roninson, 1993). Per chiarire se questo effetto è associato alla selezione di cellule Pgp-positive o all'induzione di MDR, sono stati condotti esperimenti su cellule H9 MES/Pgp-negative. Le cellule sono state trattate con Ara C, un farmaco non trasportato dalla Pgp utilizzato in pazienti con cancro al seno e neoplasie ematologiche. L'espressione di MDR\ nelle cellule non trattate non viene rilevata dopo 25 cicli di PCR, mentre nelle cellule trattate con Ara C si osserva un aumento dell'mRNA di MDRI dopo 3-6 ore. impatto (Fig. 1, A). Un aumento dell'mRNA dell'MDRI può essere osservato ancora più velocemente - dopo solo 1 ora di esposizione, se la concentrazione del citosar viene aumentata a 75 µM. L'aumento dell'mRNA dell'MDRI persiste nelle cellule che sopravvivono a una singola esposizione ad Ara C per almeno 6 settimane.

Successivamente abbiamo esaminato se la quantità di Pgp aumenta parallelamente all'accumulo di mRNA dell'MDRI. Nella fig. La Figura 1 B mostra che le cellule trattate con Ara C esprimono Pgp. È importante che l’esposizione ad Ara C causi uno spostamento a destra dell’intera popolazione, il che indica che quasi tutte le cellule in coltura sono in grado di accumulare Pgp. Le cellule trattate con Ara C esprimono Pgp funzionalmente attiva: in queste cellule, eliminazione

la rodamina 123 è più potente che nelle cellule intatte; l'effetto viene rimosso dal verapamil, un bloccante del trasporto Pgp-dipendente.

O 1 3 6 10 16 24 ORE.

fluorescenza (Ig) -

Fig. 1. Aumento dell'mRNA di MDRX e Pgp dopo una singola esposizione ad Ara C. A: cellule H9 trattate con 10 μM di Ara C. MDR1 e mRNA di p2-microglobulina (B2M) sono stati determinati mediante PCR dopo trascrizione inversa. B: cellule trattate con Ara C 10 µM per 24 ore (n<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых

esposizione facile ad un agente non trasportato dalla Pgp. Significa che

Il meccanismo più probabile per questo effetto è l’induzione di un fenotipo

non selezione di cellule resistenti “preesistenti”.

Nella fig. La Figura 2 mostra la dipendenza della sopravvivenza cellulare dalla concentrazione di vincristina, un farmaco chemioterapico trasportato dalla Pgp. Cellule sopravvissute

Riso. 2. Una singola esposizione a cptozar porta alla formazione di un farmaco stabile trasportato da Pgp.

Le cellule H9 sono state trattate con Ara C 10 µM per 24 ore, risospese in terreno fresco e incubate per 12 giorni. Dopo il ripristino della crescita cellulare logaritmica, la loro sensibilità alla vincristina è stata studiata rispetto alle cellule non trattate con citosar (controllo). Risultati di 4 esperimenti (test MTT)

Pertanto, una singola esposizione di cellule Pgp-negative a un farmaco chemioterapico non trasportato dalla Pgp porta ad un rapido accumulo, nell'arco di un ciclo cellulare, dell'mRNA del gene MDRI, della Pgp funzionalmente competente e, soprattutto, allo sviluppo di resistenza al gene MDRI. Agente trasportato da Pgp Le cellule sensibili primarie acquisiscono MDR mediato da Pgp. Il meccanismo di questo fenomeno non è la selezione delle cellule Pgp-positive, ma l'attivazione del fenotipo de novo. Come avviene la formazione mediata da Pgp? MDR: a causa dell'attivazione della trascrizione del gene MDRX o della stabilizzazione dell'mRNA, funzionano entrambi i meccanismi?

Negli esperimenti presentati in Fig. 3, le cellule H9 sono state trattate con Ara C in presenza! inibitori della trascrizione - actinomicina D, a-amanitina ed ecteinascidina 743 (ET743). Tutti gli inibitori testati hanno prevenuto l’aumento indotto da Ara C dei livelli di mRNA dell’MDRI.

Riso. 3. Gli inibitori della trascrizione prevengono l'accumulo di RNA MDR1. Le cellule H9 sono state trattate con Ara C 10 μM per 24 ore. senza o in presenza di actinomicina D, α-amanitina o ET743. Vengono riassunti i risultati di 3 esperimenti.

Per studiare l'emivita (stabilità) dell'mRNA, le cellule sono state trattate con Ara C per 10 ore. e trasferiti in terreno fresco o terreno con actinomicina D e incubati per altre 36 ore. Nelle cellule non trattate, l'mRNA dell'MDRI si è rivelato di breve durata: la sua emivita era di circa 30 minuti. Il trattamento con Ara C ha prolungato l'emivita dell'mRNA a 6 ore. Pertanto, l'accumulo di mRNA MDRI e, di conseguenza, lo sviluppo di MDR mediato da Pgp in risposta allo stress citotossico, è causato non solo dall'attivazione della trascrizione MDR1, ma anche dalla stabilizzazione dell'mRNA di questo gene.

Meccanismi di trasmissione del segnale intracellulare nell'attivazione dell'MDR La Figura 4 mostra che un singolo trattamento delle cellule H9 con TFA, un agonista PKC, ha portato all'induzione del gene MDRI. Gli inibitori specifici della PKC - cheleritrina, calfostina C e bis-indolilmaleimide I - hanno prevenuto l'attivazione dell'MDR da parte dell'estere del forbolo e della chemioterapia. Simile

I dati sono stati ottenuti su cellule K562 trattate con Ara C, doxorubicina o TFA in presenza degli inibitori PKC indicati.

Riso. 4. Gli inibitori della PKC prevengono l'induzione dell'MDRI. Le cellule H9 sono state trattate con Ara C 10 μM per 16 ore. senza o in presenza di inibitori della PKC. Vengono riassunti i risultati di 3 esperimenti.

In sintesi, la PKC è importante per la regolazione dell’MDRI (e quindi del fenotipo MJI; questo gene può essere indotto da un agonista della PKC e gli inibitori della PKC prevengono l’attivazione dell’MDRI da parte dei farmaci antitumorali.

L'agonista fisiologico della PKC è il diacilglicerolo (DAT), che si forma durante l'idrolisi del fosfatidilinositolo-4,5-difosfato (PIg) da parte della fosfolipasi C specifica del fosfatidilinositolo e/o durante la degradazione della fosfatidilcolina sotto l'azione della fosfolipasi C, specifica per questo fosfolipide (Berridge, Irvine, 1984). L'attivazione dell'MDRI indotta da Ara C o doxorubicina può essere bloccata dalla neomicina solfato e dall'U73122, inibitori della fosfolipasi C specifica del fosfatidilinositolo (Fig. 5). L'attivazione di MDRI da parte dell'estere del forbolo è insensibile alla neomicina solfato e all'U73122 perché il TFA è un agonista diretto della PKC e questa chinasi funziona distalmente alla fosfolipasi C. Inibizione dell'attività specifica della fosfatidilcolina

La yusfolipasi C (farmaco B609) non ha portato a cambiamenti nell'espressione di MYR 1 Fig. 5). Questi risultati indicano l’importanza dell’idrolisi PI2 del fosfolipazone C specifico per yusfatidilinosengol nell’attivazione di MYA 1.

Riso. 5. Inibitori della fosfolipasi C nell'induzione dell'MDR\.

Le cellule H9 sono state trattate con Ara C 10 μM per 16 ore. senza o in presenza di neomicina solfato, U73122 o D609. Vengono riassunti i risultati di 3 esperimenti.

La fosfolipasi C scompone PI2 in DAT e FI. Il primo prodotto attiva la PKC, il secondo aumenta il livello di Ca2+ intracellulare grazie alla sua mobilizzazione dal reticolo ectoplasmatico. Il ruolo del Ca2+ intracellulare nell'induzione dell'MDRI è dimostrato dalla capacità dello ionoforo Ca2+-specifico A23187 e della tapsigargina, un inibitore della Ca2+-ATPasi, di attivare questo gene; il chelante specifico del Ca2+ BARTA/AM ha prevenuto l'induzione di MDR\ sia tramite chemioterapia che tramite TFA (Fig. 6).

1 2 3 4 5 in 7 8 E 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Rns. B. Il ruolo del Ca2+ intracellulare nell'induzione di A) R1.

Le cellule H9 sono state trattate con induttori MOI per 16 ore. da solo o in presenza del chelante del calcio BARTA/AM. Tracce: cellule 1-non trattate, 2,3-A23187; 4.5-

thapsigargina; 6,7-AgaC; 8,9-doxorubicina; 10,11-bleomicina;12,13-2-desossi-glucosio;14,15-nocodazolo;16,17-sfingomielinasi;18,19-TFA. Tracce pari: induttore dispari (eccetto 1): induttore -5 µM VARTA/AM.

Per chiarire la partecipazione del Ca2+ intra ed extracellulare nell'attivazione dell'MDR, sono state effettuate due serie di esperimenti. Innanzitutto, l'attivazione genica è stata studiata in condizioni di incubazione cellulare in un mezzo senza Ca2+. La rimozione del Ca2+ extracellulare non ha compromesso l'attivazione dell'MDRI mediante chemioterapia e TFA. In secondo luogo, l'agente TMB-8, che impedisce l'ingresso di Ca2+ nelle cellule e non modifica la concentrazione di Ca2+ intracellulare, non ha influenzato l'induzione di MDRI. Pertanto, per l'attivazione di MDRX è necessario il calcio intracellulare ma non extracellulare. Gli esperimenti di cui sopra dimostrano il ruolo fondamentale delle vie di segnalazione della fosfolipasi C->DAG-*PKS e PI3->Ca2+ nell'attivazione del gene MDRX da parte di varie sostanze, inclusi i farmaci chemioterapici.

Tuttavia, la PKC non è un meccanismo universale per l’attivazione dell’MDR. L'attività PKC varia nelle cellule trattate con singoli induttori MDRX. T< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).

" Tabella 1. Effetti degli induttori del gene MDRI sull'attività PKC.

Attività PKC del trattamento, pmol/mg proteine/min.

frazione di particelle del citosol

Controllo 119±13 59+9

TFA, YuONM 47+10* 153+14*

Ara C, 25 µM 143+16 65+10

Ceramide, 1 µM 138+15 27+8*

Ceramide, YumkM 83+15* 15+7*

*R<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.

Gli inibitori della PKC chelerygrina e bis-indolo-maleimide I hanno impedito l'attivazione di MDR\Ara C, doceorubicina e TFA, ma non ceramide (Fig. 7). Pertanto, l'attivazione della PKC non è un prerequisito per l'induzione del gene MDRX. Alcuni agenti (ad esempio, ceramvd) attivano meccanismi di segnalazione indipendenti dall'ACL o agiscono distalmente all'ACL.

Riso. 7. Ceramnd attiva MDR\ indipendentemente dall'intervento ACL.

Le cellule H9 sono state trattate con 25 μM di C2-ceramide per 24 ore. da solo o in presenza di inibitori della PKC. Il controllo dell'efficacia degli inibitori è il loro blocco dell'attivazione dell'MDR quando esposto a 10 µM di citosar.

Tali meccanismi possono essere proteine ​​chinasi attivate dal mitogeno. La doxorubicina e l'Ara C a concentrazioni che attivano MDR\ hanno aumentato l'attività di JNK1, ma non ERK1/2, mentre TFA ha attivato ERK1/2, ma l'attività di JNK1 non è cambiata (Fig. 8). Coerentemente con questi dati, l’inibitore di ERKI/2 PD98059 ha abolito l’attivazione dell’MDRI da parte dei TFA, ma non da parte della chemioterapia. Pertanto, le proteine ​​chinasi attivate dal mitogeno servono come livello di divergenza dei segnali di attivazione di MDR1 generati da diverse sostanze.

Attivazione delle chinasi MAP da parte della doxorubicina e del TPA

Riso. 8. Attivazione differenziale delle MAP chinasi da parte degli induttori MDR1. Le cellule H9 sono state trattate con doxorubicina e TFA. Le attività di ERK1/2 e JNK1 sono state determinate dopo immunoprecipitazione e fosforilazione dei substrati. Gli effetti degli induttori sono espressi come livello di attivazione di ciascuna chinasi rispetto alle cellule non trattate, in cui l'attività è impostata su 1. Vengono sommati i dati di 3 esperimenti.

Il fattore di trascrizione NFkB è un meccanismo per la rapida risposta delle cellule agli stimoli esterni (Karin, 1995). In una cellula a riposo, questa proteina si trova nel citoplasma in complesso con la subunità inibitoria; in risposta all'esposizione, NFkB si dissocia dal complesso, viene trasportato nel nucleo e attiva le regioni regolatrici del gene che hanno siti di legame per NFkB. Gli inibitori NFkB PDTC, TPCMC e salicilati hanno impedito l'attivazione di MDRX da parte di citosar, doxorubicina e TFA (Fig. 9). È particolarmente importante che il salicilap, un farmaco ampiamente utilizzato in clinica, risulti essere un efficace bloccante dell'attivazione urgente dell'MDRI. Inoltre, il salicilato di sodio ha annullato l'attivazione a lungo termine (fino a 7 giorni) di MDRX da parte del citosar (Fig. 10), confermando; l'importanza di NFkB come meccanismo di attivazione dell'MDR.

Riso. 9. Prevenzione dell'induzione di MDR1 da parte degli inibitori di NFkB. Le cellule H9 sono state trattate con 10 μM di Ara C, 5 μM di doxorubicina o 10 nM di TFA per 16 ore. da solo o in presenza di inibitori dell'attivazione di NFkB. Vengono riassunti i risultati di 4 esperimenti.

4, lavare

L ha S - + +----

salicilato - - + \ s 5 7

giorni senza AGAS

Riso. 10. Effetto a lungo termine del salcinlato di sodio come inibitore dell'induzione dell'MDRI.

Le cellule H9 sono state trattate con 10 μM di Ara C per 48 ore. da solo o in presenza di salicilato di sodio, risospesi in terreno fresco e incubati per altri 1-7 giorni.

L'importanza di stabilire il ruolo di NκB sta anche nel fatto che questo meccanismo “unisce” eventi citoplasmatici e nucleari nell'attivazione del gene MYR 1. Questa connessione è confermata da esperimenti sull'attivazione del promotore del gene; AYUSH esogeno No.kV. La cotrasfezione delle subunità OTkV p50 e p65 ha portato all'attivazione della regione -1202/+118 nt. promotore AYUSH (Fig. 11). Tuttavia, nella regione indicata, non è stata trovata la sequenza canonica 5"-COOIM^YUSS-3" (R-qualsiasi base purinica, aL-qualsiasi base pirimidinica) per l'interazione con NaκB o sequenze omologhe. Sono possibili le seguenti ipotesi: 1) NokV interagisce con una sequenza non ancora identificata nella regione -1202/+118 i.i.; 2) NkB attiva un gene intermedio (geni), il cui prodotto si lega alla regione -1202/+118 nt. e induce il promotore MDR1.

Riso. 11. NFkB - attivatore del promotore MDR.

Le cellule K562 sono state trasfettate con i costrutti indicati e un plasmide che trasportava Renilla luciferasi rei sotto il promotore SV40. L'attività della luciferasi di Firefly riflette l'induzione della regione -1202/+118 nt del promotore MDRX (denotato come MDF normalizzato all'attività della luciferasi di Renilla.

Regolazione del promotore del gene MDR1.

Le vie per la trasmissione dei segnali di attivazione di L1 devono avere un "punto di convergenza" comune: la regione regolatrice del gene e dell'mRNA. Per studiare il promotore MDRI, abbiamo utilizzato farmaci che modulano lo stato fisico-chimico della cromatina - inibitori dell'istone deacetilasi, tricostatina A e butirrato di sodio, rappresentanti di classi di farmaci chemioterapici che regolano direttamente la trascrizione genica. È importante confrontare il meccanismo di attivazione dell’MDR da parte di questi agenti con Ara C e doxorubicina, farmaci per i quali la cromatina non è un bersaglio diretto. La tricostatina A e il butirrato di sodio attivano il gene endogeno MDRX nelle cellule H9, K562 e SW620. L'aumento dell'mRNA (Fig. 12, pannello di sinistra) è stato accompagnato dall'attivazione della luciferasi trascritta dal sito -1202M18 nt. Promotore MDRI (Fig. 12, pannello di destra).

Riso. 12. Gli inibitori dell'istone deacetilasi inducono il gene e promotore endogeno MDRX (trasfezione transitoria).

Le cellule Slash, H9, K562 e SW620 sono state trattate con i farmaci indicati per 24 ore. Il livello dell'mRNA di MDRX è stato studiato in GTCR. A destra: le cellule K562 sono state trasfettate con il costrutto -1202/+P8 n.o.-luciferasi. Tra 24 ore. le cellule sono state stimolate con i farmaci indicati per 16 ore. Vengono presentati i risultati di 3 esperimenti.

È stato stabilito che la tricostatina A e il butirrato attivano l’MDRI a causa dell’interazione del fattore di trascrizione NF-Y con la scatola HAAT invertita (Jin e Scolto, 1998), che conferma la catena di eventi “modificazione induttore-cromatina -> attivazione di il promotore della MDRI”. Tuttavia, in condizioni di trasfezione della cintura, la cromatina sul plasmide rimane “imperfetta”.

Per studiare il ruolo della cromatina nell'induzione dell'MDRI, le cellule SW620 sono state trasfettate con il costrutto luciferasi Firefly -1202/+118 nt e un plasmide portante il gene neo; quindi le cellule sono state selezionate per la sopravvivenza in presenza di neomicina. Nei selettivi, così come durante la trasfezione temporanea, la tricostatina A e il butirrato di sodio hanno causato l'accumulo di mRNA MDRI endogeno e hanno indotto la trascrizione dalla regione -1202/+118 i.i. promotore di questo gene. L'attivazione dell'MDRI da parte degli inibitori dell'istone deacetilasi è stata abolita dall'ET743, un bloccante della trascrizione. Ciò mostra una connessione diretta tra l'aumento della quantità di mRNA dell'MDRI e l'attivazione del promotore di questo gene attraverso l'acetilazione della cromatina.

Questi dati sono stati ottenuti quando le cellule sono state esposte ad agenti che modificavano direttamente lo stato fisico-chimico della cromatina. Il meccanismo è sempre identificato, poiché non tutti i farmaci chemioterapici (e altri stimoli esogeni) sono regolatori diretti della cromatina? Abbiamo notato che l'emivita: l'mRNA dell'MDRI aumenta nelle cellule trattate con Ara C e TFA. La Figura 1 mostra che TFA e tricostatina A sono potenti induttori dell'attività del promotore MDRI (trascrizione), mentre né Ara C, né doxorubicina, né ceramide hanno attivato il promotore o hanno causato solo un effetto debole.

Riso. 13. Effetti degli attivatori MDR sull'induzione del promotore MDRI. Le cellule K562 sono state trasfettate con il costrutto luciferasi Firefly -1202/+118 nt, divise in parti uguali e stimolate per 16 ore. i farmaci indicati.

L'attività della luciferasi nelle cellule non trattate, normalizzata rispetto al contenuto proteico totale nei lisati cellulari, è stata impostata su 1. I risultati sono stati riprodotti in 3 esperimenti.

Questi risultati suggeriscono che un aumento del livello di mRNA A/III1 avviene sia come risultato dell'attivazione della trascrizione (TFA, tricostatina A) sia senza induzione diretta del promotore (citosar, doxorubicina, ceramide). In quest'ultimo caso, si dovrebbero riconoscere o i meccanismi di stabilizzazione dell'mRNA, oppure l'attivazione di un gene intermedio, il cui prodotto induce il promotore MIEX o stabilizza la trascrizione (vedi esperimenti con NaκB esogeno).

Tabella 2. Inibitori dei meccanismi di segnalazione che impediscono l'attivazione urgente del gene MF1 tsntozprom.

Farmaco Bersaglio intracellulare Concentrazione inibitoria

cheleritrina PKS 10 µM

calfostina S PKS 1 µM

bis-indolil-

maleimmide I PKS 5 µM

VARTA/AM Ca2+ 5 µM

PDTK No.kV 5 µM

GFKhMK No.kV 25 µM

salicilato di sodio No.kV 20 mM

yutirin №kV 10 mM

Ziesteri plasmatici superiori

membrana degli acidi grassi? Yumkg/ml

1KTSHGOMISHSH Allungamento della trascrizione B? 500-1000ng/ml

x-amanitina RNA polimerasi II 9 μg/ml

zhgeinascischsh 743 non installato 100 nM

La tabella 2 mostra i farmaci farmacologici che rappresentano gruppi di inibitori della trasduzione del segnale che prevengono l'attivazione dell'MDR da parte di cygosar o doxorubicina nelle cellule leucemiche H9 e K562.

Superamento dell'MDR mediato da Pgp: bersaglio della membrana plasmatica

azione citotossica.

Pertanto, l'MDR mediato da Pgp può formarsi abbastanza rapidamente durante una divisione cellulare e persistere in generazioni di cellule sopravvissute. Molti stimoli sono induttori di MDR, compreso l'uso clinico di farmaci antitumorali di vari gruppi chimici. La Pgp è il segno distintivo dei meccanismi che impediscono l'attivazione della morte programmata (apopto) (Johnstone et al., 1999). Pertanto, un tumore che è principalmente resistente agli stimoli apoptogeni e acquisisce rapidamente MDR in risposta al trattamento rappresenta una sfida particolare per la terapia. Quali sono le strategie per superare la resistenza multifattoriale?

È stata studiata la morte di tali cellule sotto l'influenza di effettori immunitari. Il prerequisito per questo approccio erano i dati sul rigetto del mieloma vaccinato da parte degli splenociti che si accumulano durante la vaccinazione dei topi; lo stesso tumore, modificato per esprimere citochine (Turner et al., 1996). Poiché le proprietà delle sottolinee MPC1 IDoxlO-l e MPC1 1Dox10-2 si sono rivelate simili, le cellule MPCllDoxlO-1 vengono analizzate di seguito.

Il fenotipo MDR nei selezionati era caratterizzato da sovraespressione del gene mdrVo, ridotto trasporto di calceina e resistenza alla doxorubicina e alla vincristina, substrati della Pgp. Per creare l'immunità all'inoculazione del mielolo, le cellule MPC11 e MPCI IDoxlO-l sono state trasfettate con il cDNA delle citochine GM-KS IL-12. Il numero di cellule inoculate era cinque volte la dose minima di distruzione del tumore al 100%.

Tabella 3. Tassi di rigetto del tumore nei controlli e

animali immunizzati.

Innesto di topi

MPC11 MPCllDoxlO-1

Intatto 0/15* 0/10

Immunizzazione con cellule MPC11:

cellule irradiate 1/15 0/10

■Cellule trasfettate con M-CSF/IL-12 15/15** 9/10**

Immunizzazione con cellule MPC1 Xox10-1:

cellule irradiate 0/15 0/10

"Cellule trasfettate con M-CSF/IL-12 9/10** 10/10**

Tasso di rigetto del tumore: al numeratore - il numero di topi che non hanno sviluppato un tumore; in 1 sostituzione - il numero totale di topi vaccinati, **P<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.

La tabella 3 mostra che le cellule MPC11 e MPC1 IDoxIO sono produttrici di tumori: nel 100% degli animali non immunizzati, i tumori sono comparsi 8-10 giorni dopo l'inoculazione delle cellule corrispondenti. Tuttavia, nei topi immunizzati con cellule che esprimono citochine, i tumori non sono comparsi (vaccinazione con MPC11) o erano rari (vaccinazione con una sottolinea resistente). L'immunità antitumorale è stata di lunga durata: i tumori non sono comparsi entro 5 settimane dall'inoculazione di cellule fresche. L'incidenza del rigetto del trapianto era simile tra i gruppi immunizzati con cellule MPC 11 e la subline resistente. Questi risultati indicano la possibilità di morte delle cellule maligne resistenti quando esposte ai fattori rilevati negli esperimenti in vivo.

Un tale fattore sono i CTL generati nella milza in risposta all'immunizzazione con cellule che esprimono citolitici. Nella fig. La Figura 14 mostra che gli splenociti di topi immunizzati con cellule MPC 11 che esprimono GM-CSF e IL-12 hanno lisato le cellule bersaglio MPC 11 e MPCllDoxlO-1 con un'efficienza quasi identica (Figura 14).

-ér-MPCU/MPCJlDoilO

MRS11/MRSI

effettore.bersaglio

Riso. 14. Lisi CTL di cellule parentali e Pgp-positive.

Numeratore: cellule da immunizzare, denominatore: cellule da innestare.

Di conseguenza, l’immunità antitumorale negli animali vaccinati con un vaccino cellulare che esprime citochine è associata alla sensibilità delle cellule MDR all’azione logica dei CTL.

L'attività killer dei CTL è dovuta alla secrezione da parte di queste cellule del ligando CD95/Fas e/o del tandem granzima B-perforina (Vetke, 1994). Per risolvere la questione su quale di questi meccanismi funzioni nel sistema in studio, è stata studiata la sopravvivenza cellulare in presenza del ligando Fas. Le cellule MPC11 e MPC1 ShoxY-1 si sono rivelate resistenti anche a concentrazioni relativamente elevate del ligando Fas. Pertanto, il granzima B/perforina dovrebbe essere considerato un meccanismo candidato per l'azione citotossica delle UTJ immunitarie. Infatti, la preincubazione di immuno-CTL con concanamicina A, un inibitore del processamento della perforina, ha ridotto la lisi delle cellule bersaglio MPCllDoxl 0-1 (Fig. 15).

Per trovare modi per superare l’MDR, è importante che le sottolinee con MJB mantengano la sensibilità agli effetti citotossici dovuti alla rottura dell’integrità della membrana plasmatica da parte della perforina. La penetrazione del granzima B nella cellula attraverso i pori della membrana plasmatica formata dalla perforina porterà all'attivazione delle caspasi effegrine. Bassotto

il tandem killer - l'azione simultanea di un agente che forma i pori nella membrana esterna e nella proteasi - consente di provocare la morte di cellule resistenti a una serie di influenze esterne. Pertanto, la membrana plasmatica costituisce un importante bersaglio per la terapia mirata all'eliminazione delle cellule resistenti.

T; con k) o o o

n (o n ii) o o

effettore: bersaglio

Riso. 15. Granznm B/psrforin - meccanismo di morte mediata dai CTL. La concanamicina A (barre aperte) riduce la lisi mediata da CTL delle cellule MPC1 XoxI-1. Le colonne scure indicano la lisi dei target CTL senza preincubazione con concanamicina A. Viene mostrato uno dei 3 esperimenti rappresentativi.

Zerschied e radicali liberi dell'ossigeno nel superare l'MDR. Se la membrana plasmatica è il bersaglio desiderato, come provocarne il danno? È particolarmente desiderabile che tale effetto venga esercitato da un attore comune a molti farmaci antitumorali. Uno di questi “intermediari” è ceramvd. Affinché la ceramide sia efficace per la treodolizzazione dell'MDR, deve soddisfare almeno due requisiti: ;) non essere trasportata fuori dalla cellula dalla Pgp; 2) innescano percorsi di morte che funzionano nelle cellule resistenti. È sufficiente “bypassare” il trasportatore di membrana, il meccanismo principale dell’MDR, per provocare la morte delle cellule resistenti a una serie di agenti?

La ceramide non viene trasportata dalla P-gpicoproteina.

Poiché la ceramide si accumula in risposta a una varietà di farmaci chemioterapici, abbiamo esaminato se questo metabolita soddisfaceva queste condizioni. Si è scoperto che la cinetica dell'accumulo di ceramide nelle cellule parentali K562 e nella loro sottolinea Pgp-positiva K5621/89 sono quasi le stesse (Fig. 16). Allo stesso tempo, le cellule K562^B9 accumulavano significativamente meno rodamina 123 rispetto alle cellule K562 (controllo del trasporto mediato da Pgp). Di conseguenza, la ceramide non è un substrato di trasporto per la Pgp.

8000 6000 4000 2000 0

0 0,05 0,2 1 5 C5-BOO!RU-ceramide

Riso. 16. La Pgp non trasporta ceramide a catena corta. Le cellule K562 e K5621/59 sono state incubate per 30 minuti. con C5-ceramide coniugato con fluorocromo VSY1RU (pannello superiore) o rodamina (III)123 (pannello inferiore). La luminescenza cellulare è stata studiata utilizzando la citometria a flusso. Dati da 3 esperimenti.

Non sono state riscontrate differenze nella citotossicità delle ceramidi sintetiche (C2) e naturali (Ci) per le cellule K562 e K5621/89, così come per le coppie

cellule parentali e selettivi: MCP-7 e MCP-7Ac1g, KV-3-1 e KV-8-5-11. Pertanto, la ceramide provoca la morte delle cellule Pgp negative e Pgp positive con uguale efficienza.

non impedisce la rottura dell'integrità della membrana plasmatica.

Per identificare i meccanismi di morte delle cellule K5621/59 sotto l'influenza della ceramide, sono stati studiati i seguenti parametri: attivazione delle caspasi 9 e 3, scissione della poli-ADP-ribosio polimerasi (PAKP), degradazione del DNA internucleosomiale, traslocazione intramembrana della fosfatidilserina (mediante il legame con l'annessina V), potenziale elettrico mitocondriale transmembrana e integrità della membrana plasmatica (mediante incorporazione di PI nelle cellule). Nella fig. 17 lo mostra entro 24 ore. esposizione alla ceramide, la percentuale di cellule morenti ha raggiunto il 37+4%. Particolarmente importante è stata la comparsa di cellule “doppie positive” (annexina-PI4), il che significa che nelle cellule K562LB9 la ceramide provoca abbastanza presto la rottura della permeabilità della membrana plasmatica (necrosi o apoptosi tardiva). Allo stesso tempo, non è stata rilevata l'attivazione della caspasi 3, caratteristica dell'apoptosi classica; La proteolisi PAS si è rivelata un evento tardivo (48 ore di esposizione).

L'effetto della ceramide sulle cellule K5621/B9 non è stato praticamente accompagnato da un cambiamento nel potenziale transmembrana dei mitocondri: questo indicatore nelle cellule morenti non differiva dal valore corrispondente nelle cellule non trattate. Anche la frammentazione del DNA internucleosomiale non è stata un segno importante di morte: solo circa l'11% degli eventi si è verificato nella regione sub-01 (cellule ipodiploidi), mentre la percentuale di cellule morenti (somma di annessina+/PI, annessina7PI+ e doppi positivi) alla regione l'esposizione per la stessa durata è stata del 64 + 4%. Pertanto, il segno più importante della morte delle cellule K562LB9 sotto l'influenza della ceramide è una violazione precoce dell'integrità della membrana plasmatica - necrosi.

tempo (ore) con ceramide

■ K562,Allegato+ □ K562,Allegato+PI+ BK562i/S9,nH+

IK562.PI+ V K562i/S9,AHHeKCHH+ ■ K562|789,Allegato+PI+

Riso. 17. Indicatori di morte delle cellule K562 e K562L/S9 sotto l'influenza di ceramide. Le cellule sono state trattate con 25 μM di C2-ceramide per i periodi di tempo indicati. La percentuale di annessione di cellule V-positive, ioduro di propidio (PI+) positive e “doppie positive” (annexina + PI+) è stata determinata mediante citometria a flusso.

Nelle cellule K562, p53 non funziona e viene espressa la proteina chinasi chimerica Br/Ab1, cioè Queste cellule contengono determinanti molecolari della resistenza all'apoptosi. Pertanto, la sottolinea K562i/S9 può essere considerata un modello di resistenza pleiotropica, dove la Pgp è uno dei meccanismi. Tanto più importanti sono i dati sulla capacità della ceramide di causare la morte! di tali cellule mediante il meccanismo della necrosi.

I metaboliti che possono causare necrosi possono essere i radicali liberi dell'ossigeno. Per stabilire il loro ruolo nella morte indotta dalla ceramide delle cellule K562/iS9, è stata studiata la citotossicità della ceramide in presenza di N acetilcisteina (NAC), un chelante dei radicali dell'ossigeno, e la velocità di formazione dei radicali dell'ossigeno nelle cellule trattate con è stata studiata la ceramide. b La Fig. 18 mostra che la NAC ha abolito la citotossicità della ceramide. Pertanto, l’ossigeno libero svolge un ruolo decisivo nella morte delle cellule resistenti se esposte alla ceramide. La Figura 19 mostra la dipendenza

Luorescenza delle cellule caricate con OCPOA a seconda del tempo di azione della ceramide e

"agente di controllo - perossido di idrogeno, donatore di O2." H2O2 ha causato una rapida

lo stesso dopo 20 minuti. - aumento della fluorescenza cellulare. Ceramide causato

effetto opposto: dopo 15 minuti. l'impatto è stato osservato essere forte - di 1,5

Riga: riduzione del bagliore. Solo entro 24 ore. intensità di elaborazione

la fluorescenza cellulare è tornata al livello di questo indicatore

cellule trattate e aumentate di 48-72 ore. impatto quando l'importo

C'erano già molte cellule in crescita (Fig. 17). Pertanto, nel elaborato

le cellule ramimidiche subiscono inizialmente riduzione e ossidazione

avviene più tardi, probabilmente a causa dell'esaurimento delle risorse per il ripristino dei substrati utricellulari.

Figura 18. NAC blocca la morte delle cellule K562i/S9. Le cellule sono state trattate con Cr-ceramide senza o con NAC 5 mM. La sola NAC non ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare.

Riso. 19. Ossidazione in cellule K562|/89 sotto l'influenza di ceramide. Le cellule sono state trattate con 25 μM di C2-ceramide per gli intervalli di tempo indicati. L'ossidazione intracellulare è stata studiata mediante cambiamenti nella fluorescenza delle cellule caricate con E>SGOA. H2Og è stato utilizzato come controllo dell’“esplosione di ossigeno”. Vengono riassunti i risultati di 3 esperimenti.

La discussione dei risultati

L'analisi dei meccanismi di attivazione del gene MOI1 ci permette di affermare quanto segue: 1) Il gene AUM e il fenotipo MDR possono essere indotti dall'esposizione a breve termine delle cellule a molte sostanze. La sovraespressione di MBJ\ e l'accumulo di Pgp vengono rilevati nelle cellule che sopravvivono dopo la terminazione! effetti xenobiotici. Pertanto, l'attivazione epigenetica del gene MYR\ fornisce un fenotipo MDR stabile.

2) La formazione urgente di MDR è regolata da meccanismi generali di segnalazione cellulare. Infatti, l'attivazione delle fosfolipasi, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare, l'induzione di NaκB e le cascate di proteine ​​chinasi attivate dallo stress sono meccanismi che assicurano la risposta cellulare allo stress. Inoltre, fattori di trascrizione e siti funzionalmente attivi in

L'ipoMOTopo del gene MDR1, importante per l'attivazione di MDR, non è esclusivo di questo gene: ■JF-Y, CCAAT box e segnali di modulazione della cromatina sono importanti per la regolazione della trascrizione della maggior parte dei geni eucariotici. Questo, a quanto pare, spiega l'elevata inducibilità del gene MDRX: questo gene viene attivato dagli stimoli del piede in cellule di varia istogenesi. A sua volta, la regolazione di MDRX mediante meccanismi generali di implementazione dello stress sottolinea l’importanza iviologica dell’attivazione di MDR insieme ad altre risposte della cellula alle influenze esogene.

3) La molteplicità e l'intercambiabilità dei meccanismi di attivazione di MDR shs.20) sono determinate dalla natura multilivello della regolazione di questo fenotipo. E ciascuno di questi livelli dà alla cellula la possibilità di “scegliere” se attivare o meno l’MDR. In primo luogo, la scelta è dettata dalla natura dello stimolo (diversi soggetti agiscono attraverso meccanismi diversi). In secondo luogo, il meccanismo specifico dipende dalla presenza di determinate molecole di segnalazione e dalla loro interazione in reti di questo tipo. In terzo luogo, la scelta avviene a livello dei meccanismi di ascrizione veri e propri (lo stato della cromatina nella regione del promotore DRI). , le ragioni dell'elevata inducibilità su MDRX (l'ampia intercambiabilità e sovrapposizione dei meccanismi di segnalazione e trascrizione garantisce l'induzione da parte di molti stimoli e in diversi tipi di cellule) e i casi di mancanza di induzione non sono indotti da ogni stimolo e non in ogni esperimento sistema).

Lo schema per l'attivazione urgente del gene MDRX (usando l'esempio di citosar e TFA) è mostrato in Fig. 20.

Il concetto di induzione di MDRX come evento ritardato, che coinvolge prima l'attivazione delle proteine ​​necessarie per l'induzione di toro MDRX, complica ulteriormente il quadro dell'attivazione epigenetica di MDR.<ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,

Regolazione di MY1 mediante chemioterapia e TPA

neomicina, 1173122

attivazione della trascrizione, stabilizzazione dell'mRNA

Riso. 20. Meccanismi di attivazione urgente del gene MY 1.

intensificando o mantenendo il tasso di trascrizione. La possibilità che una cellula scelga diverse modalità di induzione della MDR - diretta (senza attivazione di geni intermedi) e/o mediata dall'induzione di altri geni - rende ancora più difficile prevenire lo sviluppo della MDR.

Attivazione della trascrizione del gene L)/? 1 non è l’unico meccanismo per lo sviluppo dell’MDR. Un'altra componente importante della regolazione epigenetica potrebbe essere la stabilizzazione dell'nRNA MOK 1. È possibile che, in relazione all'equilibrio tra induzione della trascrizione e stabilizzazione dell'mRNA MOK 1, i meccanismi di attivazione dell'MDR sotto l'influenza di vari induttori e in diverse cellule anche i tipi sono diversi. Questa ipotesi è coerente con il concetto di regolazione multilivello dell'espressione del gene MyACh (Fig. 19).

4) La prevenzione mirata della MDR è possibile stabilendo i meccanismi di trasmissione dei segnali di attivazione di M)L1. La necessità di prevenire lo sviluppo dell'MDR in clinica è confermata dalla connessione tra lo sviluppo dell'MDR e la citotossicità dei farmaci. Infatti, il livello di mRNA/εγ1 nelle cellule trattate con tossine aumenta all’aumentare della concentrazione di queste ultime. Di conseguenza, l’uso di regimi chemioterapici ad alte dosi (giustificato per aumentare l’efficacia del trattamento) può portare allo sviluppo di MDR nelle cellule sopravvissute. Le concentrazioni di farmaci necessarie per il completo riassorbimento del tumore possono essere superiori a quelle accettabili per il paziente, il che determina il limite di aumento della dose nella chemioterapia. Gli antagonisti della segnalazione intracellulare sopra identificati potrebbero servire da prototipi per i futuri bloccanti MDR utilizzati in combinazione con i tradizionali farmaci antitumorali. Pertanto, prevenire lo sviluppo urgente della MDR amplia le possibilità di superare questo fenomeno clinicamente sfavorevole.

Quali sono gli approcci per superare l’MDR stabilito? Uno degli obiettivi “vulnerabili” nelle cellule resistenti potrebbe essere la membrana plasmatica. La violazione della sua integrità provoca la morte delle cellule resistenti: la Pgp non impedisce la morte per influenze che inducono necrosi. È stata identificata una struttura cellulare terapeuticamente importante che dovrebbe essere presa di mira. Ovviamente, gli agenti semplicemente membranolitici non sono adatti a causa della tossicità incontrollata sui tessuti, compresi quelli non tumorali. È necessario trovare agenti che superino la barriera Pgp e causino danni alla membrana plasmatica, ad es. creare una concentrazione intracellulare del farmaco sufficiente ad attivare la necrosi. Una sostanza che soddisfa questa condizione può essere la ceramide, uno sfingolipide che si accumula nella cellula in risposta a molti stimoli, compresi i farmaci antitumorali. La ceramide non viene trasportata dalla Pgp, il che garantisce che la concentrazione di questo metabolita nelle cellule resistenti sia sufficiente a indurre la morte.

La tossicità della ceramide nei confronti delle cellule resistenti significa che le vie di segnalazione distali all'accumulo di ceramide in queste cellule non sono bloccate dalla Pgp o da altri meccanismi associati alla selezione MDR. Pertanto, per superare la resistenza è necessario trovare modi per accumulare ceramide (e possibilmente altri metaboliti tossici) nelle cellule resistenti. La citotossicità della ceramide richiede le caveole o i loro analoghi - formazioni sottomembrana ricche di fosfolipidi e proteine ​​che si accumulano durante la selezione per MDR (La\ et al., 1998). È importante sottolineare che la selezione per la MDR può essere accompagnata da un aumento dei bersagli molecolari cellulari per la terapia antitumorale.

Le forme libere di ossigeno sembrano essere un meccanismo essenziale di morte indotta dalla ceramide. Ciò solleva la questione dell’importanza dei mitocondri nella sopravvivenza delle cellule MDR. Via mitocondriale

trasmette segnali aggiuntivi per attivare le caspasi effettrici. ■Il “loop” litocondriale è un potente fattore di potenziamento di tali segnali; “la caduta del potenziale elettrico dei mitocondri e soprattutto il rilascio del citocromo C nel plasma assicurano l'irreversibilità del processo di morte. Poiché non è possibile prevedere se la selezione per la resistenza sarà associata all’inattivazione dell’uno o dell’altro percorso di morte, è importante che solo una cascata “affidabile” rimanga funzionale nelle cellule MDR.

I nostri risultati indicano sensibilità agli adical dell'ossigeno nelle linee cellulari con MDR mediato da Pgp. Si può presumere che, sebbene la resistenza primaria e la selezione della resistenza ai farmaci siano determinate da molti meccanismi, sia ancora possibile superare la resistenza multifattoriale aumentando l’ossidazione intracellulare. L'ossigeno libero entra immediatamente in numerose reazioni di ossidazione, portando a danni a strutture importanti per la vita della cellula: DNA e membrane. Negli esperimenti di cui sopra, la necrosi si è rivelata il metodo principale di sbiancamento quando esposto ai radicali dell'ossigeno. Ciò non significa che la necrosi sia l'unica via di morte indotta da forme libere di ossigeno. In una situazione specifica, dovrebbe essere stabilita la predominanza di questo o altro tipo di morte; La distinzione standard tra apoptosi e necrosi non caratterizza la varietà dei meccanismi di morte. Questa valutazione è utile per determinare se il danno alla membrana è primario o se questo processo è ritardato. Tuttavia sembra importante valutare la permeabilità della membrana plasmatica in ogni situazione: la violazione dell'integrità della membrana provoca irreversibilità, quindi la componente necrotica della morte è importante per la generazione di cellule MDR, poiché la Pgp può proteggere le cellule dagli agenti che inducono l'apoptosi, ma non da sostanze che inducono l'apoptosi, causando necrosi.

L'ultima circostanza non sorprende. Per il funzionamento di questa proteina della membrana plasmatica è necessario un certo stato fisico-chimico dovuto alla sua integrità. Con la necrosi si verificheranno gravi danni alla cellula, principalmente a causa dell'interruzione del trasporto di acqua e ioni. Questi danni influenzeranno quasi tutte le strutture cellulari, a differenza delle cascate apoptotiche, che si esprimono nella scissione sequenziale dei substrati - un processo dipendente dall'energia che comporta la formazione di complessi proteici-lipidici multicomponenti nella cellula e la rigorosa specificità dell'interazione di caspasi con substrati. Il blocco di uno o più collegamenti di tale cascata (ad esempio, a causa di un alterato trasporto dei lipidi nelle cellule con MNA MS, non si formano complessi di segnalazione localizzati "correttamente") interromperà la trasmissione dei segnali ai meccanismi sottostanti, con il risultato che la cellula sfuggire alla morte e, in ultima analisi, alla formazione di resistenze. Anche per questo, per contrastare l'MDR, è auspicabile che i meccanismi di morte siano molteplici e comprendano l'attivazione non solo delle caspasi, ma: di altre famiglie di proteasi (lisosomiali, proteasomiali, nucleari), così come il potenziamento del segnale (via mitocondriale) e l'interruzione della permeabilità della membrana plasmatica. Quanti più meccanismi di morte possono essere attivati ​​nelle cellule resistenti, tanto più affidabile sarà il risultato finale nel superare l’MDR.

1. Il gene MYR\ e il fenotipo MDR mediato dalla glicoproteina P possono essere indotti da una singola esposizione a breve termine alle cellule MN< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в

zioni di cellule sopravvissute dopo l'esposizione. L'attivazione epigenetica sul MOT produce un fenotipo MDR stabile.

2) La formazione urgente di MDR è assicurata dall'attivazione dell'espressione del gene ER1: induzione della sua trascrizione e stabilizzazione dell'mRNA.

3) L'attivazione dell'MDR coinvolge i mecasomi generali della risposta cellulare allo stress: la via dello sfatidilinositolo, la proteina chinasi C, la mobilitazione dei 2+ intracellulari, l'attivazione di NaκB, le proteine ​​chinasi attivate dal mitogeno e la regolazione dello stato fisico della cromatina. L’inibizione di questi meccanismi impedisce lo sviluppo di MDR nelle cellule che sopravvivono al trattamento con questi farmaci antitumorali.

4) Il superamento della barriera PgP e l'induzione dei meccanismi di morte che funzionano nelle cellule con MDR sono condizioni necessarie e sufficienti per la distruzione di tali cellule.

5) La Pgp individualmente e il fenotipo MDR nel suo insieme non garantiscono la sopravvivenza della pgp sotto influenze che causano una violazione primaria dell'integrità della membrana omatica. Pertanto, la membrana plasmatica è un bersaglio apeutico e l’induzione della necrosi è una delle strategie per superare la resistenza arteriosa.

6) La morte delle cellule con MDR, causata da una violazione dell'integrità della membrana zimatica (lisi mediata dalla perforazione), è causata da linfociti T otossici generati in risposta all'immunizzazione con cellule cole modificate per esprimere citochine.

7) I metaboliti intracellulari che possono danneggiare la membrana enzimatica e causare la morte delle cellule con MDR sono molecole di ossigeno libero. La loro generazione sotto l'influenza di farmaci antitumorali è un meccanismo efficace per superare l'MDR.

Principali pubblicazioni sull'argomento della tesi:

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Servizio di apparecchiature di copiatura del Centro statale di ricerca scientifica dal nome. H.H. Blokhin RAMS Firmato per la pubblicazione 14 . II.03 Ordine n. 24"/. Tiratura 100 copie.

Questo lavoro di tesi dovrebbe essere disponibile nelle biblioteche nel prossimo futuro.

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Shtil, Aleksandr Albertovich. Resistenza ai farmaci delle cellule tumorali mediata dalla glicoproteina P: meccanismi di formazione urgente e approcci al superamento: abstract della tesi. ... Dottore in Scienze Mediche: 14.00.14.- Mosca, 2003.- 46 p.: ill.

Introduzione all'opera

Pertinenza dell'argomento

I. Resistenza multifarmaco delle cellule tumorali:

Meccanismi biologici e significato in oncologia.

Nonostante i significativi progressi in campo farmacologico, compreso lo sviluppo della tecnologia per la creazione di farmaci con le proprietà attese, il successo della chemioterapia per i tumori è limitato dalla caratteristica più importante dei sistemi viventi: la capacità di rispondere ai cambiamenti nell'ambiente esterno. Una delle manifestazioni di tale dasticità è lo sviluppo della resistenza delle cellule tumorali ai farmaci [usati nella chemioterapia. L’ampia distribuzione e la natura persistente e a lungo termine dell’adattamento cellulare alle influenze esterne suggeriscono che il superamento della resistenza ai farmaci può essere associato non solo alla ricerca di farmaci più efficaci: probabilmente non esiste farmaco al quale le cellule non siano in grado di sviluppare resistenza. Solo la delucidazione dei meccanismi nologici di resistenza ai vari tipi di stress servirà come base per lo sviluppo di strategie per superare la resistenza ai farmaci, una condizione necessaria per aumentare l'efficacia del trattamento dei pazienti affetti da cancro.

La resistenza multifarmaco (MDR) delle neoplasie - la preservazione della vitalità da parte delle cellule tumorali in risposta agli effetti di vari farmaci - è uno dei motivi principali della progressione! Malattie: il tumore è insensibile alla chemioterapia, indipendentemente dalla combinazione di farmaci utilizzata. Il fenomeno MDR ha un carattere stabile e a lungo termine: i meccanismi di resistenza vengono ereditati attraverso generazioni di cellule. Pertanto, l’MDR è uno dei fattori chiave nella progressione del tumore.

Esistono due tipi principali di resistenza cellulare alle tossine. Primario, ad es. La resistenza osservata prima dell'esposizione ai farmaci chemioterapici è dovuta all'espressione di meccanismi di difesa durante la progressione del tumore. Sì, attivazione

i meccanismi anti-apoptotici che conferiscono resistenza agli effettori immunitari possono essere correlati alla resistenza ai farmaci. La resistenza secondaria (acquisita) si verifica nelle cellule esposte allo stress. Prima di questi effetti, i meccanismi protettivi in ​​tali cellule sono scarsamente espressi o assenti; sopravvivendo dopo il trattamento con una tossina, le cellule acquisiscono resistenza a molte sostanze - MDR (Riordan, Ling, 1985). Un'ulteriore selezione consolida il fenotipo acquisito nel corso di generazioni di cellule.

Il meccanismo più importante dell'MDR è il ridotto accumulo di tossine nella cellula, dovuto all'escrezione di sostanze nell'ambiente intercellulare. Tale trasporto è effettuato dalla proteina integrale della membrana plasmatica, la glicoproteina P (Pgp), grazie all'energia dell'idrolisi dell'ATP (Juliano, Ling, 1984)."! La Pgp umana è codificata dal gene MDRI(resistenza multifarmaco 1), localizzata sul cromosoma 7 (Chen et al., 1986). Numerosi dati indicano che un aumento dell'mRNA MDRI e la Pgp spesso funge da fattore nella resistenza di più tipi di tumore al trattamento (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).

II. Sviluppo di MDR nelle cellule tumorali: biologico meccanismi come obiettivi Per prevenzione

È ragionevole supporre che un aumento della quantità di mRNA MDRI causato dall’amplificazione di questo gene. Questo meccanismo MDR è stato identificato in linee cellulari in coltura selezionate per la sopravvivenza in presenza di tossine (Roninson, 1991). Tuttavia, quando si analizzano i tumori umani, si nota l’amplificazione genetica MDR1 non è stata rilevata né nei tumori primari né nelle neoplasie dopo il trattamento. Una probabile causa di MDR clinica è la sovraespressione MDRI e Pgp con struttura genica invariata (conservazione del numero di copie e della sequenza nucleotidica), cioè attività epigenetica del fenotipo. Nelle colture di cellule tumorali umane, un aumento del livello di mRNA MDRI e la quantità di Pgp rilevata durante un singolo trattamento di chemioterapia

distinti nella struttura chimica e nei meccanismi d'azione (Chaudhary, Aninson, 1993). È stata ottenuta la prova dell'accumulo di mRNA MDR\ nelle metastasi del cancro al tessuto polmonare già 20-50 minuti dopo l'inizio dell'infusione polmonare intraoperatoria con doxorubicina (Abolhoda et al., 1999). Questi risultati (confermano la possibilità di attivazione epigenetica dell'MDR nell'esperimento e in altre situazioni: aumento dell'mRNA MDR\ e la Pgp nei tumori può verificarsi senza amplificazione genetica MDRI.

Questo tipo di regolazione biologica - attivazione urgente del fenotipo - comporta l'induzione della trascrizione del gene (geni) che codifica il fenotipo corrispondente e/o il controllo post-trascrizionale (stabilizzazione delle NK, regolazione della sintesi e del funzionamento delle proteine). per MDR, questo tipo di regolazione significa la possibilità di induzione genetica MDR\ stimoli cellulari e lo sviluppo relativamente rapido di resistenza nelle cellule r/colesterolo in risposta allo stress. Inducibilità genica MDRI suggerisce lo sviluppo di vie di segnalazione dalla periferia cellulare al nucleo. Tali percorsi potrebbero includere meccanismi di segnalazione che implementano lo stress: proteina chinasi C ІКС), fosfolipasi e Ca 2+ intracellulare, chinasi urinarie attivate dal mitogeno, fattore nucleare kappa B (NFkB). Segnalazione alla regione regolatoria di un gene MDRI e la trascrizione garantisce l'attivazione della compressione genetica.

Lo studio della regolamentazione MDR ha anche un aspetto pratico fondamentale. L'inibizione di questi meccanismi mediante influenze farmacologiche e/o genetiche impedirebbe lo sviluppo di MDR nel processo [myoteragash.

III. Superare l'MDR formato delle cellule tumorali.

Se si blocca un gene attivante MDR\ i segnali possono impedire la formazione di MDR nelle cellule sensoriali primarie, quindi tali

l'approccio non è applicabile per superare la resistenza già formata. Il metodo tradizionale per combattere l'MDR secondario è l'uso di modulatori Pgp in combinazione con citostatici (Lehne, 2000). Tuttavia, l’uso degli inibitori della Pgp è limitato dagli effetti collaterali (disturbi del ritmo cardiaco, squilibrio immunologico). È altrettanto importante che l'efficacia delle combinazioni modulatore + ormone statico possa essere ridotta a causa del blocco di almeno alcuni meccanismi di morte cellulare durante la selezione per MDR.

Il superamento dell'MDR formato è ottenibile se vengono soddisfatte due condizioni: 1) la concentrazione del farmaco deve essere sufficiente per attivare i meccanismi effettori della morte cellulare, 2) le funzioni di questi meccanismi devono essere preservate nelle cellule con MDR. La prima condizione è soddisfatta se il farmaco supera la barriera Pgp. Tuttavia, è necessario dimostrare che il raggiungimento di una concentrazione intracellulare critica dell'agente è sufficiente per attivare la morte di una cellula resistente a molti agenti. I meccanismi di sopravvivenza che operano nelle cellule resistenti dovrebbero servire come obiettivi per l'eliminazione di queste ultime.

Per implementare la seconda condizione, gli approcci mirati alla lisi delle cellule resistenti come meccanismo per indurne la morte sembrano promettenti. La vaccinazione di topi con cellule di mieloma singenico trasfettate con cDNA di alcune citochine porta allo sviluppo di una risposta immunitaria mediata dai linfociti T citotossici (CTL) e al rigetto del tumore trapiantato negli animali immunizzati (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al ., 1996). I CTL lisano le cellule utilizzando il granzima B e la perforina. Poiché il granzima B attiva la caspasi 3, uno degli effettori distali dell'apoptosi, e la perforina provoca un danno primario alla membrana plasmatica (necrosi), si può sperare che gli SL siano efficaci se i meccanismi di morte prossimale vengono bloccati; attivazione di collegamenti distali di apoptosi in combinazione con necrosi

porta alla morte delle cellule resistenti ai farmaci antitumorali - promotori della morte cellulare programmata.

Formulazione del problema

L'MDR è un fenomeno clinicamente sfavorevole, il cui superamento richiede la conoscenza dei meccanismi del suo sviluppo e delle modalità con cui avviene la morte cellulare; è necessario studiare entrambi gli aspetti del problema. Innanzitutto è necessario studiare i meccanismi di sviluppo dell'MDR nella MD/? l/Pgp-negative, lo studio di questi meccanismi servirà a prevenire lo sviluppo di resistenza nelle cellule prevalentemente sensibili. In secondo luogo, l'analisi dei processi di morte operanti nelle cellule con MDR creerà le basi per superare la resistenza in situazioni in cui si è formato MDR secondario.

Lo scopo dello studio è stabilire i meccanismi di formazione urgente dei linfonodi nelle cellule tumorali umane e sviluppare approcci per superare questa resistenza.

Ottimizzare modelli per lo sviluppo di MDR in colture di cellule tumorali umane in risposta agli effetti della chemioterapia e di agonisti e antagonisti sperimentali dei meccanismi di segnalazione.

Determina quelli principali! meccanismo di sviluppo urgente dell'MDR quando le cellule vengono trattate con agenti antitumorali: amplificazione genica MDRI, selezione di cellule Pgp-positive o soppressione de novo MDR.

Indagare le vie di trasmissione del segnale intracellulare che regolano l'attivazione di MDR - proteina chinasi C, fosfolipasi C, Ca + cellulare, proteina chinasi attivata dal mitogeno, NFkB).

Identificare il ruolo dell'attivazione trasgressiva e della regolazione posttrasgressiva (stabilità dell'mRNA) dell'espressione genica MDRI nello sviluppo immediato di MDR in risposta all’esposizione alla chemioterapia.

Sviluppare modi per prevenire lo sviluppo di MDR nelle cellule tumorali quando si combinano farmaci chemioterapici con bloccanti MDR\- attivando vie di segnalazione e inibitori della trascrizione genica

Studiare la cinetica di attivazione delle caspe secernenti ed effettrici, i cambiamenti nel potenziale transmembrana dei mitocondri, la scissione proteolitica della poli(ADP)ribosio polimerasi, la frammentazione del DNA internucleosomale e l'integrità della membrana plasmatica nelle cellule parentali e le varianti con MDR quando trattate con un farmaco non trasportato dalla glicoproteina P.

Utilizzare la vaccinazione con cellule tumorali che esprimono citochine per generare una risposta immunitaria contro le cellule MDR.

Provvedimenti presentati a difesa.

La formazione di MDR mediata da Pgp - una risposta cellulare urgente a molte influenze - è mediata dall'attivazione epigenetica del gene MDRI. Questa attivazione è dovuta a molteplici meccanismi di segnalazione intracellulare, induzione del promotore genico e stabilizzazione dell'mRNA e può essere prevenuta dagli inibitori di questi segnali.

Il superamento dell’MDR mediato da Pgp può essere associato al targeting della membrana plasmatica delle cellule resistenti. La Pgp non protegge le cellule dall'interruzione dell'integrità della membrana plasmatica - necrosi.

Background scientifico Per la prima volta è stata concretizzata l'idea della formazione di MDR come risposta urgente di una cellula ad uno stimolo esogeno;

Per la prima volta è stato studiato in dettaglio il meccanismo di sviluppo di uno specifico fenotipo di resistenza ai farmaci, MDR mediato da Pgp: attivazione epigenetica del gene che codifica per questa proteina MDRI.

3. Per la prima volta è stato sviluppato un modello di attivazione genica urgente MDRI,

accompagnato dall'acquisizione di un fenotipo stabile di MDR mediato da Pgp in cellule tumorali umane in coltura; \. Sono state identificate vie di trasduzione del segnale, meccanismi di attivazione della trascrizione e regolazione genica post-trascrizionale MDRX nelle cellule esposte ai farmaci antitumorali. 5. Per la prima volta sono state caratterizzate classi di sostanze farmacologiche - bloccanti della trasmissione del segnale intracellulare - in grado di prevenire la formazione di MDR mediata da Pgp nelle cellule tumorali. 5. Per la prima volta sono stati studiati i meccanismi di morte operanti nelle cellule con MDR mediata da Pgp ed è stato sviluppato un approccio per superare la resistenza, che comportava un danno primario all'integrità della membrana plasmatica.

Valore pratico.

Sviluppo di metodi per prevenire lo sviluppo urgente di MDR mediato da Pgp in cellule tumorali in coltura esposte a farmaci chemioterapici.

Sperimentazioni precliniche di vaccini geneticamente modificati per superare l’MDR.

Approvazione del lavoro.

La tesi è stata discussa il 30 giugno 2003 in una conferenza congiunta di laboratori di genetica delle cellule tumorali, citogenetica con un gruppo di genetica molecolare, oncogeni virali e cellulari, endocrinologia molecolare, immunità antitumorale, farmacologia biochimica, ricerca medica, diagnostica sperimentale e bioterapia dei tumori; Dipartimento di Schmunologia, Ematologia, Chemioterapia, Farmacologia Clinica, Metodi di trattamento avanzati del Centro russo di ricerca sul cancro da cui prende il nome. NN Blokhin RAMS.

I principali materiali della tesi sono stati presentati alle seguenti conferenze: 2° simposio internazionale "Cytostatic Drug Resistance", (U Germania, 1991); Conferenza Gordon "Advances in Chemotherapy" (New York, Londra, USA, 1994); "Tossicologia molecolare" (Copler Mountain, USA, 1995); "Risposte genomiche inducibili" (Stevenson, USA, 1996); "Acidi nucleici - Integrazione di diagnostica e terapia molecolare" (San Diego, USA, 1996); conferenza annuale dell'American Association of Cancer Research (1994-2001): 6a E 7° congresso "Advances in Oncology", (Hersonissos, Grecia, 2001,2002); "La struttura e le funzioni del nucleo cellulare" (San Pietroburgo, 2002), nonché ai seminari presso Oncotech, Inc. (Irvine, USA, 1996), Salk Institute (LaJolla, USA, 1997), Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, USA, 1997), The Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA, 1997), Sloan-Kettering Cancer Center, New Yo ] USA, 1999), università di Copenaghen (2002), Innsbruck (2002) e Groningey (2003), Università statale di Mosca. M.V. Lomonosov (2002), Istituto di ricerca di patologia sperimentale, oncologia e radiobiologia dal nome. RE Kavetsky (Kiev, 2002).

Pubblicazioni.

Struttura e ambito della tesi.

Studi sulla morte cellulare programmata - apoptosi (dal greco. αποπτωσις - caduta delle foglie) - nell'ultimo decennio hanno comportato diverse importanti scoperte scientifiche: è stato scoperto un sistema olistico per l'attuazione di questo fenomeno - sono stati identificati i geni che lo regolano, nonché i recettori cellulari superficiali e i loro ligandi che mediano la morte cellulare.
In numerosi esperimenti, gli scienziati hanno dimostrato: la morte programmata è una proprietà obbligatoria e integrale di qualsiasi cellula di qualsiasi sistema multicellulare. (Ogni giorno, circa il 5% delle cellule del corpo subiscono l'apoptosi e altre nuove prendono il loro posto. Una cellula impiega da 15 minuti a 2 ore per scomparire senza lasciare traccia).
Nel 2002, il biologo molecolare Sidney Brenner ( Sydney Brennero, Robert Horwitz ( H. Robert Horvitz) e John Sulston ( John Edward Sulston) per le scoperte nel campo della “regolazione genetica dello sviluppo degli organismi e della morte cellulare programmata” è stato insignito del Premio Nobel per la fisiologia e la medicina.
Gli esperti ritengono che ulteriori ricerche sull'apoptosi potrebbero contribuire allo sviluppo di farmaci contro malattie pericolose come cancro, ictus, infarto, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e alcune altre.

ALESSANDRO ALBERTOVICH STIHL– Dottore in Scienze Mediche, Direttore del Laboratorio sui Meccanismi di Morte delle Cellule Tumorali, Istituto di ricerca sulla cancerogenesi, Centro russo di ricerca sul cancro omonimo. N.N. Accademia russa delle scienze mediche Blokhin.

Specialista nel campo dell'oncologia cellulare e molecolare.

Interessi scientifici: meccanismi di morte cellulare programmata (batteri ed eucarioti, in particolare cellule tumorali).

Domande_Elena Vetrova
Marzo aprile
Mosca, 2009

Alexander Albertovich, l'apoptosi è uno dei processi biologici chiave che si verificano nel corpo durante tutta la sua vita. Svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale del corpo (morfogenesi), nel mantenimento dell'equilibrio dinamico negli organi e nei tessuti (omeostasi) e nel processo di iniziazione e sviluppo dei tumori(cancerogenesi).
In quali altri casi si attiva il programma di suicidio cellulare nel corpo? E come fa questo programma a “sapere” cosa fa bene al corpo e cosa fa male?

La morte programmata viene attivata durante i processi fisiologici - negli organismi più semplici, ad esempio i batteri, per mantenere la dimensione della popolazione cellulare ottimale per determinate condizioni ambientali (nutrienti, temperatura). Questo effetto si osserva nei biofilm, comunità batteriche autoregolanti.
Nello sviluppo embrionale dei tessuti e degli organi degli organismi superiori e nell'organismo adulto, la morte programmata serve a sostituire le popolazioni cellulari - che invecchiano e perdono funzioni - con quelle giovani.
Il programma non sa cosa è bene e cosa è male per il corpo, è proprio come funziona la vita: la morte è un lato della vita...

Cioè, un effetto collaterale dell'evoluzione è quellodi cosa parla August Weissmann?Zoologo ed evoluzionista tedesco, scrisse alla fine del XIX secolo...

...Pertanto, la morte delle cellule non tumorali durante la chemioterapia è negativa: qui l'apoptosi delle cellule normali è indesiderabile, ma il programma non distribuisce tra “cattivo e buono”, ma consente a chi può sopravvivere di sopravvivere, distruggendo le più vulnerabile, più sensibile... La giustizia nella comprensione umana non funziona qui, e devi pagare per questa disperazione e "senza principi".

Gli scienziati hanno appreso dell'esistenza dell'apoptosi non molto tempo fa, circa mezzo secolo fa. In che modo questa scoperta ha influenzato lo sviluppo della scienza?

Questa scoperta ha permesso in breve tempo - nell'arco di circa 15 anni - di formulare idee sui processi biologici più importanti - la trasmissione dei segnali intracellulari, la regolazione della proteolisi - il processo di degradazione delle proteine ​​e dei peptidi nel corpo, la regolazione della forma del nucleo, degli organelli e delle membrane.

Lo studio del ruolo delle proteine ​​della cromatina nell'espressione genica si è intensificato.

Le idee sul meccanismo d'azione degli agenti citostatici, principalmente farmaci antitumorali e radiazioni ionizzanti, sulle cellule tumorali e normali sono comprovate.

La scoperta dei meccanismi della morte cellulare oggi ha focalizzato molte direzioni scientifiche: dalla biologia e chimica alla terapia delle malattie umane, animali e vegetali.

Sì, questa direzione è considerata una delle più promettenti nella biologia molecolare. È ottimisticamente associato allo sviluppo di farmaci fondamentalmente nuovi per il trattamento di malattie degenerative ancora incurabili, del cancro e persino della possibilità di sconfiggere la vecchiaia.
Secondo alcuni rapporti, oggi più di quattrocento laboratori nel mondo sono in qualche modo coinvolti in questo argomento.

La promessa dello studio dell'apoptosi per la biologia molecolare è dovuta al fatto che questo fenomeno (e, più in generale, la morte cellulare) copre una combinazione di molte idee e direzioni scientifiche. Una cellula, semplice o complessa che sia, è sempre un sistema complesso e la morte è una proprietà integrale degli esseri viventi. Pertanto, lo studio della morte è generalmente promettente per comprendere l'essenza della vita.
E in effetti, in termini pratici, lo studio dei meccanismi di morte permetterà di precisare l'effetto di numerosi farmaci.

Relativamente recentemente, il fenomeno è stato scoperto effetto spettatore (« effetto spettatore"): quando le cellule che muoiono per qualsiasi motivo inviano un certo segnale alle cellule sane adiacenti a loro, e queste si autodistruggono. Cosa li motiva? Ci sono ipotesi a riguardo?

Questo è un esempio di regolazione biologica in un sistema complesso: in questo modo le cellule si uccidono a vicenda inviando segnali alle vicine. Il segnale (solitamente una proteina idrosolubile) non è dannoso per le proprie cellule, ma è distruttivo per le cellule di origine diversa situate nella stessa popolazione: il gioco si basa su questa differenza di sensibilità.

Qual è il ruolo dell'ossigeno e del perossido di idrogeno nel processo di apoptosi?

Molto importante: i radicali dell'ossigeno sono chimicamente molto attivi. Innescano reazioni che danneggiano proteine, acidi nucleici e lipidi.

Su questa proprietà si basa l’effetto terapeutico delle radiazioni ionizzanti e degli antibiotici antraciclinici. L'eccitazione di speciali composti chimici - fotosensibilizzatori - da parte della luce provoca un'esplosione di ossigeno e gravi danni cellulari. Se un tale fotosensibilizzatore si accumula in un tumore e quest'ultimo viene illuminato, si verifica la morte delle cellule tumorali. In oncologia tale terapia è detta fotodinamica ed è largamente utilizzata, però, per tumori accessibili alla luce e di dimensioni non molto grandi.

Il principio dell'apoptosi si osserva sia a livello cellulare che subcellulare, nei tessuti e negli organi. L'accademico dell'Accademia russa delle scienze Vladimir Skulachev ha proposto di chiamare questo fenomeno fenoptosi. Perché in natura alcune piante e animali (il bambù dopo la fioritura, il salmone dopo la deposizione delle uova) attivano un programma di autodistruzione nel pieno della loro vita? È improbabile che ciò sia dovuto a mutazioni genetiche irreversibili.

Probabilmente non correlato, ma questo è il meccanismo della natura - il linguaggio in cui si dice che il bambù sbiadito morirà... Il meccanismo è epigenetico - non ci sono mutazioni, ma ci sono rapidi cambiamenti nelle proprietà fisico-chimiche della cromatina , e un gene importante (geni) dal funzionamento diventa silenzioso. Un linguaggio del genere non richiede alcuna distruzione: è sufficiente attaccare o staccare un gruppo chimico - metile, fosfato, acetile - da una proteina all'altra.
Abbastanza suggerimento...

Si ipotizza che il cancro sia anche la morte programmata di un organismo geneticamente instabile contenente danni irreparabili (e quindi pericolosi per l'evoluzione). Si sentono sempre più spesso gli oncologi affermare che l'aspetto di una cellula completamente trasformata è solo questione di tempo. Se è così, allora il cancro non è una malattia, come la vecchiaia, ma un certo risultato dello sviluppo di un sistema vivente. Ma gli scienziati presuppongono, e i futurologi prevedono, una vittoria sul cancro in futuro. E in effetti, alla fine, l'uomo ha smesso da tempo di aspettarsi misericordia dall'evoluzione. È possibile sconfiggere il cancro?

Forse non può essere sconfitto: il cancro è uno dei meccanismi per la rimozione di un individuo non vitale, insieme ad altri processi patologici tipici: infiammazione, allergie. La vita organica si basa sul ricambio degli organismi: la morte è inevitabile e sono necessari meccanismi per la sua attuazione. Il cancro è uno di questi meccanismi. Il compito degli scienziati è ritardare la morte, non evitarla.

Se esiste una forte connessione tra l'invecchiamento e lo sviluppo del cancro, e apparentemente nessuno ne dubita, forse è necessario espandere il fronte della lotta contro questo cancro alla scala della lotta contro l'invecchiamento?

La lotta contro l'invecchiamento è necessaria sia come parte della lotta contro i tumori che sotto altri aspetti: questo è fuori dubbio.

La difesa antitumorale del corpo si basa sull'apoptosi. Perché l'apoptosi smette di funzionare dopo una serie di mutazioni? Perché a un certo punto il corpo smette di resistere e inizia ad aiutare il tumore (ad esempio il sistema immunitario)?

Perché l'apoptosi, come ogni processo biologico, viene interrotta dalle mutazioni, e anche perché l'apoptosi può essere facilmente interrotta senza mutazioni.

Qual è il ruolo del gruppo di enzimi del citocromo P450 nel processo di cancerogenesi?

3.Sir John Sulston- Biologo britannico, membro della Royal Society of Great Britain. Il suo laboratorio ha compilato una descrizione completa dell'ordine di divisione delle cellule embrionali del nematode Caenorhabditis elegans e ha tracciato il destino di tutte le sue 959 cellule durante lo sviluppo.

Senza dubbio. L'esistenza di tali proteine ​​conferma il significato essenziale dell'apoptosi in biologia: i meccanismi di questo fenomeno non sono casuali, sono codificati nel DNA della cellula ed entrano in azione quando c'è un segnale appropriato. Senza di loro non c'è morte.

Recentemente, ricercatori americani dell'Albert Einstein Institute of Medicine hanno scoperto che un piccolo frammento della proteina intracellulare p115 attiva l'apoptosi.
Prima dell'apoptosi, p115 si scompone in due frammenti, il più piccolo dei quali è costituito da 205 aminoacidi. Secondo gli scienziati, svolge un ruolo importante nel processo di morte cellulare, poiché la sua espressione porta al rilascio del citocromo C dai mitocondri nel citoplasma delle cellule, che porta alla loro morte. Gli scienziati sperano che questa scoperta possa portare allo sviluppo di nuovi farmaci per combattere il cancro e altre patologie caratterizzate da un'eccessiva proliferazione cellulare.
Secondo lei, quali delle ultime scoperte nel campo dell'apoptosi sono fondamentali per la medicina e la biologia?

Nuovi approcci al trattamento delle malattie proliferative si basano su un fenomeno simile: creare le condizioni in cui le proteine ​​​​della cellula funzionerebbero come killer. Pertanto, la scissione proteolitica della proteina poli(ADP-ribosio) polimerasi, che avviene durante l'induzione dell'apoptosi, forma il suo frammento che si lega al DNA e impedisce la riparazione del suo danno. La normale proteina poli(ADP-ribosio) polimerasi, necessaria per curare i danni al DNA, diventa distruttiva per la cellula.

Tra le ultime scoperte che trovano ora importanti applicazioni pratiche per la regolazione della morte cellulare c'è la prova della possibilità di sopprimere un gene specifico in una cellula e nell'intero organismo attraverso l'introduzione del cosiddetto RNA antisenso a forcina corta.

Tecnologia del gene silenzioso ( silenziamento geni), quando il legame di brevi molecole di RNA a doppio filamento con la sequenza regolatrice del gene bersaglio consente di arrestare il processo di sintesi in questo gene.
Promettente terapia genica vettoriale (virale).

Questi strumenti, frutto di anni di collaborazione tra chimici e biologi, consentono di ottenere l’arresto genetico a lungo termine. Se i prodotti di tali geni sono importanti per la vitalità cellulare, ne induciamo la morte con effetti collaterali minimi. Quest'ultimo è particolarmente importante in una clinica oncologica: spesso la chemioradioterapia è tollerata dai pazienti più gravemente della malattia stessa... I farmaci standard non sono ancora chiari su quali cellule distruggere e in che modo. La terapia genica potrebbe essere più efficace e gli effetti collaterali del trattamento potrebbero essere ridotti.

Indubbiamente fruttuoso, pur incontrando non poche difficoltà, è il concetto di target-directed - mirato - (dall'inglese in bersaglio - obiettivo, bersaglio) terapia del tumore.

Nella fig. D effetto del farmaco Herceptin - (prodotto da Roshe / Svizzera). Creato sulla base di anticorpi in grado di bloccare le proteine ​​​​del recettore HER2.
Inibisce lo sviluppo del tumore.
Stabilizza le condizioni del paziente.
Riduce il periodo di chemioterapia.

(La fig. si ingrandisce cliccandoci sopra con il cursore)

I singoli farmaci creati per inattivare un bersaglio specifico (proteina) in una cellula tumorale sono altamente efficaci e ben tollerati nel corso di lunghi cicli di trattamento (esempi: Gleevec, Iressa).

Il vostro laboratorio è impegnato nella ricerca sulle strategie per individuare i percorsi di inizio e attuazione della morte delle cellule tumorali. A che punto sei arrivato a risolvere questi problemi?

Gli specialisti del nostro laboratorio hanno stabilito i meccanismi di morte delle cellule tumorali sotto l'influenza di nuovi farmaci creati in Russia. In particolare, è stato individuato un meccanismo grazie al quale è possibile aggirare la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali: nuovi composti chimici superano la barriera che altrimenti impedirebbe ai farmaci di entrare nella cellula.

Oltre a ricercare il ruolo dei composti chimici nella riprogrammazione delle cellule in cellule tumorali e nella morte delle cellule tumorali, lei è impegnato a chiarire i meccanismi molecolari della morte cellulare. Cosa resta poco chiaro su questi meccanismi? A quali domande gli scienziati devono ancora rispondere?

È importante capire come evitare di indurre l’apoptosi nelle cellule non tumorali. Uccidere una cellula non è un problema, il problema è come proteggerne una sana...

Il vostro laboratorio sta lavorando allo studio dei meccanismi della funzione killer delle cellule tumorali? È possibile, in linea di principio, bloccare l'attività distruttiva del corpo di una cellula tumorale e il suo effetto sui tessuti normali?

Possibile e necessario. Sembra che i mezzi inattivino il fattore di necrosi tumorale, una tossina secreta da una cellula tumorale e che provoca la distruzione delle cellule normali, una sorta di effetto spettatore. Questi prodotti sono in fase di sperimentazione clinica iniziale.

Hai lavorato negli USA per otto anni. Cosa distingue l’approccio russo da quello occidentale nella lotta contro il cancro? È noto che negli Stati Uniti vengono stanziati ingenti fondi per combatterla e prevenire il cancro. E il risultato più importante di queste misure è che la mortalità per cancro sta gradualmente diminuendo.
In Russia la situazione relativa all’incidenza del cancro rimane difficile. Quali misure possono invertire la situazione sfavorevole?

Lo stile scientifico occidentale è caratterizzato dal desiderio di uno studio approfondito dei meccanismi, e non solo dei fenomeni, dalla completezza della rappresentazione, grazie ad ampie connessioni interdisciplinari, e dall'elevata competizione per la creazione di importanti informazioni scientifiche.

La mortalità per cancro continua a essere un problema globale, ma in alcune località la situazione è migliorata. Ad esempio, si sono verificati meno casi di cancro allo stomaco - le condizioni dietetiche sono cambiate, la conservazione a lungo termine degli alimenti è diventata sicura con lo sviluppo dell'industria della refrigerazione, è stata organizzata la propaganda anti-tabacco - queste misure pubbliche stanno effettivamente portando risultati positivi .
Sull'innovazione in assistenza sanitaria(principalmente nel campo della cura del cancro) pianificati $ 10 miliardi– il doppio di quanto previsto per l'esercizio in corso.

E la situazione in Russia può essere migliorata unendo gli sforzi congiunti di molti strati sociali e, naturalmente, con finanziamenti adeguati per compiti così complessi e importanti.