Programirana ćelijska smrt. Alexander Shtil
Da biste suzili rezultate pretraživanja, možete precizirati svoj upit navođenjem polja za pretraživanje. Lista polja je prikazana iznad. Na primjer:
Možete pretraživati u nekoliko polja istovremeno:
Logički operatori
Zadani operator je I.
Operater I znači da dokument mora odgovarati svim elementima u grupi:
istraživanje i razvoj
Operater ILI znači da dokument mora odgovarati jednoj od vrijednosti u grupi:
studija ILI razvoj
Operater NE isključuje dokumente koji sadrže ovaj element:
studija NE razvoj
Vrsta pretrage
Kada pišete upit, možete odrediti metodu kojom će se fraza tražiti. Podržane su četiri metode: pretraživanje uzimajući u obzir morfologiju, bez morfologije, pretraživanje po prefiksu, pretraživanje po frazi.
Podrazumevano, pretraga se vrši uzimajući u obzir morfologiju.
Za pretraživanje bez morfologije, samo stavite znak "dolar" ispred riječi u frazi:
$ studija $ razvoj
Da biste tražili prefiks, morate staviti zvjezdicu nakon upita:
studija *
Da biste tražili frazu, morate upit staviti u dvostruke navodnike:
" istraživanje i razvoj "
Traži po sinonimima
Da biste uključili sinonime riječi u rezultate pretraživanja, morate staviti hash " #
" ispred riječi ili prije izraza u zagradama.
Kada se primijeni na jednu riječ, za nju će se pronaći do tri sinonima.
Kada se primijeni na izraz u zagradi, svakoj riječi će se dodati sinonim ako se pronađe.
Nije kompatibilno s pretraživanjem bez morfologije, pretraživanjem prefiksa ili pretraživanjem fraza.
# studija
Grupisanje
Da biste grupirali fraze za pretraživanje, morate koristiti zagrade. Ovo vam omogućava da kontrolišete Booleovu logiku zahteva.
Na primjer, trebate podnijeti zahtjev: pronaći dokumente čiji je autor Ivanov ili Petrov, a naslov sadrži riječi istraživanje ili razvoj:
Približna pretraga riječi
Za približnu pretragu morate staviti tildu " ~ " na kraju riječi iz fraze. Na primjer:
brom ~
Prilikom pretraživanja naći će se riječi kao što su "brom", "rum", "industrijski" itd.
Dodatno možete odrediti maksimalan broj mogućih izmjena: 0, 1 ili 2. Na primjer:
brom ~1
Standardno su dozvoljena 2 uređivanja.
Kriterijum blizine
Da biste pretraživali po kriteriju blizine, morate staviti tildu " ~ " na kraju fraze. Na primjer, da pronađete dokumente sa riječima istraživanje i razvoj unutar 2 riječi, koristite sljedeći upit:
" istraživanje i razvoj "~2
Relevantnost izraza
Da biste promijenili relevantnost pojedinih izraza u pretrazi, koristite znak " ^
“ na kraju izraza, nakon čega slijedi nivo relevantnosti ovog izraza u odnosu na ostale.
Što je viši nivo, to je izraz relevantniji.
Na primjer, u ovom izrazu riječ “istraživanje” je četiri puta relevantnija od riječi “razvoj”:
studija ^4 razvoj
Podrazumevano, nivo je 1. Važeće vrednosti su pozitivan realan broj.
Traži unutar intervala
Da biste označili interval u kojem bi se vrijednost polja trebala nalaziti, trebali biste navesti granične vrijednosti u zagradama, odvojene operatorom TO.
Izvršit će se leksikografsko sortiranje.
Takav upit će vratiti rezultate sa autorom koji počinje od Ivanova i završava se sa Petrovom, ali Ivanov i Petrov neće biti uključeni u rezultat.
Da biste uključili vrijednost u raspon, koristite uglaste zagrade. Da biste isključili vrijednost, koristite vitičaste zagrade.
Sažetak disertacijeu medicini na temu Rezistencija tumorskih stanica na lijekove posredovana P-glikoproteinom: mehanizmi hitnog formiranja i pristupi prevladavanju
Kao rukopis
Štil Aleksandar Albertovič
OTPORNOST TUMORSKIH ĆELIJA NA LIJEKOVE POSREDOVANU P-GLIKOPROTEINOM: HITNI MEHANIZMI I PRISTUPI ZA PREVLAĐIVANJE
Moskva 2003
Rad je izveden u Državnoj ustanovi Ruski onkološki istraživački centar nazvan po N. N. Blokhin Ruska akademija medicinskih nauka, Moskva
Zvanični protivnici:
Doktor medicinskih nauka, profesor A.M. Garin,
Doktor bioloških nauka, profesor, zaslužni naučnik Ruske Federacije A.N. Salrin,
Doktor bioloških nauka, profesor N.S. Sergejeva,
Vodeća institucija: Ruska medicinska akademija postdiplomskog obrazovanja Ministarstva zdravlja Ruske Federacije.
Odbrana disertacije održaće se 25. decembra 2003. godine na sjednici Specijalizovanog akademskog vijeća D.001.017.01 u
RONC nazvan po. N.N.Blokhin Ruska akademija medicinskih nauka na adresi: 115478, Moskva, Kaširskoe autoput, 24.
Disertacija se nalazi u biblioteci Ruskog centra za istraživanje raka po imenu. N.N. Blokhin RAMS.
Naučni sekretar Specijalizovanog akademskog veća
Doktor medicinskih nauka
Yu.V. Shishkin
Opće karakteristike rada Relevantnost teme
I. Multirezistencija tumorskih ćelija: biološki mehanizmi i značaj u onkologiji.
Unatoč značajnom napretku u farmakologiji, uključujući razvoj tehnologija za stvaranje lijekova sa očekivanim svojstvima, uspjeh kemoterapije tumora ograničen je najvažnijom osobinom živih sistema – sposobnošću reagovanja na promjene u vanjskom okruženju. Jedna od manifestacija takve elastičnosti je razvoj rezistencije tumorskih ćelija na lijekove [koji se koriste u kemoterapiji. Široka rasprostranjenost i dugotrajna, uporna priroda adaptacije ćelija na spoljašnje uticaje sugerišu da prevazilaženje rezistencije na lekove može biti povezano ne samo sa potragom za efikasnijim lekovima: verovatno ne postoji lek na koji ćelije ne bi mogle da razviju rezistenciju. Tek rasvjetljavanje bioloških mehanizama rezistencije na različite vrste stresa ponovo će poslužiti razvoju strategija za prevazilaženje rezistencije na lijekove, neophodnog uslova za povećanje efikasnosti liječenja oboljelih od raka.
Multirezistencija tumora (MDR) – očuvanje vitalnosti tumorskih stanica kao odgovor na utjecaj različitih lijekova – jedan je od glavnih razloga progresije bolesti: tumor je neosjetljiv na kemoterapiju, bez obzira na kombinaciju različitih lijekova. droge. Fenomen MDR-a ima dugotrajan i stabilan karakter: mehanizmi otpornosti se nasljeđuju kroz generacije ćelija. Dakle, MDR je jedan od ključnih faktora u progresiji tumora.
Postoje dvije glavne vrste otpornosti stanica na toksine. Primarni npr. otpornost uočena prije izlaganja kemoterapiji) je posljedica ekspresije odbrambenih mehanizama tokom progresije tumora. Da, aktivacija
anti-apoptotički mehanizmi koji daju rezistenciju na imunološke efektore mogu biti povezani s rezistencijom na lijekove. Sekundarna (stečena) rezistencija se javlja u ćelijama izloženim stresu. Pre ovih uticaja, pogonski mehanizmi u takvim ćelijama su slabo izraženi ili odsutni; preživjevši nakon tretmana s jednim toksinom, stanice stiču otpornost na mnoge supstance - MDR (Riordan, Ling, 1985). Daljnja selekcija konsoliduje stečeni fenotip kroz generacije ćelija.
Najvažniji mehanizam MDR-a je smanjeno nakupljanje toksina u ćeliji, zbog izlučivanja supstanci u međućelijsku sredinu. Takav transport vrši integralni protein P-glikoproteina plazma membrane (Pgp) zbog energije hidrolize ATP-a (Juliano, Ling, 1984.) Brojni podaci ukazuju da je povećanje MDRI i Pgp mRNA često faktor rezistencije. višestrukih tipova tumora za liječenje (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).
II. Razvoj MDR-a u tumorskim ćelijama: biološki mehanizmi kao mete za prevenciju
Razumno je pretpostaviti da je povećanje količine MDRI mRNA posljedica amplifikacije ovog gena. Ovaj MDR mehanizam je identifikovan u kultivisanim ćelijskim linijama odabranim za preživljavanje u prisustvu toksina (Roninson, 1991). Međutim, pri analizi humanih tumora, amplifikacija MDRI gena nije otkrivena ni u primarnim tumorima ni u neoplazmama nakon tretmana. Vjerovatni uzrok kliničkog MDR-a je prekomjerna ekspresija MDRI i Pgp sa nepromijenjenom strukturom gena (očuvanje broja kopija i nukleotidne sekvence), tj. epigenetsko sredstvo! fenotip. U kulturama humanih tumorskih ćelija, povećanje nivoa MDRI mRNA i količine Pgp zabilježeno je nakon jednog tretmana lijekom za kemoterapiju.
različite po hemijskoj strukturi i mehanizmima delovanja (Chaillon i Erwin, 1993). Dobiveni su dokazi o akumulaciji MOI 1 mRNA u metastazama raka u plućnom tkivu već 20-50 minuta nakon početka intraoperativne plućne infuzije doksorubicina (Abolhoda et al., 1999). Ovi rezultati upućuju na mogućnost epigenetske aktivacije MDR-a u eksperimentalnim i kliničkim situacijama: povećanje MDR1 i Pgp mRNA u tumorima može se dogoditi bez amplifikacije MDR1 gena.
Ova vrsta biološke regulacije - hitna aktivacija fenotipa - uključuje indukciju transkripcije gena (gena) koji kodiraju odgovarajući fenotip, i/ili post-tranzicijsku kontrolu (stabilizacija NK, regulacija sinteze i funkcionisanja proteina). za MDR, ovaj tip regulacije znači mogućnost indukcije MYR gena\ (fuzije ćelija i relativno brz razvoj rezistencije u [ćelijama uha kao odgovor na stres. Inducibilnost MYR 1 gena sugerira razvoj signalnih puteva od ćelijske periferije do jedra Takvi putevi mogu biti signalni mehanizmi za implementaciju stresa: protein kinaza C KS), fosfolipaze i intracelularni Ca2+, neuropsinaze aktivirane mitogenom, nuklearni faktor kapa B (NkB). Prijenos signala u gulatornu regiju KYR \ gen i transkript osigurava aktivaciju kompresije gena.
Proučavanje MDR regulacije također ima fundamentalni praktični aspekt. Inhibicija ovih mehanizama putem farmakoloških i/ili terapijskih intervencija spriječila bi razvoj MDR-a tokom mioterapije.
III. Prevazilaženje formiranog MDR tumorskih ćelija.
Ako blokiranje signala za aktiviranje MYR gena može spriječiti stvaranje MDR-a u primarnim osjetljivim stanicama, tada
pristup nije primjenjiv za savladavanje već formiranog otpora. Tradicionalna metoda borbe protiv sekundarne MDR je upotreba Pgp modulatora u kombinaciji sa citostaticima (Lehne, 2000). Međutim, upotreba Pgp inhibitora ograničena je nuspojavama (poremećaji srčanog ritma, imunološka neravnoteža). Jednako važno, efikasnost kombinacija modulator+citostatik može biti smanjena zbog blokiranja barem nekih mehanizama ćelijske smrti tokom MDR selekcije.
Prevazilaženje formiranog MDR-a moguće je ako su ispunjena dva uslova: 1) koncentracija leka mora biti dovoljna da aktivira efekgor mehanizme ćelijske smrti, 2) funkcije ovih mehanizama moraju biti očuvane u ćelijama sa MDR-om. Prvi uslov je ispunjen ako lijek prevlada Pgp barijeru. Međutim, potrebno je dokazati da je postizanje kritične intracelularne koncentracije agensa dovoljno da se aktivira smrt ćelije koja je otporna na mnoge uticaje. Mehanizmi preživljavanja koji djeluju u rezistentnim ćelijama trebali bi poslužiti kao mete za eliminaciju potonjih.
Da bi se implementirao drugi uslov, izgledaju obećavajući pristupi usmjereni na lizu rezistentnih stanica kao mehanizam za izazivanje njihove smrti. Vakcinacija miševa sa stanicama singenog mijeloma transficiranih cDNK određenih citokina dovodi do razvoja imunološkog odgovora posredovanog citotoksičnim T-limfocitima (CTL) i odbacivanja inokuliranog tumora kod imuniziranih životinja (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. ., 1996). CTL-ovi liziraju ćelije koristeći granzim B i perforin. Budući da granzim B aktivira kaspazu 3, jedan od distalnih efektora apoptoze, a perforin uzrokuje primarno oštećenje plazma membrane (nekrozu), možemo se nadati da će CTL biti efikasni ako se blokiraju proksimalni mehanizmi smrti; pokretanje distalnih veza apoptoze u kombinaciji s nekrozom
dovodi do smrti stanica otpornih na antitumorske lijekove koji induciraju programiranu smrt stanica.
Formulacija problema
MDR je klinički nepovoljan fenomen, za čije prevladavanje je potrebno poznavanje mehanizama njegovog razvoja i načina na koje dolazi do odumiranja stanica, potrebno je proučiti oba aspekta problema. Prvo, potrebno je proučiti mehanizme nastanka MDR-a u MDR1/Pgp-negativnim ljudskim ćelijama; proučavanje ovih mehanizama će poslužiti za sprečavanje razvoja rezistencije kod primarno osetljivih ćelija. Drugo, analiza procesa smrti koji se odvijaju u MDR ćelijama stvoriće osnovu za prevazilaženje rezistencije u situacijama kada se formira sekundarni MDR.
Svrha istraživanja je utvrditi mehanizme urgentnog formiranja limfnih čvorova u ljudskim tumorskim ćelijama i razviti pristupe za prevazilaženje ovog pakla otpora.
1. Optimizirati modele za razvoj MDR-a u kulturama ljudskih tumorskih ćelija kao odgovor na efekte kemoterapijskih lijekova i eksperimentalnih agonista i antagonista signalnih mehanizama.
2. Odrediti glavni mehanizam hitnog razvoja MDR-a kada se ćelije tretiraju antitumorskim agensima: amplifikacija MDR gena, selekcija Pgp-pozitivnih ćelija ili de novo indukcija MDR-a.
3. Istražite puteve intracelularnog prenosa signala koji regulišu aktivaciju MDR - protein kinaze C, fosfolipaze C, intracelularnog Ca2+, protein kinaze aktiviranih mitogenom, NFkB).
4. Identifikovati ulogu aktivacije transkripcije i post-transkripcione regulacije (stabilnost mRNA) ekspresije MDR gena u akutnom razvoju MDR-a kao odgovora na efekte hemoterapije.
5. Razviti načine za sprječavanje razvoja MDR-a u tumorskim stanicama kombinacijom lijekova za kemoterapiju sa blokatorima signalnih puteva koji aktiviraju CR i inhibitorima transkripcije gena
6. Proučiti kinetiku aktivacije inicijalnih i efektorskih kaspa, promjene u transmembranskom potencijalu mitohondrija, proteolitičko cijepanje poli(ADP)riboze polimeraze, internukleosomalnu fragmentaciju DNK i integritet plazma membrane u matičnim stanicama i varijanti sa MDR-om kada se liječi sa lijekom koji nije transportovan P-glikoproteinom.
7. Koristite vakcinaciju sa ekspresijom tumorskih ćelija
citokini za stvaranje imunološkog odgovora protiv MDR stanica. »
Odredbe dostavljene na odbranu.
1. Formiranje Pgp-posredovanog MDR-a - hitnog ćelijskog odgovora na mnoge utjecaje - posredovano je epigenetskom aktivacijom gena MDR 1. Ova aktivacija je posljedica brojnih mehanizama prijenosa unutarćelijskog signala, indukcije promotora gena i stabilizacije mRNA i mogu se spriječiti inhibitorima ovih signala.
2. Prevazilaženje Pgp-posredovanog MDR-a može biti povezano sa ciljanim efektom na plazma membranu rezistentnih ćelija. Pgp ne štiti ćelije od narušavanja integriteta plazma membrane – nekroze.
Naučno znanje
1. Po prvi put je potkrijepljena ideja o formiranju MDR-a kao hitnog ćelijskog odgovora na egzogeni stimulus;
2. Po prvi put je detaljno proučavan mehanizam razvoja specifičnog fenotipa rezistencije na lijekove, P£p-posredovanog MDR-a: epigenetska aktivacija gena MYR 1 koji kodira ovaj protein.
3. Po prvi put je razvijen model hitne aktivacije MHS gena,
praćeno sticanjem stabilnog fenotipa Pgp-posredovanog MDR-a u kultivisanim ljudskim tumorskim ćelijama; 1. Identifikovani su putevi signalne transdukcije, mehanizmi aktivacije transkripcije i post-transkripcione regulacije gena MOK 1 u ćelijama izloženim antitumorskim lekovima. 5. Po prvi put, klase farmakoloških supstanci - blokatora intracelularnog prijenosa signala - su okarakterisane da spriječe stvaranje RCR-posredovanog MDR-a u tumorskim stanicama. 5. Po prvi put su proučavani mehanizmi smrti koji djeluju u ćelijama sa PgP-posredovanim MDR-om i razvijen je pristup prevladavanju rezistencije koji je uključivao primarno oštećenje integriteta plazma membrane.
Praktična vrijednost.
1. Razvoj metoda za prevenciju hitnog razvoja Pgp-posredovanog MDR-a u kultivisanim tumorskim ćelijama kada su izložene hemoterapijskim lekovima.
2. Pretklinička ispitivanja modifikovanih genetski modifikovanih vakcina za prevazilaženje MDR-a.
Apromacija rada.
Disertacija je razmatrana 30. juna 2003. godine na zajedničkoj konferenciji katedre za genetiku tumorskih ćelija, citogenetiku sa grupom za molekularnu genetiku, virusne i ćelijske onkogene, molekularnu endokrinologiju, antitumorski imunitet, biohemijsku farmakologiju, medicinska istraživanja, eksperimentalnu dijagnostiku i bioterapiju. od tumora; Odjeljenja za šmunologiju, hematologiju, kemoterapiju, kliničku farmakologiju, napredne metode liječenja Ruskog centra za istraživanje raka po imenu. N.N.Blokhsha RAMS.
Glavni materijali disertacije predstavljeni su na sljedećim konferencijama: 2. međunarodni simpozijum "Cylostatic Drug Resistance", (K Njemačka, 1991); Gordon konferencija "Napredak u hemoterapiji" (Njujork, London, SAD, 1994); "Molekularna toksikologija" (Copper Mountain, SAD, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, SAD, 1996); "Nukleinske kiseline - Integracija molekularne dijagnostike i terapije" (San Dijego, SAD, 1996); godišnje konferencije Američkog udruženja za istraživanje raka (1994-2001): 6. i 7. kongres "Napredak u onkologiji", (Hersonisos, Grčka, 2001,2002); „Struktura i funkcije ćelijskog jezgra“ (Sankt Peterburg, 2002), kao i na seminarima u Oncotech, Inc. (Irvine, SAD, 1996), Institut Salk (LaJolla, SAD, 1997), Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, SAD, 1997), The Jackson Laborati (Bar Harbor, SAD, 1997), Sloan-Kettgering Cancer Center, New Yo ] SAD, 1999), univerziteti u Kopenhagenu (2002), Insbruku (2002) i Groningsu! (2003), Moskovski državni univerzitet. M.V. Lomonosov (2002), Istraživački institut za eksperimentalnu patologiju, onkologiju i radiobiologiju im. R.E. Kavetsky (Kijev, 2002).
Publikacije.
Struktura i obim disertacije.
Disertacija je predstavljena na 181 stranici strojopisa i sastoji se od uvoda poglavlja „Pregled literature“, „Materijal i metode istraživanja“, „Rezultati istraživanja“ (dva dijela), rasprave i zaključaka. Rad sadrži 44 slike i 6 tabela. Bibliografska građa sadrži linkove na 270 izvora literature.
Materijali i metode istraživanja.
Laboratorijske životinje i ćelijske linije. Korišteni su Balb/c miševi. Za eksperimente sa MDR aktivacijom koristili smo ljudske ćelijske linije H9 (T-ćelijska leukemija), K562 (promijelocitna leukemija), SW<
(karcinom debelog crijeva), kao i sublinigo K562Í/S9, u kojem se Pgp eksprimira bez selekcije ćelija za otpornost na toksine (Mechetner et al., 1997). Za eksperimente stvaranja antitumorskog imuniteta korištene su mijeloma linije MPC11, J558 i S194. Da bi se dobile podlinije sa MDR, izvršena je postupna selekcija MPC11 ćelija za otpornost na doksorubicin. Nezavisni MPC1 subles lDoxlO-1 i MPCllDoxlO-2 proliferirali su u prisustvu 100 nM doksorubične kiseline.
MDR studija: RNK gena MDRI, količina i funkcija Pgp.
Za aktiviranje MDR-a upotrijebili smo liggozin-1P-arabinofuranozid (citosar, Ara C), doksorubicin, vinkristin, nokodazol, blsomicin, sfingomijelinazu, Ca2+ jonofor A23187, tapsigargin, 2-deoksihorostatin-1-deksil-2-deoksiglukozu i jeo 13 -acetat (TPA). Za inhibiciju aktivacije MDR-a, aktinomicin D, α-amanitin, ekteinascidin 743 (ET743), heleritrin, bis-indolilmaleimid I, kalfostin C, BARTA/AM, TMB-8, pirolidindptiokarbamat (PDTC-LTC-phokeetilnehlor) TPCMK), natrijum salicilat, salicilna kiselina, PD98095. Inhibitori su dodavani ćelijama tokom 30 min. prije dodavanja aktivatora. Nivo MDR\ mRNA u ćelijama proučavan je lančanom reakcijom polimeraze reverzne transkripcije (PCR) (Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000) korišćenjem prajmera: MDRV. ravno: 5"-SSS ATS ATT GCA ATA GCA GG-3"; revers: 5"-GTT CAA ACT TCT GCT SCT GA-3". Dužina proizvoda 167 bp. p2-mikroglobulin: direktan: 5"-ASS CCC ACT GAA AAA GAT GA-3"; revers: 5"-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3". Dužina proizvoda 120 bp.
Količina Pgp i njegova transportna funkcija određivani su protočnom citometrijom sa monopol antitelom UIC2 (Mechetner et al., 1997). Kao sekundarna antitela korišćena su anti-mišja IgG antitela konjugirana sa fluorescein izotiocijanatom (FITC). Za podučavanje Pgp-a
ovisan transport, korišćeni su fluorescentni supstrati Pgp-rodamin 123 (u eksperimentima na indukciji MDR) (Neyfakh, 1988) i kalcein acetoksimetil ester (u eksperimentima sa ćelijama mijeloma) (Holló et al., 1996; Shtü et al.), 199.
Test ćelijske smrti. Preživljavanje ćelija u prisustvu toksina proučavano je redukcijom 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2P-tetrazolija (MTT test) (Mossman, 1983; Sidorova et al., 2002). V-FITC aneksije su korištene za određivanje broja apoptotičkih ćelija; nekrotične ćelije su detektovane propidijum jodidom (PI). Transmembranski električni potencijal mitohondrija određen je fluorescencijom JC-1 sonde (Zamzair et al., 1997). Da bi se odredila fragmentacija genomske DNK, ćelije su lizirane u puferu koji je sadržavao natrijum citrat, NP-40, RNazu A i PI; suspenzija je analizirana na protočnom citometru (Shtil et al., 1999; Fragmentirana DNK je otkrivena u sub-Gl regiji. Za proučavanje stvaranja slobodnih oblika kiseonika u ćelijama korišćen je diklorofluorescein diacetat ester (DCFDA) koji prodire citoplazma i fluorescira nakon oksidacije intracelularnim metabolitima.
PKC aktivnost u citosolu i frakcijama čestica određena je radioaktivnom metodom fosforilacijom baznog proteina mijelina nakon ćelijske lize i razdvajanja frakcija centrifugiranjem (Shtil et al. 2000).
Aktivnost mitogen-aktiviranih protein kinaza ERK1/2 i JNK1 određena je fosforilacijom specifičnih supstrata (bazni protein mijelina i c-Jun) nakon ćelijske lize i imunoprecipitacije kinaza (et al., 1996).
Reporter plazmidi, ekspresijski vektori, transfekcija.
Ćelije K562 i B\Y620 trificirane su plazmidom koji nosi regiju troksimalnog promotora MOL 1 gena -1202/+118 nt. u odnosu na početno mjesto transkripcije, kloniran u pOB2b vektor. Reporterski protein je Pge/1y luciferaza. Da bi se testirala naivnost transaktivacije NaκB, ćelije su trificirane konstruktom promotor-reporter koji sadrži mjesta vezivanja za OTkB (5xNκB-lgociferaza). Da bi se suzbila aktivnost luciferaze, ćelije su istovremeno ubrizgane sakmidom koji nosi Rental luciferazu pod kontrolom promotora SIV40. U nekim eksperimentima, aktivnost luciferaze Pne]\y bila je povezana sa koncentracijom ukupnog SEL u transficiranim ćelijama. Za transfekciju smo koristili Spofeknsh ili Lipofectamine, kao i „genski pištolj“ (za ćelije mijeloma) Nabillevich et al., 1996. Vektori koji eksprimiraju p50 i p65 IκB podjedinice pod kontrolom BU40 promotora korišteni su za kotransfekciju sa parazit - 1202/+118-luciferaza Aktivnost luciferaza u ćelijama ćelije 1 proučavana je metodom hemo-pominescencije.
Imunizacija miševa. MPC11 ćelije i podlinije sa MDR-om su ozračene (40 ~r), trificirane plazmidom koji nosi cDNA faktora stimulacije slanosti granulocita-makrofaga (GM-CSF) i ubrizgane supkutano miševima (1,5 x 105 godina po životinji). Kontrolnim miševima je ubrizgan isti broj ozračenih ćelija transficiranih vektorom bez umetanja. Nakon 7 dana, svježe ćelije su ozračene i trificirane plazmidom koji nosi DNK interleukina-12 (IL-12) ili ozračene ćelije transficirane šazmidom bez umetanja (kontrola). Nakon još 7 dana (ukupno 14 dana nakon prve vakcinacije), životinje su inokulirane sa svježim ćelijama potkožno (10. sedmično) (Tisher et al., 1998).
CTL aktivnost u miješanoj kulturi sa stanicama mijeloma. Slezene su uklonjene 11 dana nakon injekcije IL-2-transficiranih ćelija mijeloma miševima. Splenociti su uzgajani 5 dana na 37°C, 5%
COg sa svježim ozračenim ćelijama linije koja se koristi za imunizaciju. Sveže ćelije mijeloma su zatim napunjene 51Cr (CTL ciljne ćelije). Aktivnost CTL procijenjena je oslobađanjem mSG u mediju nakon inkubacije sa ciljevima. Da bi se inhibirala obrada perforina, splenociti su inkubirani sa konkanamicinom A, a zatim sa metama (Kataok et al., 1996).
Rezultati istraživanja
Hitna aktivacija Pgp-posredovanog MDR-a.
MDRI mRNA se akumulira u ćelijama kao odgovor na efekte antitumorskih lijekova (Chaudhary i Roninson, 1993). Da bi se razjasnilo da li je ovaj efekat povezan sa selekcijom Pgp-pozitivnih ćelija ili sa indukcijom MDR-a, eksperimenti su sprovedeni na MES/Pgp-negativnim H9 ćelijama. Ćelije su tretirane Ara C, ne-Pgp transportiranim lijekom koji se koristi kod pacijenata s rakom dojke i hematološkim malignitetima. Ekspresija MDR\ u netretiranim ćelijama nije otkrivena nakon 25 ciklusa PCR-a, dok se u ćelijama tretiranim Ara C uočava povećanje MDRI mRNA nakon 3-6 sati. udar (slika 1, A). Povećanje MDRI mRNA može se uočiti čak i brže - nakon samo 1 sata izlaganja, ako se koncentracija citozara poveća na 75 µM. Povećanje MDRI mRNA traje u ćelijama koje prežive jednokratno izlaganje Ara C najmanje 6 nedelja.
Zatim smo ispitali da li se količina Pgp povećava paralelno sa akumulacijom MDRI mRNA. Na sl. Slika 1 B pokazuje da ćelije tretirane Ara C eksprimiraju Pgp. Važno je da izlaganje Ara C uzrokuje pomak udesno cijele populacije, što ukazuje da je gotovo svaka ćelija u kulturi sposobna akumulirati Pgp. Ćelije tretirane Ara C-om eksprimiraju funkcionalno aktivni Pgp: u tim stanicama, eliminacija
rodamin 123 je snažniji nego u intaktnim ćelijama; efekat uklanja verapamil, blokator transporta zavisnog od Pgp.
O 1 3 6 10 16 24 SATA.
fluorescencija (Ig) -
Fig.1. Povećanje MDRX i Pgp mRNA nakon jednokratnog izlaganja Ara C. A: H9 ćelije tretirane sa 10 μM Ara C. MDR1 i p2-mikroglobulin (B2M) mRNA su određene PCR-om nakon reverzne transkripcije. B: ćelije tretirane sa 10 µM Ara C tokom 24 sata (br<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых
asy izloženost agentu koji nije transportovan Pgp. To znači da
Najvjerovatniji mehanizam za ovaj efekat je indukcija fenotipa
ne selekciju „postojećih” rezistentnih ćelija.
Na sl. Slika 2 prikazuje ovisnost preživljavanja stanica o koncentraciji vinkristina, lijeka za kemoterapiju koji prenosi Pgp. Ćelije koje su preživjele
Rice. 2. Jedno izlaganje cptozaru dovodi do stvaranja stabilnog lijeka koji se prenosi Pgp.
H9 ćelije su tretirane sa 10 µM Ara C tokom 24 sata, resuspendovane u svežem mediju i inkubirane 12 dana. Nakon obnavljanja logaritamskog rasta ćelija, proučavana je njihova osetljivost na vinkristin u poređenju sa ćelijama koje nisu tretirane citosarom (kontrola). Rezultati 4 eksperimenta (MTT test)
Dakle, jedno izlaganje Pgp-negativnih ćelija hemoterapijskom leku koji nije transportovan Pgp dovodi do brzog - unutar jednog ćelijskog ciklusa - akumulacije mRNA MDRI gena, funkcionalno kompetentnog Pgp i, što je najvažnije, razvoja rezistencije na Pgp-transportirani agens Primarne osjetljive ćelije dobijaju Pgp posredovani MDR. Mehanizam ovog fenomena nije selekcija Pgp-pozitivnih ćelija, već aktivacija de novo fenotipa. Kako nastaje formiranje posredovano Pgp-om? MDR: zbog aktivacije transkripcije gena MDRX ili stabilizacije mRNA, funkcionišu li oba mehanizma?
U eksperimentima prikazanim na slici 3, H9 ćelije su tretirane sa Ara C u prisustvu! inhibitori transkripcije - aktinomicin D, a-amanitin i ekteinascidin 743 (ET743). Svi testirani inhibitori su spriječili Ara C-indukovano povećanje nivoa MDRI mRNA.
Rice. 3. Inhibitori transkripcije sprečavaju nakupljanje MDR1 RNK. H9 ćelije su tretirane sa 10 μM Ara C tokom 24 sata. bez ili u prisustvu aktinomicina D, α-amanitina ili ET743. Sumirani su rezultati 3 eksperimenta.
Za proučavanje poluživota (stabilnosti) mRNA, ćelije su tretirane Ara C tokom 10 sati. i prebačen u svježu podlogu ili medij sa aktinomicinom D i inkubiran još 36 sati. U netretiranim ćelijama, MDRI mRNA se pokazala kratkotrajnom: njeno poluživot bilo je ~30 min. Tretman Ara C produžio je poluživot mRNA na 6 sati. Dakle, akumulacija MDRI mRNA i, posljedično, razvoj Pgp posredovanog MDR-a kao odgovor na citotoksični stres, uzrokovano je ne samo aktivacijom MDR1 transkripcije, već i stabilizacijom mRNA ovog gena.
Mehanizmi intracelularnog prenosa signala u MDR aktivaciji Slika 4 pokazuje da je jednokratno tretiranje ćelija H9 sa TFA, PKC agonistom, dovelo do indukcije MDRI gena. Specifični PKC inhibitori - heleritrin, kalfostin C i bis-indolilmaleimid I - spriječili su aktivaciju MDR-a forbol esterom i kemoterapijom. Slično
Podaci su dobijeni na ćelijama K562 tretiranim Ara C, doksorubicinom ili TFA u prisustvu naznačenih PKC inhibitora.
Rice. 4. PKC inhibitori sprečavaju indukciju MDRI. H9 ćelije su tretirane sa 10 μM Ara C tokom 16 sati. bez ili u prisustvu PKC inhibitora. Sumirani su rezultati 3 eksperimenta.
Ukratko, PKC je važan za regulaciju MDRI (a samim tim i fenotipa MJI; ovaj gen se može inducirati PKC agonistom, a PKC inhibitori sprječavaju aktivaciju MDRI lijekovima protiv raka.
Fiziološki agonist PKC je diacilglicerol (DAT), koji nastaje tokom hidrolize fosfatidilinozitol-4,5-difosfata (PIg) fosfatidilinozitol-specifičnom fosfolipazom C i/ili tokom razgradnje fosfatidilholina specifičnog C-a pod djelovanjem za ovaj fosfolipid (Berridge, Irvine, 1984). Aktivacija MDRI izazvana Ara C ili doksorubicinom može biti blokirana neomicin sulfatom i U73122, inhibitorima fosfatidilinozitol-specifične fosfolipaze C (slika 5). Aktivacija MDRI forbol esterom je neosjetljiva na neomicin sulfat i U73122 jer je TFA direktni PKC agonist, a ova kinaza funkcionira distalno od fosfolipaze C. Inhibicija fosfatidilholin-specifične
Jusfolipaza C (lijek B609) nije dovela do promjena u ekspresiji MYR 1, slika 5). Ovi rezultati ukazuju na važnost PI2 hidrolize fosfolipazona C specifičnog za jusfatidilinosengol u aktivaciji MYA 1.
Rice. 5. Inhibitori fosfolipaze C u indukciji MDR\.
H9 ćelije su tretirane sa 10 μM Ara C tokom 16 sati. bez ili u prisustvu neomicin sulfata, U73122 ili D609. Sumirani su rezultati 3 eksperimenta.
Fosfolipaza C razlaže PI2 na DAT i FI. Prvi proizvod aktivira PKC, drugi povećava nivo intracelularnog Ca2+ zbog njegove mobilizacije iz ektoplazmatskog retikuluma. Uloga intracelularnog Ca2+ u indukciji MDRI dokazana je sposobnošću Ca2+-specifičnog jonofora A23187 i tapsigargina, inhibitora Ca2+-ATPaze, da aktiviraju ovaj gen; specifični Ca2+ kelator BARTA/AM spriječio je indukciju MDR\ i kemoterapijom i TFA (slika 6).
1 2 3 4 5 in 7 8 E 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Rns. b. Uloga intracelularnog Ca2+ u indukciji A) R1.
H9 ćelije su tretirane MOI induktorima 16 sati. sam ili u prisustvu kelatora kalcijuma BARTA/AM. Tragovi: 1-netretirane ćelije, 2,3-A23187; 4.5-
thapsigargin; 6,7-AgaC; 8,9-doksorubicin; 10,11-bleomicin; 12,13-2-deoksi-glukoza; 14,15-nokodazol; 16,17-sfingomijelinaza; 18,19-TFA. Parne staze: induktor neparan (osim 1): induktor -5 µM VARTA/AM.
Da bi se razjasnilo učešće intra- i ekstracelularnog Ca2+ u aktivaciji MDR-a, sprovedene su dve serije eksperimenata. Prvo je proučavana aktivacija gena u uslovima ćelijske inkubacije u medijumu bez Ca2+. Uklanjanje ekstracelularnog Ca2+ nije narušilo aktivaciju MDRI hemoterapijom i TFA. Drugo, agens TMB-8, koji sprečava ulazak Ca2+ u ćelije i ne menja koncentraciju intracelularnog Ca2+, nije uticao na indukciju MDRI. Stoga je za aktivaciju MDRX-a potreban intracelularni, ali ne i ekstracelularni kalcij. Gore navedeni eksperimenti dokazuju fundamentalnu ulogu fosfolipaze C->DAG-*PKS i PI3->Ca2+ signalnih puteva u aktivaciji MDRX gena raznim supstancama, uključujući i lijekove za kemoterapiju.
Međutim, PKC nije univerzalni mehanizam za aktiviranje MDR-a. Aktivnost PKC varira u ćelijama tretiranim pojedinačnim MDRX induktorima. T< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).
" Tabela 1. Učinci induktora MDRI gena na aktivnost PKC.
Tretman PKC aktivnost, pmol/mg proteina/min.
frakcija citosolnih čestica
Kontrola 119±13 59+9
TFA, YuONM 47+10* 153+14*
Ara C, 25 µM 143+16 65+10
Ceramid, 1 µM 138+15 27+8*
Ceramide, YumkM 83+15* 15+7*
*R<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.
PKC inhibitori helerigrin i bis-indol-maleimid I spriječili su aktivaciju MDR\Ara C, doceorubicina i TFA, ali ne i ceramida (slika 7). Stoga, aktivacija PKC nije preduvjet za indukciju MDRX gena. Neki agensi (npr. ceramvd) aktiviraju signalne mehanizme nezavisne od ACL-a ili djeluju distalno od ACL-a.
Rice. 7. Ceramnd aktivira MDR\ bez obzira na ACL intervenciju.
H9 ćelije su tretirane sa 25 μM C2-ceramida tokom 24 sata. sami ili u prisustvu PKC inhibitora. Kontrola efikasnosti inhibitora je njihovo blokiranje MDR aktivacije kada su izloženi 10 µM citozaru.
Takvi mehangami mogu biti protein kinaze aktivirane mitogenom. Doksorubicin i Ara C u koncentracijama koje aktiviraju MDR\ povećavaju aktivnost JNK1, ali ne i ERK1/2, dok je TFA aktivirala ERK1/2, ali se aktivnost JNK1 nije promijenila (slika 8). U skladu s ovim podacima, ERKI/2 inhibitor PD98059 ukinuo je MDRI aktivaciju TFA, ali ne i kemoterapijom. Dakle, protein kinaze aktivirane mitogenom služe kao nivo divergencije MDR1-aktivirajućih signala generiranih različitim supstancama.
Aktivacija MAP kinaza doksorubicinom i TPA
Rice. 8. Diferencijalna aktivacija MAP kinaza MDR1 induktorima. H9 ćelije su tretirane doksorubicinom i TFA. Aktivnosti ERK1/2 i JNK1 određene su nakon imunoprecipitacije i fosforilacije supstrata. Efekti induktora su izraženi kao nivo aktivacije svake kinaze u poređenju sa netretiranim ćelijama, u kojima je aktivnost postavljena na 1. Podaci iz 3 eksperimenta su sumirani.
Transkripcijski faktor NFkB je mehanizam za brzi odgovor ćelija na vanjske stimuluse (Karin, 1995). U ćeliji koja miruje, ovaj protein se nalazi u citoplazmi u kompleksu sa inhibitornom podjedinicom; kao odgovor na izlaganje, NFkB se odvaja od kompleksa, transportuje se u jezgro i aktivira regulatorne regione gena koji imaju mesta vezivanja za NFkB. NFkB inhibitori PDTC, TPCMC i salicilati spriječili su MDRX aktivaciju citosarom, doksorubicinom i TFA (slika 9). Posebno je važno da se salicilap, lijek koji se široko koristi u klinici, pokazao kao efikasan blokator hitne aktivacije MDRI. Štaviše, natrijum salicilat je poništio dugotrajnu (do 7 dana) aktivaciju MDRX citosarom (slika 10), potvrđujući; važnost NFkB kao mehanizma MDR aktivacije.
Rice. 9. Prevencija indukcije MDR1 NFkB inhibitorima. H9 ćelije su tretirane sa 10 μM Ara C, 5 μM doksorubicinom ili 10 nM TFA tokom 16 sati. sami ili u prisustvu inhibitora aktivacije NFkB. Sumirani su rezultati 4 eksperimenta.
4, pranje
L ha S - + +----
salicilat - - + \ s 5 7
dana bez AGAS-a
Rice. 10. Dugoročni efekat natrijum salcinlata kao inhibitora indukcije MDRI.
H9 ćelije su tretirane sa 10 μM Ara C tokom 48 sati. sam ili u prisustvu natrijum salicilata, resuspendiran u svježem mediju i inkubiran još 1-7 dana.
Važnost utvrđivanja uloge NκB je i u tome što ovaj mehanizam „ujedinjuje“ citoplazmatske i nuklearne događaje u aktivaciji gena MYR 1. Ovu vezu potvrđuju eksperimenti aktivacije promotora gena; AYUSH egzogeni No.kV. Kotransfekcija OTkV podjedinica p50 i p65 rezultirala je aktivacijom regije -1202/+118 nt. promoter AYUSH (slika 11). Međutim, u naznačenom regionu, kanonska sekvenca 5"-COOIM^YUSS-3" (R-bilo koja purinska baza, aL-bilo koja pirimidinska baza) za interakciju sa NaκB ili homolognim sekvencama nije pronađena. Moguće su sledeće pretpostavke: 1) NokV interaguje sa još neidentifikovanom sekvencom u regionu -1202/+118 i.i.; 2) NkB aktivira intermedijarni gen (geni), čiji se proizvod vezuje za regiju -1202/+118 nt. i indukuje MDR1 promotor.
Rice. 11. NFkB - aktivator MDR promotera.
Ćelije K562 su transficirane navedenim konstruktima i plazmidom koji nosi Renilla luciferazu rei ispod SV40 promotora. Aktivnost luciferaze krijesnice koja odražava indukciju -1202/+118 nt regiona MDRX promotora (označeno kao MDF normalizovan na aktivnost Renilla luciferaze.
Regulacija promotora gena MDR1.
Putevi za prenošenje signala koji aktiviraju L1 moraju imati zajedničku "tačku konvergencije" - regulatorni region gena i mRNA. Za proučavanje promotora MDRI koristili smo lijekove koji moduliraju fizičko-hemijsko stanje hromatina - inhibitore histon deacetilaze trihostatin A i natrijum butirat, predstavnike klasa hemoterapijskih lekova koji direktno regulišu transkripciju gena. Važno je uporediti mehanizam aktivacije MDR-a ovim agensima s Ara C i doksorubicinom, lijekovima kojima kromatin nije direktna meta. Trihostatin A i natrijum butirat aktiviraju endogeni MDRX gen u ćelijama H9, K562 i SW620. Povećanje mRNA (slika 12, lijevi panel) je praćeno aktivacijom luciferaze transkribovane sa -1202M18 nt mjesta. MDRI promotor (slika 12, desni panel).
Rice. 12. Inhibitori histon deacetilaze indukuju endogeni MDRX gen i promotor (prolazna transfekcija).
Slash, H9, K562 i SW620 ćelije su tretirane navedenim lekovima tokom 24 sata. Nivo MDRX mRNA je proučavan u GTCR. Desno: ćelije K562 su transfektovane konstruktom -1202/+P8 n.o.-luciferaze. Za 24 sata. ćelije su stimulisane naznačenim lekovima tokom 16 sati. Prikazani su rezultati 3 eksperimenta.
Utvrđeno je da trihostatin A i butirat aktiviraju MDRI zbog interakcije transkripcionog faktora NF-Y sa invertiranom HAAT kutijom (Jin i Scolto, 1998), što potvrđuje lanac događaja „induktor-hromatin modifikacija -> aktivacija MDRI promoter.” Međutim, u uvjetima transfekcije pojasom, kromatin na plazmidu ostaje "nesavršen".
Da bi se proučila uloga hromatina u indukciji MDRI, ćelije SW620 su transfektovane sa -1202/+118 nt Firefly luciferaza konstruktom i plazmidom koji nosi neo gen; zatim su ćelije odabrane za preživljavanje u prisustvu neomicina. U selektantima, kao i tokom privremene transfekcije, trihostatin A i natrijum butirat izazvali su akumulaciju endogene MDRI mRNA i inducirali transkripciju iz regije -1202/+118 i.i. promoter ovog gena. Aktivaciju MDRI inhibitorima histon deacetilaze ukinuo je ET743, blokator transkripcije. Ovo pokazuje direktnu vezu između povećanja količine MDRI mRNA i aktivacije promotora ovog gena kroz acetilaciju hromatina.
Ovi podaci su dobijeni kada su ćelije bile izložene agensima koji direktno menjaju fizičko-hemijsko stanje hromatina. Je li mehanizam uvijek identificiran, budući da nisu svi lijekovi za kemoterapiju (i drugi egzogeni stimulansi) direktni regulatori hromatina? Primetili smo da se poluživot: MDRI mRNA povećava u ćelijama tretiranim Ara C i TFA. Slika 1 pokazuje da su TFA i trihostatin A moćni induktori MDRI promotorske aktivnosti (transkripcije), dok ni Ara C, ni doksorubicin, ni ceramid nisu aktivirali promotor ili su izazvali samo slab efekat.
Rice. 13. Efekti MDR aktivatora na indukciju promotora MDRI. Ćelije K562 su transficirane konstruktom luciferaze -1202/+118 nt Firefly, podijeljene na jednake dijelove i stimulirane 16 sati. naznačene lekove.
Aktivnost luciferaze u netretiranim ćelijama, normalizovana na ukupan sadržaj proteina u ćelijskim lizatima, postavljena je na 1. Rezultati su reprodukovani u 3 eksperimenta.
Ovi rezultati sugeriraju da se povećanje nivoa A/III1 mRNA javlja i kao rezultat aktivacije transkripcije (TFA, trihostatin A) i bez direktne indukcije promotora (citosar, doksorubicin, ceramid). U potonjem slučaju treba prepoznati ili mehanizme stabilizacije mRNA, ili aktivaciju intermedijarnog gena, čiji proizvod indukuje MIEX promotor ili stabilizuje transkript (vidi eksperimente sa egzogenim NaκB).
Tabela 2. Inhibitori signalnih mehanizama koji sprečavaju hitnu aktivaciju MF1 gena tsntozprom.
Lijek Intracelularni cilj Inhibicijska koncentracija
heleritrin PKS 10 µM
kalfostin S PKS 1 µM
bis-indolil-
maleimid I PKS 5 µM
VARTA/AM Ca2+ 5 µM
PDTK br.kV 5 µM
GFKhMK br.kV 25 µM
natrijum salicilat br.kV 20 mM
yutirin №kV 10 mM
Ziester viši plazmatski
membrana masnih kiselina? Yumkg/ml
1KTSHGOMISHSH B elongacija transkripta? 500-1000 ng/ml
x-amanitin RNA polimeraza II 9 μg/ml
zhgeinascischsh 743 nije instaliran 100 nM
Tabela 2 prikazuje farmakološke lijekove koji predstavljaju grupe inhibitora transdukcije signala koji sprječavaju MDR aktivaciju cigosarom ili doksorubicinom u ćelijama leukemije H9 i K562.
Prevazilaženje Pgp-posredovanog MDR-a: cilj plazma membrane
citotoksično djelovanje.
Dakle, Pgp posredovani MDR može se formirati prilično brzo tokom jedne diobe ćelije i opstati u generacijama preživjelih ćelija. Mnogi stimulansi su induktori MDR-a, uključujući kliničku upotrebu antitumorskih lijekova različitih kemijskih grupa. Pgp je obeležje mehanizama koji sprečavaju aktivaciju programirane smrti (apopto) (Johnstone et al., 1999.) Stoga tumor koji je prvenstveno otporan na apoptogene stimuluse i brzo dobija MDR kao odgovor na lečenje predstavlja poseban izazov za terapiju Koje su strategije za prevazilaženje multifaktorskog otpora?
Proučavana je smrt takvih ćelija pod uticajem imunoloških efektora. Preduslov za ovaj pristup bili su podaci o odbacivanju vakcinisanog mijeloma od strane splenocita koji se akumuliraju tokom vakcinacije miševa; isti tumor, modifikovan da ekspresuje citokine (Turner et al., 1996). Pošto su se ispostavilo da su svojstva podlinija MPC1 IDoxlO-l i MPC1 1Dox10-2 slična, u nastavku se analiziraju ćelije MPCllDoxlO-1.
MDR fenotip u selektantima je karakteriziran prekomjernom ekspresijom mdrVo gena, smanjenim transportom kalceina i otpornošću na doksorubicin i vinkristin, Pgp supstrate. Da bi se stvorio imunitet na inokulaciju mijelolom, MPC11 i MPCI IDoxlO-l ćelije su transficirane cDNK GM-KS IL-12 citokina. Broj inokuliranih ćelija bio je pet puta veći od minimalne 100% doze za ubijanje tumora.
Tabela 3. Stope odbacivanja tumora u kontroli i
imunizirane životinje.
Mice Grafting
MPC11 MPCllDoxlO-1
Netaknut 0/15* 0/10
Imunizacija MPC11 ćelijama:
ozračene ćelije 1/15 0/10
■M-CSF/IL-12-transficirane ćelije 15/15** 9/10**
Imunizacija MPC1 Xox10-1 ćelijama:
ozračene ćelije 0/15 0/10
"M-CSF/IL-12-transficirane ćelije 9/10** 10/10**
Stopa odbacivanja tumora: u brojiocu - broj miševa koji nisu razvili tumor; u 1 zamjeni - ukupan broj vakcinisanih miševa, **P<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.
Tabela 3 pokazuje da MPC11 i MPC1 IDoxIO ćelije proizvode tumor: kod 100% neimuniziranih životinja tumori su se pojavili 8-10 dana nakon inokulacije odgovarajućih ćelija. Međutim, kod miševa imuniziranih ćelijama koje eksprimiraju citokine, tumori se nisu pojavili (vakcinacija MPC11) ili su bili rijetki (vakcinacija rezistentnom podlinijom). Antitumorski imunitet je bio dugotrajan: tumori se nisu pojavili unutar 5 sedmica nakon inokulacije svježih ćelija. Incidencija odbacivanja grafta bila je slična između grupa imuniziranih MPC 11 ćelijama i rezistentne podlinije. Ovi rezultati ukazuju na mogućnost smrti malignih rezistentnih ćelija kada su izložene faktoru(ima) otkrivenom u in vivo eksperimentima.
Takav faktor su CTL generisani u slezeni kao odgovor na imunizaciju ćelijama koje eksprimiraju citolitičke. Na sl. Slika 14 pokazuje da su splenociti miševa imunizovanih sa MPC 11 ćelijama koje eksprimiraju GM-CSF- i IL-12 lizirale MPC 11 i MPCllDoxlO-1 ciljne ćelije sa skoro identičnom efikasnošću (Slika 14).
-ér-MPCU/MPCJlDoilO
MRS11/MRSI
efektor.target
Rice. 14. CTL liza roditeljskih i Pgp-pozitivnih ćelija.
Brojač: ćelije za imunizaciju, nazivnik: ćelije koje se presađuju.
Shodno tome, antitumorski imunitet kod životinja vakcinisanih ćelijskom vakcinom koja eksprimira citokine je povezana sa osetljivošću MDR ćelija na logično delovanje CTL.
Ubijajuća aktivnost CTL-a je posljedica lučenja CD95/Fas liganda i/ili tandema granzima B-perforina od strane ovih stanica (Vetke, 1994). Kako bi se razriješilo pitanje koji od ovih mehanizama funkcioniše u ispitivanom sistemu, proučavano je preživljavanje ćelija u prisustvu Fas liganda, a pokazalo se da su ćelije MPC11 i MPC1 ShoxY-1 otporne čak i na relativno visoke koncentracije Fas liganda. Stoga, granzim B/perforin treba smatrati mehanizmom kandidata za citotoksično djelovanje imunih UTJ. Zaista, preinkubacija imuno-CTL-a sa konkanamicinom A, inhibitorom procesiranja perforina, smanjila je lizu ciljnih ćelija MPCllDoxl 0-1 (slika 15).
Da bi se pronašli načini za prevazilaženje MDR-a, važno je da podlinije sa MJB zadrže osjetljivost na citotoksične efekte zbog narušavanja integriteta plazma membrane perforinom. Penetracija granzima B u ćeliju kroz pore u plazma membrani koju formira perforin dovešće do aktivacije efegrinskih kaspaza. Jazavčar
tandem ubojica - istovremeno djelovanje agensa koji stvara pore u vanjskoj membrani i proteaze - omogućava da se prouzrokuje smrt stanica koje su otporne na brojne vanjske utjecaje. Stoga je plazma membrana važna meta za terapiju koja ima za cilj eliminaciju rezistentnih ćelija.
T; sa k) o o o
n (o n ii) o o
efektor: meta
Rice. 15. Granznm B/psrforin - mehanizam smrti posredovane CTL. Konkanamicin A (otvorene trake) smanjuje CTL posredovanu lizu MPC1 XoxI-1 ćelija. Tamne kolone ukazuju na lizu CTL meta bez predinkubacije sa konkanamicinom A. Prikazan je jedan od 3 reprezentativna eksperimenta.
Zerschied i slobodni kisikovi radikali u prevladavanju MDR-a. Ako je plazma membrana željena meta, kako onda uzrokovati njeno oštećenje? Posebno je poželjno da takav učinak ima akter koji je uobičajen za mnoge lijekove protiv raka. Jedan od ovih "posrednika" je ceramvd. Da bi ceramid bio efikasan za treodolaciju MDR-a, mora zadovoljiti najmanje dva uslova: ;) da ga Pgp ne prenosi iz ćelije; 2) pokreću puteve smrti koji funkcionišu u rezistentnim ćelijama. Da li je dovoljno "zaobići" membranski transporter, vodeći mehanizam MDR-a, da izazove smrt ćelija koje su otporne na brojne uticaje?
Ceramid se ne prenosi P-gpikoproteinom.
Budući da se ceramid akumulira kao odgovor na razne lijekove za kemoterapiju, ispitali smo da li ovaj metabolit ispunjava ove uslove. Pokazalo se da je kinetika akumulacije ceramida u roditeljskim K562 ćelijama i njihovoj Pgp-pozitivnoj podliniji K5621/89 skoro ista (Sl. 16). Istovremeno, ćelije K562^B9 akumulirale su značajno manje rodamina 123 od ćelija K562 (kontrola transporta posredovanog Pgp-om). Shodno tome, ceramid nije transportni supstrat za Pgp.
8000 6000 4000 2000 0
0 0,05 0,2 1 5 C5-BOO!RU-ceramid
Rice. 16. Pgp ne prenosi kratkolančani ceramid. Ćelije K562 i K5621/59 inkubirane su 30 minuta. sa C5-ceramidom konjugiranim sa fluorohromom VSY1RU (gornji panel) ili rodaminom (III)123 (donji panel). Luminiscencija ćelije proučavana je protočnom citometrijom. Podaci iz 3 eksperimenta.
Nije bilo razlika u citotoksičnosti sintetičkih (C2) i prirodnih (Ci) ceramida za ćelije K562 i K5621/89, kao ni za parove
roditeljske ćelije i selektanti: MCP-7 i MCP-7Ac1g, KV-3-1 i KV-8-5-11. Dakle, ceramid jednako efikasno uzrokuje smrt Pgp-negativnih i Pgp-pozitivnih ćelija.
ne sprečava narušavanje integriteta plazma membrane.
Da bi se identifikovali mehanizmi smrti ćelija K5621/59 pod uticajem ceramida, proučavani su sledeći parametri: aktivacija kaspaza 9 i 3, cepanje poli-ADP-riboza polimeraze (PAKR), internukleosomalna degradacija DNK, intramembranska translokacija fosfatidilserina (vezivanjem aneksina V), transmembranski električni mitohondrijski potencijal i integritet plazma membrane (inkorporacijom PI u ćelije). Na sl. 17 to pokazuje do 24 sata. izloženosti ceramidu, procenat umirućih ćelija dostigao je 37+4%. Posebno je važna bila pojava „dvostruko pozitivnih“ (aneksin-PI4) ćelija, što znači da u ćelijama K562LB9 ceramid prilično rano izaziva poremećaj permeabilnosti plazma membrane (nekrozu ili kasnu apoptozu). Istovremeno, nije otkrivena aktivacija kaspaze 3, karakteristična za klasičnu apoptozu; Pokazalo se da je proteoliza PAS kasni događaj (48 sati izloženosti).
Učinak ceramida na ćelije K5621/B9 praktički nije bio praćen promjenom transmembranskog potencijala mitohondrija: ovaj indikator u umirućim stanicama nije se razlikovao od odgovarajuće vrijednosti za netretirane ćelije. Internukleosomalna fragmentacija DNK također nije bila vodeći znak smrti: samo oko 11% događaja dogodilo se u sub-01 regiji (hipodiploidne ćelije), dok je postotak umirućih ćelija (zbir aneksina+/PI, aneksina7PI+ i dvostruko pozitivnih) na Isto trajanje ekspozicije bilo je 64 + 4%.Tako je najvažniji znak smrti K562LB9 ćelija pod uticajem ceramida rano narušavanje integriteta plazma membrane – nekroza.
vrijeme (sati) sa ceramidom
■ K562,Annexin+ □ K562,Annexin+PI+ BK562i/S9,nH+
IK562.PI+ V K562i/S9,AHHeKCHH+ ■ K562|789,Annexin+PI+
Rice. 17. Indikatori smrti ćelija K562 i K562L/S9 pod uticajem ceramida. Ćelije su tretirane sa 25 μM C2-ceramida u naznačenom vremenskom periodu.Procenat aneksije V-pozitivnih, propidijum jodid (PI+)-pozitivnih i „dvostruko pozitivnih” (aneksin + PI+) ćelija određen je protočnom citometrijom.
U ćelijama K562 p53 ne funkcioniše, a ekspresuje se himerna protein kinaza Br/Ab1, tj. Ove ćelije sadrže molekularne determinante otpornosti na apoptozu. Stoga se podlinija K562i/S9 može smatrati modelom pleiotropne rezistencije, gdje je Pgp jedan od mehanizama. Utoliko su važniji podaci o sposobnosti ceramida da izazove smrt! takvih ćelija mehanizmom nekroze.
Metaboliti koji mogu uzrokovati nekrozu mogu biti slobodni radikali kisika. Da bi se utvrdila njihova uloga u smrti ćelija K562/iS9 izazvanoj ceramidom, proučavana je citotoksičnost ceramida u prisustvu N acetilcisteina (NAC), kelatora kisikovih radikala, te stopa stvaranja kisikovih radikala u stanicama tretiranim s proučavan je ceramid. b Slika 18 pokazuje da je NAC uklonio citotoksičnost ceramida. Dakle, slobodni kisik igra odlučujuću ulogu u smrti rezistentnih stanica kada je izložen ceramidu. Slika 19 prikazuje zavisnost
Luorescencija ćelija napunjenih OCPOA u zavisnosti od vremena delovanja ceramida i
„kontrolno sredstvo - vodikov peroksid, donor O2.“ H2O2 izaziva brzo
isto nakon 20 minuta. - povećanje fluorescencije ćelije. Prouzrokovano ceramidom
suprotan efekat: nakon 15 minuta. primećeno je da je udar bio oštar - za 1,5
Red - smanjenje sjaja. Samo do 24 sata. intenzitet obrade
ćelijska fluorescencija se vratila na nivo ovog indikatora u
tretiranih ćelija i povećan za 48-72 sata. uticaj kada iznos
Već je bilo dosta ćelija koje rastu (slika 17). Dakle, u obrađenim
ramidne ćelije u početku prolaze kroz redukciju i oksidaciju
javlja se kasnije, vjerovatno kao rezultat iscrpljivanja resursa za obnovu utricelularnih supstrata.
Slika 18. NAC blokira smrt ćelije K562i/S9. Ćelije su tretirane Cr-ceramidom bez ili sa 5 mM NAC. Sam NAC nije imao uticaja na vitalnost ćelija.
Rice. 19. Oksidacija u ćelijama K562|/89 pod uticajem ceramida. Ćelije su tretirane sa 25 μM C2-ceramida u naznačenim vremenskim intervalima. Intracelularna oksidacija je proučavana promjenama u fluorescenciji ćelija napunjenih E>SGOA. H2Og je korišten kao kontrola "eksplozije kisika". Sumirani su rezultati 3 eksperimenta.
Diskusija o rezultatima
Analiza mehanizama aktivacije gena MOI1 nam omogućava da konstatujemo sledeće: 1) AUM gen i MDR fenotip mogu biti indukovani kratkotrajnim izlaganjem ćelija mnogim supstancama. Prekomjerna ekspresija MBJ\ i akumulacija Pgp-a su otkriveni u stanicama koje prežive nakon prekida! ksenobiotski efekti. Dakle, epigenetska aktivacija gena MYR\ osigurava stabilan MDR fenotip.
2) Hitno formiranje MDR-a je regulisano opštim signalnim mehanizmima ćelija. Zaista, aktivacija fosfolipaza, mobilizacija intracelularnog Ca2+, indukcija NaκB i kaskade protein kinaza aktiviranih stresom su mehanizmi koji osiguravaju ćelijski odgovor na stres. Osim toga, transkripcijski faktori i funkcionalno aktivna mjesta u
IpoMOTope gena MDR1, važan za aktivaciju MDR-a, nije jedinstven za ovaj gen: ■JF-Y, CCAAT box i signali koji moduliraju hromatin su važni za regulaciju transkripcije većine eukariotskih gena. Ovo, očigledno, objašnjava visoku inducibilnost MDRX gena: ovaj gen se aktivira podražajima stopala u ćelijama različite histogeneze. Zauzvrat, regulacija MDRX-a općim mehanizmima implementacije stresa naglašava iviološki značaj aktivacije MDR-a zajedno sa drugim odgovorima ćelije na egzogene utjecaje.
3) Mnogostrukost i zamenljivost aktivacionih mehanizama MDR shs.20) određuju se višestepenom prirodom regulacije ovog fenotipa. I svaki od ovih nivoa daje ćeliji priliku da „izabere“ hoće li ili ne aktivirati MDR. Prvo, izbor je diktiran prirodom stimulusa (različiti enti djeluju kroz različite mehanizme). Drugo, specifičan mehanizam zavisi od prisustva određenih signalnih molekula i njihove interakcije u mrežama ovog tipa.Treće, izbor se dešava na nivou stvarnih mehanizama ankripcije (stanje hromatina u DRI promotorskoj regiji).Iz ovih razmatranja , razlozi visoke inducibilnosti na MDRX (široka zamjenjivost i preklapanje signalnih i transkripcijskih mehanizama osigurava indukciju mnogim stimulansima iu različitim tipovima stanica), a slučajevi nedostatka indukcije nisu inducirani svakim stimulusom i ne u svakom eksperimentalnom sistem).
Shema hitne aktivacije MDRX gena (na primjeru citozara i TFA) prikazana je na slici 20.
Koncept indukcije MDRX-a kao odgođenog događaja, koji uključuje prvo aktivaciju proteina neophodnih za indukciju toro MDRX-a, dodatno komplikuje sliku epigenetske aktivacije MDR-a.<ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,
Regulacija MY1 kemoterapijom i TPA
neomicin, 1173122
aktivacija transkripcije, stabilizacija mRNA
Rice. 20. Mehanizmi hitne aktivacije MY 1 gena.
intenziviranje ili održavanje brzine transkripcije. Mogućnost da ćelija izabere različite načine induciranja MDR-a – direktno (bez aktivacije intermedijarnih gena) i/ili posredovano indukcijom drugih gena – još više otežava sprečavanje razvoja MDR-a.
Aktivacija transkripcije gena L)/? 1 nije jedini mehanizam za razvoj MDR-a. Druga važna komponenta epigenetske regulacije može biti stabilizacija MOK 1 nRNA. Moguće je da, u odnosu na balans između indukcije transkripcije i stabilizacije MOK 1 mRNA, mehanizmi aktivacije MDR-a pod uticajem različitih induktora iu različitim ćelijama vrste su takođe različite. Ova pretpostavka je u skladu sa konceptom višestepene regulacije ekspresije MyACh gena (slika 19).
4) Ciljana prevencija MDR-a moguća je uspostavljanjem mehanizama prenosa M)L1-aktivirajućih signala. Potrebu da se spriječi razvoj MDR-a u klinici potvrđuje povezanost razvoja MDR-a i citotoksičnosti lijekova. Zaista, nivo mRNA/εγ1 u ćelijama tretiranim toksinima raste sa povećanjem koncentracije potonjih. Shodno tome, upotreba režima hemoterapije u visokim dozama (opravdanih radi povećanja efikasnosti lečenja) može dovesti do razvoja MDR-a u preživelim ćelijama. Koncentracije lijekova potrebne za potpunu resorpciju tumora mogu biti veće od prihvatljivih za pacijenta, što određuje granicu za eskalaciju doze u kemoterapiji. Prethodno identificirani intracelularni signalni antagonisti mogu poslužiti kao prototipovi za buduće lijekove MDR blokatora koji se koriste u kombinaciji s tradicionalnim lijekovima protiv raka. Dakle, sprečavanje hitnog razvoja MDR-a proširuje mogućnosti prevazilaženja ove klinički nepovoljne pojave.
Koji su pristupi prevazilaženju utvrđenog MDR-a? Jedna od „ranjivih“ meta u rezistentnim ćelijama može biti plazma membrana. Povreda njegovog integriteta uzrokuje smrt rezistentnih ćelija: Pgp ne sprečava smrt od uticaja koji izazivaju nekrozu. Identificirana je terapijski važna ćelijska struktura koju treba ciljati. Očigledno, jednostavno membranolitički agensi nisu prikladni zbog nekontrolirane toksičnosti za tkiva, uključujući i ona koja nisu tumorska. Potrebno je pronaći agense koji prevladavaju Pgp barijeru i uzrokuju oštećenje plazma membrane, tj. stvaraju unutarćelijsku koncentraciju lijeka dovoljnu da aktivira nekrozu. Supstanca koja zadovoljava ovaj uvjet može biti ceramid, sfingolipid koji se akumulira u ćeliji kao odgovor na mnoge stimuluse, uključujući i antitumorske lijekove. Ceramid se ne prenosi Pgp-om, što osigurava da je koncentracija ovog metabolita u rezistentnim stanicama dovoljna da izazove smrt.
Toksičnost ceramida za rezistentne ćelije znači da signalni putevi distalno od akumulacije ceramida u ovim ćelijama nisu blokirani Pgp-om ili drugim mehanizmima povezanim sa selekcijom MDR-a. Stoga, prevladavanje rezistencije mora uključivati pronalaženje načina za akumulaciju ceramida (i eventualno drugih toksičnih metabolita) u rezistentnim stanicama. Citotoksičnost ceramida zahtijeva kaveole ili njihove analoge - submembranske formacije bogate fosfolipidima i proteinima i akumuliraju se tokom selekcije za MDR (La\ et al., 1998). Važno je da selekcija za MDR može biti praćena povećanjem molekularnih ciljeva ćelija za terapiju protiv raka.
Čini se da su slobodni oblici kiseonika bitan mehanizam smrti izazvane ceramidima. Ovo postavlja pitanje važnosti mitohondrija u preživljavanju MDR ćelija. Mitohondrijski put
prenosi dodatne signale za aktiviranje efektorskih kaspaza. ■Litohondrijska „petlja“ je snažan faktor u potenciranju takvih signala; „pad električnog potencijala mitohondrija i posebno oslobađanje citokroma C u plazmu osiguravaju nepovratnost procesa smrti. Budući da nije moguće predvidjeti da li će selekcija na otpornost biti povezana s inaktivacijom jednog ili drugog puta smrti, važno je da samo “pouzdana” kaskada ostane funkcionalna u MDR stanicama.
Naši rezultati ukazuju na osjetljivost na kisikove adikale u ćelijskim linijama s Pgp posredovanim MDR-om. Može se pretpostaviti da, iako su primarna rezistencija i selekcija za rezistenciju na lijekove određeni brojnim mehanizmima, još uvijek je moguće prevladati multifaktorsku rezistenciju povećanjem unutarćelijske oksidacije. Slobodni kisik odmah ulazi u brojne oksidacijske reakcije, što dovodi do oštećenja struktura važnih za život stanice - DNK i membrana. U gornjim eksperimentima pokazalo se da je nekroza vodeća metoda izbjeljivanja kada je izložena radikalima kisika. To ne znači da je nekroza jedini način smrti izazvan slobodnim oblicima kiseonika. U konkretnoj situaciji treba utvrditi prevagu ove ili druge vrste smrti; Standardna razlika između apoptoze i nekroze ne karakteriše raznovrsnost mehanizama smrti. Ova procjena je korisna za određivanje da li je oštećenje membrane primarno ili je ovaj proces odgođen. Međutim, čini se da je važno procijeniti propusnost plazma membrane u svakoj situaciji: narušavanje integriteta membrane uzrokuje ireverzibilnost.Stoga je nekrotična komponenta smrti važna za stvaranje MDR stanica, jer Pgp može zaštititi stanice od agenasa. koje induciraju apoptozu, ali ne od supstanci koje indukuju apoptozu, uzrokujući nekrozu.
Posljednja okolnost nije iznenađujuća. Za funkcionisanje ovog proteina plazma membrane potrebno mu je određeno fizičko-hemijsko stanje zbog svog integriteta. Kod nekroze će doći do teškog oštećenja ćelije, uglavnom zbog poremećaja transporta vode i jona. Ova oštećenja će utjecati na gotovo sve ćelijske strukture, za razliku od apoptotičkih kaskada, koje se izražavaju u sekvencijalnom cijepanju supstrata - energetski ovisan proces koji uključuje stvaranje višekomponentnih proteinsko-lipidnih kompleksa u ćeliji i strogu specifičnost interakcije. kaspaza sa supstratima. Blokiranje jedne ili više karika takve kaskade (na primjer, kao rezultat poremećenog transporta lipida u stanicama s MNA MS, ne formiraju se "ispravno" lokalizirani signalni kompleksi) prekinut će prijenos signala na osnovne mehanizme, što dovodi do stanice izbjegavanje smrti i, u konačnici, formiranje rezistencije. Također iz tog razloga, u borbi protiv MDR-a, poželjno je da mehanizmi smrti budu višestruki i da uključuju aktivaciju ne samo kaspaza, već i: drugih familija proteaza (lizosomske, proteasomalne, nuklearne), kao i potenciranje signala (mitohondrijski put) i poremećaj permeabilnosti plazma membrane. Što se više mehanizama smrti može aktivirati u rezistentnim ćelijama, to je pouzdaniji konačni rezultat prevladavanje MDR-a.
1. MYR\ gen i MDR fenotip posredovan P-glikoproteinom mogu se inducirati jednim kratkotrajnim izlaganjem MN stanicama< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в
ćelije koje su preživjele nakon izlaganja. Epigenetska aktivacija na MOT proizvodi stabilan MDR fenotip.
2) Hitno formiranje MDR-a osigurava se aktivacijom ekspresije ER1 gena: indukcijom njegove transkripcije i stabilizacijom mRNA.
3) Aktivacija MDR-a uključuje opšte mehazome ćelijskog odgovora na stres: put sfatidilinozitola, protein kinazu C, mobilizaciju intracelularnog 2+, aktivaciju NaκB, protein kinaze aktivirane mitogenom i regulaciju fizičkog stanja hromatina. Inhibicija ovih mehanizama sprječava razvoj MDR-a u stanicama koje prežive liječenje ovim lijekovima protiv tumora.
4) Prevazilaženje PgP barijere i izazivanje mehanizama smrti koji funkcionišu u ćelijama sa MDR neophodni su i dovoljni uslovi za uništavanje takvih ćelija.
5) Pgp pojedinačno i MDR fenotip u cjelini ne osiguravaju opstanak pgp-a pod utjecajima koji uzrokuju primarno kršenje integriteta omatske membrane. Dakle, plazma membrana je apeutička meta, a indukcija nekroze je jedna od strategija za prevladavanje arterijskog otpora.
6) Smrt ćelija sa MDR, uzrokovana narušavanjem integriteta zimske membrane (liza posredovana perforacijom), uzrokovana je otoksičnim T-limfocitima nastalim kao odgovor na imunizaciju sa ćelijama hole modifikovanim da eksprimiraju citokine.
7) Intracelularni metaboliti koji mogu oštetiti zimatsku membranu i uzrokovati smrt stanica s MDR-om su slobodni molekuli kisika. Njihovo stvaranje pod uticajem antitumorskih garata je efikasan mehanizam za prevazilaženje MDR-a.
Glavne publikacije na temu disertacije:
1. Shtil A., Shushanov A., Stavrovskaya A., Moynova E. Učestalost metastaza u ćelijama tumora sirijskog hrčka odabranim za niske nivoe “tipične” rezistencije na više lijekova. Eksperimentalna i toksikološka patologija, 1994, 46, 257-262.
2. Erokhina M., Shtil A., Shushanov S., Sidorova T., Stavrovskaya A. Djelomična restauracija aktinskog citoskeleta u transformiranim fibroblastima sirijskog hrčka odabranim za niske nivoe "tipične" rezistencije na više lijekova J/FEBS Letters, 1994,341, 295-298.
3. Stromskaya T., Filippova N., Rybalkina E., Egudina S., Shtil A., Elisseenkova A., Stavrovskaya "A. Promjene u sintezi melanina u ljudskim ćelijama melanoma odabran in vitro za više lijekova lesislaaccJ/Eksperimentalna i toksikološka patologija, 199 47, 157-166.
4. Yu R., Shtil A., Tan T.-H., Roninson I., Kong T. Adriamycin aktivira c-Jun N-terminalnu kinazu u ljudskim ćelijama leukemije: relevantnost za apoptozu JlCancer Letter: 1996,107, 73 -81.
5. Komarov P., Shtil A., Buckingham L., Balasubramanian M., Piraner O., Emanuel M, Roninson I., Coon J. Inhibicija MDR1 izazvane citarabinom (aktivacija gena P-glikoproteina u ljudskim tumorskim stanicama masnim acid-PEG-diesteri masnih kiselina, novi inhibitori funkcije P-glikoproteina I I International Journal of Cancer, 1996,68 245-250.
6. Walter R., Shtil A., Roninson I., Holian O. 60 Hz električna polja inhibiraju aktivnost protein kinaze C i povećanje regulacije gena rezistencije na više lijekova (MDR1) JIRadiatio Research, 1997, 147, 369-375.
7. Walter R., Shtil A., Roninson I., Reyes H., Holian 0. Efekti aktivnosti 60 Hz električne fon protein kinaze S i ekspresije gena za rezistenciju na više lijekova (MDR1) // Current Surgery, 1997, 54,366-370 .
Stromskaya T., Rybalkina E., Filippova N., Shtil A., Stavrovskaya A. Regulacija ekspresije gena MDR1 i funkcije P-glikoproteina u kultivisanim ćelijama melanoma i hepatoma .//British Journal of Cancer, 1998, 77, 1716-1725 .
Komarov P., Shtil A., Holian 0., Tee L., Buckingham L., Mechetner E., Roninson I., Coon J. Aktivacija gena LRP (proteina vezanog za plućnu rezistenciju) kratkotrajnim izlaganjem ljudi ćelije leukemije u forbol ester i citarabin.f/Oncology Research, 1998, 10, 185-192.
I. Shtil A, Mandlekar S, Yu R., Walter R., Hagen K., Roninson I., Tan T.-H., Kong T. Diferencijalna regulacija protein kinaza aktiviranih mitogenom agensima za vezivanje mikrotubula u ljudskim dojkama ćelije raka J/Oncogene, 1999, 18, 377-384.
Damiano J., Cress A., Hazlehurst L., Shtil A. i Dalton W. Rezistencija na lijekove posredovana adhezijom stanica (CAM-DR): uloga integrina i otpornost na apoptozu u ćelijskim linijama humanog mijeloma MBlood, 1999,93, 1658- 1667.
Shtil A., Turner J., Durfee J., Dalton W. i Yu H. Vakcina tumorskih ćelija zasnovana na citokinama je podjednako efikasna protiv roditeljskih i izogenih ćelija mijeloma rezistentnih na više lekova: uloga citotoksičnih T-limfocita. I/Blood, 1999, 93, 1831-1837.
Shtil A., Ktitorova O., Kakpakova E. i Holian O. Diferencijalni efekti agenasa za aktivaciju gena MDR1 (rezistencija na više lijekova) na protein kinazu C: dokaz za redundantnost mehanizama stečenog MDR-a u ćelijama leukemije.//Leukemija i Lymphoma, 2000, 40, 191-195.
Shtil A., Grinchuk T., Tee L., Mechetner E., Ignatova T. Prekomjerna ekspresija MDR1 gena povezana je sa smanjenim mitohondrijskim transmembranskim potencijalom u K562 humanim ćelijama leukemije odabranim za otpornost na više lijekova posredovanu P-glikoproteinom.//International Journal of Oncology, 2000,17,387-392. Shtil A., Turner J., Dalton W., Yu H. Alternativni putevi ćelijske smrti za: zaobilaženje pleiotropne rezistencije u ćelijama mijeloma: uloga citotoksičnih T-limfocita // Leukemia and Lymphoma, 2000, 38, 59-70.
16. Shtil A.A. Putevi prijenosa signala i transkripcijski mehanizmi kao mete za prevenciju pojave rezistencije na više lijekova u ljudskim stanicama raka. HCurre, Drug Targets, 2001,2, 57-77.
17. Shtil A. A. Epigenetska aktivacija rezistencije tumorskih ćelija na više lijekova: prijenos signala, transkripcijska aktivacija i mogućnosti prevencije // "Napredak moderne biologije", 2001, 121, 563-575.
18. Sidorova T.A., Nigmatov A., Kakpakova E.S., Stavrovskaya A.A., Gerassimova G.K., Shtil A.A., i Serebtyakov E.P. Efekti izoprenoidnih analoga oiSDB-etilendiamina na tumorske ćelije otporne na više lijekova sami i u kombinaciji s hemoterapeutskim dmgs.l/Journal of Medicinal Chemistry, 2002,21,5330-5339.
19. Shtil A. A. Pojava rezistencije na više lijekova u ćelijama leukemije tokom hemoterapije: mehanizmi i prevencija.1 ¡Journal of Hematotherapy and Stei Cell Research, 2002, 11, 231-241.
20. Shtil A. A. Multifaktorska rezistencija na lijekove: P-glikoprotein na vrhu Vyraxmi.ll Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research, 2002,11,437-43
21. Shtil A. A. P-glikoprotein kao terapijski cilj: dobre vijesti.l/Leukemia, 2002, 2169-2170.
22. Shtil A.A. Razvoj rezistencije na više lijekova kao hitnog odgovora stanica na egzogene utjecaje. // "Biološke membrane (2003,20,236-243.
23. Lehne G., Shtil A.A. Ciljanje P-glikoproteina za izvođenje mehanizama ćelijske smrti kod raka., H "Ciljane terapije raka, Odiseja", 2003, 203-i
Servis kopirne opreme Državnog naučno-istraživačkog centra po imenu. H.H. Blokhin RAMS Potpisano za objavljivanje 14. II .03 Narudžba br. 24"/. Tiraž 100 primjeraka.
Ovaj rad na disertaciji bi trebao biti dostupan u bibliotekama u bliskoj budućnosti.
480 rub. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Disertacija, - 480 rubalja, dostava 1-3 sata, od 10-19 (moskovsko vrijeme), osim nedjelje
Štil, Aleksandar Albertovič. Rezistencija tumorskih stanica na lijekove posredovana P-glikoproteinom: mehanizmi urgentnog formiranja i pristupi prevladavanju: apstrakt disertacije. ... Doktor medicinskih nauka: 14.00.14.- Moskva, 2003.- 46 str.: ilustr.
Uvod u rad
Relevantnost teme
I. Multirezistencija tumorskih ćelija:
biološki mehanizmi i značaj u onkologiji.
Unatoč značajnom napretku u farmakologiji, uključujući razvoj tehnologije za stvaranje lijekova sa očekivanim svojstvima, uspjeh kemoterapije za tumore ograničen je najvažnijom osobinom živih sistema – sposobnošću reagovanja na promjene u vanjskom okruženju. Jedna od manifestacija takve dastičnosti je razvoj rezistencije tumorskih ćelija na lijekove [koji se koriste u kemoterapiji. Široka rasprostranjenost i dugotrajna, uporna priroda adaptacije ćelija na spoljašnje uticaje sugerišu da prevazilaženje rezistencije na lekove može biti povezano ne samo sa potragom za efikasnijim lekovima: verovatno ne postoji lek na koji ćelije ne bi mogle da razviju rezistenciju. Samo rasvjetljavanje noloških mehanizama otpornosti na različite vrste stresa poslužiće kao osnova za razvoj strategija za prevazilaženje rezistencije na lijekove, neophodnog uslova za povećanje efikasnosti liječenja oboljelih od raka.
Multirezistencija na lijekove (MDR) neoplazmi – očuvanje vitalnosti tumorskih stanica kao odgovor na djelovanje različitih lijekova – jedan je od glavnih razloga za progresiju! Bolesti: tumor je neosjetljiv na kemoterapiju, bez obzira na kombinaciju lijekova. Fenomen MDR-a ima dugotrajan i stabilan karakter: mehanizmi otpornosti se nasljeđuju kroz generacije ćelija. Dakle, MDR je jedan od ključnih faktora u progresiji tumora.
Postoje dvije glavne vrste otpornosti stanica na toksine. Primarni npr. Otpornost uočena prije izlaganja hemoterapijskim lijekovima je posljedica ekspresije odbrambenih mehanizama tokom progresije tumora. Da, aktivacija
anti-apoptotički mehanizmi koji daju rezistenciju na imunološke efektore mogu biti povezani s rezistencijom na lijekove. Sekundarna (stečena) rezistencija se javlja u ćelijama izloženim stresu. Prije ovih efekata, zaštitni mehanizmi u takvim stanicama su slabo izraženi ili odsutni; preživjevši nakon tretmana s jednim toksinom, stanice stiču otpornost na mnoge supstance - MDR (Riordan, Ling, 1985). Daljnja selekcija konsoliduje stečeni fenotip kroz generacije ćelija.
Najvažniji mehanizam MDR-a je smanjeno nakupljanje toksina u ćeliji, zbog izlučivanja supstanci u međućelijsku sredinu. Takav transport obavlja integralni protein P-glikoproteina plazma membrane (Pgp) zahvaljujući energiji hidrolize ATP-a (Juliano, Ling, 1984)."! ljudski Pgp je kodiran genom. MDRI(rezistencija na više lijekova 1), lokalizirana na hromozomu 7 (Chen et al., 1986). Brojni podaci ukazuju na povećanje mRNA MDRI i Pgp često služi kao faktor u otpornosti više tipova tumora na tretman (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).
II. Razvoj MDR-a u tumorskim ćelijama: biološki mehanizmi kao mete Za prevencija
Razumno je pretpostaviti da je povećana količina mRNA MDRI uzrokovano amplifikacijom ovog gena. Ovaj MDR mehanizam je identifikovan u kultivisanim ćelijskim linijama odabranim za preživljavanje u prisustvu toksina (Roninson, 1991). Međutim, kada se analiziraju ljudski tumori, genska amplifikacija MDR1 nije otkriven ni u primarnim tumorima ni u neoplazmama nakon tretmana. Vjerovatni uzrok kliničkog MDR-a je pretjerana ekspresija MDRI i Pgp sa nepromijenjenom strukturom gena (očuvanje broja kopija i nukleotidne sekvence), tj. epigenetska aktivnost fenotipa. U kulturama ljudskih tumorskih ćelija, povećanje nivoa mRNA MDRI i količina Pgp-a zabilježena tokom jednog tretmana kemoterapije
različite po hemijskoj strukturi i mehanizmima delovanja (Chaudhary, Aninson, 1993). Dobiveni su dokazi o akumulaciji mRNA MDR\ kod metastaza raka u plućno tkivo već 20-50 minuta nakon početka intraoperativne plućne infuzije doksorubicina (Abolhoda et al., 1999). Ovi rezultati (potvrđuju mogućnost epigenetske aktivacije MDR-a u eksperimentu iu drugim situacijama: povećana mRNA MDR\ i Pgp u tumorima se mogu pojaviti bez genske amplifikacije MDRI.
Ova vrsta biološke regulacije - hitna aktivacija fenotipa - uključuje indukciju transkripcije gena (gena) koji kodiraju odgovarajući fenotip, i/ili post-transkripcijsku kontrolu (stabilizacija NK, regulacija sinteze i funkcionisanja proteina). za MDR, ova vrsta regulacije znači mogućnost indukcije gena MDR\ stanične stimulacije i relativno brz razvoj rezistencije u stanicama r/holesterola kao odgovor na stres. Inducibilnost gena MDRI ukazuje na razvoj signalnih puteva od periferije ćelije do jezgra. Takvi putevi mogu uključivati signalne mehanizme za implementaciju stresa: protein kinazu C ÍKS), fosfolipaze i intracelularni Ca 2+, mitogen-aktivirane urinarne kinaze, nuklearni faktor kapa B (NFkB). Signaliziranje gulatornom području gena MDRI a transkript osigurava aktivaciju kompresije gena.
Proučavanje MDR regulacije također ima fundamentalni praktični aspekt. Inhibicija ovih mehanizama korištenjem farmakoloških i/ili genetskih utjecaja spriječila bi razvoj MDR-a u procesu [myoteragash.
III. Prevazilaženje formiranog MDR tumorskih ćelija.
Ako blokira aktivirajući gen MDR\ signali mogu spriječiti stvaranje MDR-a u primarnim senzornim stanicama, tada takvim
pristup nije primjenjiv za savladavanje već formiranog otpora. Tradicionalna metoda borbe protiv sekundarne MDR je upotreba Pgp modulatora u kombinaciji sa citostaticima (Lehne, 2000). Međutim, upotreba Pgp inhibitora ograničena je nuspojavama (poremećaji srčanog ritma, imunološka neravnoteža). Jednako je važno da se efikasnost kombinacije modulator + hormon-statika može smanjiti zbog blokiranja barem nekih mehanizama ćelijske smrti tokom selekcije za MDR.
Prevazilaženje formiranog MDR-a moguće je ako su ispunjena dva uslova: 1) koncentracija leka mora biti dovoljna da aktivira efektorske mehanizme ćelijske smrti, 2) funkcije ovih mehanizama moraju biti očuvane u ćelijama sa MDR-om. Prvi uslov je ispunjen ako lijek prevlada Pgp barijeru. Međutim, potrebno je dokazati da je postizanje kritične intracelularne koncentracije agensa dovoljno da se aktivira smrt ćelije koja je otporna na mnoge uticaje. Mehanizmi preživljavanja koji djeluju u rezistentnim ćelijama trebali bi poslužiti kao mete za eliminaciju potonjih.
Da bi se implementirao drugi uslov, izgledaju obećavajući pristupi usmjereni na lizu rezistentnih stanica kao mehanizam za izazivanje njihove smrti. Vakcinacija miševa sa stanicama singenog mijeloma transficiranih cDNK određenih citokina dovodi do razvoja imunološkog odgovora posredovanog citotoksičnim T-limfocitima (CTL) i odbacivanja cijepljenog tumora kod imuniziranih životinja (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. ., 1996). CTL-ovi liziraju ćelije koristeći granzim B i perforin. Budući da granzim B aktivira kaspazu 3, jedan od distalnih efektora apoptoze, a perforin uzrokuje primarno oštećenje plazma membrane (nekrozu), možemo se nadati da će SL-ovi biti efikasni ako se blokiraju proksimalni mehanizmi smrti; pokretanje distalnih veza apoptoze u kombinaciji s nekrozom
dovodi do smrti ćelija otpornih na antitumorske lekove – promotore programirane ćelijske smrti.
Formulacija problema
MDR je klinički nepovoljan fenomen, za čije prevladavanje je potrebno poznavanje mehanizama njegovog razvoja i načina na koje dolazi do odumiranja stanica, potrebno je proučiti oba aspekta problema. Prvo, potrebno je proučiti mehanizme razvoja MDR-a u MD/? l/Pgp-negativne ljudske ćelije, proučavanje ovih mehanizama će poslužiti za sprečavanje razvoja rezistencije u prvenstveno osetljivim ćelijama. Drugo, analiza procesa smrti u ćelijama sa MDR-om stvoriće osnovu za prevazilaženje rezistencije u situacijama kada je nastao sekundarni MDR.
Svrha istraživanja je da se utvrde mehanizmi urgentnog formiranja limfnih čvorova u humanim tumorskim ćelijama i razviju pristupi za prevazilaženje ovog otpora.
Optimizirati modele za razvoj MDR-a u kulturama ljudskih tumorskih ćelija kao odgovor na efekte kemoterapije i eksperimentalnih agonista i antagonista signalnih mehanizama.
Odredite glavne! mehanizam urgentnog razvoja MDR-a kada se ćelije tretiraju antitumornim agensima: amplifikacija gena MDRI, selekcija Pgp-pozitivnih ćelija ili de novo supresija MDR-a.
Istražiti puteve intracelularnog prenosa signala koji regulišu aktivaciju MDR - protein kinaze C, fosfolipaze C, ćelijskog Ca+, mitogen-aktiviranih protein kinaza, NFkB).
Identificirati ulogu transgresijske aktivacije i posttransgresijske regulacije (stabilnost mRNA) ekspresije gena MDRI u neposrednom razvoju MDR-a kao odgovoru na izlaganje kemoterapiji.
Razviti načine za sprječavanje razvoja MDR-a u tumorskim stanicama kada se kombiniraju lijekovi za kemoterapiju s blokatorima MDR\- aktiviranje signalnih puteva i inhibitori transkripcije gena
Proučiti kinetiku aktivacije sekretornih i efektorskih kaspa, promjene u transmembranskom potencijalu mitohondrija, proteolitičko cijepanje poli(ADP)riboze polimeraze, internukleosomalnu fragmentaciju DNK i integritet plazma membrane u roditeljskim stanicama i varijante s MDR-om kada se liječi lijek koji se ne prenosi P-glikoproteinom.
Koristite vakcinaciju tumorskim ćelijama koje eksprimiraju citokine da biste stvorili imuni odgovor protiv MDR ćelija.
Odredbe dostavljene na odbranu.
Formiranje Pgp-posredovanog MDR-a - hitnog ćelijskog odgovora na mnoge utjecaje - posredovano je epigenetskom aktivacijom gena MDRI. Ova aktivacija je posljedica višestrukih mehanizama intracelularne signalizacije, indukcije promotora gena i stabilizacije mRNA i može se spriječiti inhibitorima ovih signala.
Prevazilaženje Pgp-posredovanog MDR-a može biti povezano sa ciljanjem plazma membrane rezistentnih ćelija. Pgp ne štiti ćelije od narušavanja integriteta plazma membrane – nekroze.
Naučna pozadina Po prvi put je potkrijepljena ideja o nastanku MDR-a kao hitnog odgovora ćelije na egzogeni stimulus;
Po prvi put je detaljno proučavan mehanizam razvoja specifičnog fenotipa rezistencije na lijekove - Pgp-posredovanog MDR-a: epigenetska aktivacija gena koji kodira ovaj protein MDRI.
3. Po prvi put je razvijen model hitne aktivacije gena MDRI,
praćeno sticanjem stabilnog fenotipa Pgp-posredovanog MDR-a u kultivisanim ljudskim tumorskim ćelijama; \. Identificirani su putevi prijenosa signala, mehanizmi aktivacije transkripcije i post-transkripcijska genska regulacija MDRX u ćelijama izloženim antitumorskim lijekovima. 5. Po prvi put su klase farmakoloških supstanci - blokatora intracelularnog prijenosa signala - okarakterisane da spriječe stvaranje Pgp posredovanog MDR-a u tumorskim stanicama. 5. Po prvi put su proučavani mehanizmi smrti koji djeluju u ćelijama sa Pgp posredovanim MDR-om i razvijen je pristup prevladavanju rezistencije koji je uključivao primarno oštećenje integriteta plazma membrane.
Praktična vrijednost.
Razvoj metoda za sprječavanje hitnog razvoja Pgp-posredovanog MDR-a u kultiviranim tumorskim stanicama kada su izloženi kemoterapijskim lijekovima.
Pretklinička ispitivanja modificiranih genetski modificiranih vakcina za prevladavanje MDR-a.
Apromacija rada.
Disertacija je razmatrana 30. juna 2003. godine na zajedničkoj konferenciji laboratorija genetike tumorskih ćelija, citogenetike sa grupom molekularne genetike, virusnih i ćelijskih onkogena, molekularne endokrinologije, antitumorskog imuniteta, biohemijske farmakologije, medicinskih istraživanja, eksperimentalne dijagnostike i bioterapija tumora; Odeljenje za šmunologiju, hematologiju, hemoterapiju, kliničku farmakologiju, napredne metode lečenja Ruskog centra za istraživanje raka po imenu. N.N. Blokhin RAMS.
Glavni materijali disertacije predstavljeni su na sljedećim konferencijama: 2. međunarodni simpozijum "Rezistencija na citostatske lijekove", (U Njemačka, 1991.); Gordon konferencija "Napredak u hemoterapiji" (Njujork, London, SAD, 1994); "Molekularna toksikologija" (Copler Mountain, SAD, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, SAD, 1996); "Nukleinske kiseline - Integracija molekularne dijagnostike i terapije" (San Dijego, SAD, 1996); godišnja konferencija Američkog udruženja za istraživanje raka (1994-2001): 6 I 7. kongresi "Napredak u onkologiji", (Hersonisos, Grčka, 2001,2002); „Struktura i funkcije ćelijskog jezgra“ (Sankt Peterburg, 2002), kao i na seminarima u Oncotech, Inc. (Irvine, SAD, 1996), Institut Salk (LaJolla, SAD, 1997), Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, SAD, 1997), The Jackson Laboratory (Bar Harbor, SAD, 1997), Sloan-Kettering Cancer Center, New Yo ] SAD, 1999), univerziteti u Kopenhagenu (2002), Insbruku (2002) i Groningeju (2003), Moskovski državni univerzitet. M.V. Lomonosov (2002), Istraživački institut za eksperimentalnu patologiju, onkologiju i radiobiologiju im. R.E. Kavetsky (Kijev, 2002).
Publikacije.
Struktura i obim disertacije.
Studije programirane ćelijske smrti - apoptoze (od grč. αποπτωσις
- opadanje lišća) - u posljednjoj deceniji povukli su nekoliko važnih naučnih otkrića: otkriven je holistički sistem za implementaciju ovog fenomena - identifikovani su geni koji ga regulišu, kao i površinski ćelijski receptori i njihovi ligandi koji posreduju u ćelijskoj smrti.
U brojnim eksperimentima, naučnici su dokazali: programirana smrt je obavezno i integralno svojstvo svake ćelije bilo kojeg višećelijskog sistema. (Svakoga dana oko 5% tjelesnih ćelija prolazi kroz apoptozu, a na njihovo mjesto dolaze nove. Ćeliji je potrebno od 15 minuta do 2 sata da nestane bez traga).
2002. molekularni biolog Sidney Brenner ( Sydney Brenner, Robert Horwitz ( H. Robert Horvitz) i John Sulston ( John Edward Sulston) za otkrića u oblasti „genetičke regulacije razvoja organizma i programirane ćelijske smrti“ dobio je Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu.
Stručnjaci smatraju da bi dalja istraživanja apoptoze mogla doprinijeti razvoju lijekova protiv opasnih bolesti poput raka, moždanog udara, srčanog udara, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i nekih drugih.
ALEXANDER ALBERTOVICH STIHL– Doktor medicinskih nauka, rukovodilac Laboratorije za mehanizme odumiranja tumorskih ćelija, Istraživački institut za kancerogenezu, Ruski centar za istraživanje raka im. N.N. Blokhin Ruska akademija medicinskih nauka.
Specijalista iz oblasti ćelijske i molekularne onkologije.
Naučna interesovanja: mehanizmi programirane ćelijske smrti (bakterije i eukarioti, posebno tumorske ćelije).
Pitanja_Elena Vetrova
mart, april
Moskva, 2009
Aleksandre Albertoviču, apoptoza je jedan od ključnih bioloških procesa koji se dešavaju u tijelu tokom cijelog života. Ima ključnu ulogu u embrionalnom razvoju organizma (morfogeneza), u održavanju dinamičke ravnoteže u organima i tkivima (homeostaza), te u procesu inicijacije i razvoja tumora.(karcinogeneza).
U kojim drugim slučajevima se program samoubistva ćelija uključuje u tijelu? A kako ovaj program "zna" šta je dobro za organizam, a šta loše?
Na sl. apoptoza. Proces počinje kada se iscrpi funkcionalnost ćelije. Geni koji obezbeđuju deobu ćelija su blokirani, a geni koji obezbeđuju sintezu litičkih (od grč. lytikos - rid , rastvoriti ) enzimi - stimulisani. Ovi enzimi ulaze u jezgro i liziraju (uništavaju) hromatinhromozoma- kompleks DNK, RNK i proteina. Kromosomi se raspadaju i sinteza u ćeliji prestaje.
Neki vanjski znakovi apoptoze u ćeliji:
piknoza (skupljanje jezgra);
kromatoliza (smanjenje nuklearnog bojenja);
karioreksija (raspad jezgra na dijelove);
uništavanje citoplazme itd.
Ostatke fagocitiraju (progutaju) makrofagi.
Programirana smrt se aktivira tokom fizioloških procesa – u najjednostavnijim organizmima, na primjer, bakterijama, kako bi se održala veličina stanične populacije koja je optimalna za date uvjete okoline (hranjivi sastojci, temperatura). Ovaj efekat se primećuje u biofilmima, samoregulišućim bakterijskim zajednicama.
U embrionalnom razvoju tkiva i organa viših organizama iu odraslom organizmu, programirana smrt služi za zamjenu ćelijske populacije - starenja i gubitka funkcija - mladima.
Program ne zna šta je dobro, a šta loše za organizam, jednostavno život funkcioniše - smrt je strana života...
To jest, nuspojava evolucije je too čemu August Weissmann govori?Nemački zoolog i evolucionista, pisao je krajem 19. veka...
...Prema tome, smrt netumorskih ćelija tokom kemoterapije je loša: apoptoza normalnih ćelija je ovde nepoželjna, ali program se ne raspoređuje između „loših i dobrih“, već omogućava onima koji mogu da prežive da prežive, uništavajući što više. ranjiviji, osjetljiviji... Pravda u ljudskom razumijevanju ovdje ne funkcionira, a ovo beznađe i "neprincipijelnost" morate platiti.
Za postojanje apoptoze naučnici su saznali ne tako davno, prije otprilike pola stoljeća. Kako je ovo otkriće uticalo na razvoj nauke?
Na sl. aktiviranje genetskog programa apoptoze u ćeliji pod uticajem spoljašnjih faktora (signala)
(Slika se uvećava kada kliknete na nju kursorom)
Ovo otkriće omogućilo je da se u kratkom vremenu - preko 15 godina - formiraju ideje o najvažnijim biološkim procesima - prijenosu intracelularnih signala, regulaciji proteolize - procesu razgradnje proteina i peptida u tijelu, regulaciji oblika jezgra, organela i membrana.
Intenzivirano je proučavanje uloge proteina hromatina u ekspresiji gena.
Utemeljene su ideje o mehanizmu delovanja citostatika, uglavnom antitumorskih lekova i jonizujućeg zračenja, na tumorske i normalne ćelije.
Otkriće mehanizama ćelijske smrti danas je fokusiralo mnoge naučne pravce - od biologije i hemije do terapije bolesti ljudi, životinja i biljaka.
Da, ovaj smjer se smatra jednim od najperspektivnijih u molekularnoj biologiji. Optimistički se povezuje s razvojem fundamentalno novih lijekova za liječenje još uvijek neizlječivih degenerativnih bolesti, raka, pa čak i mogućnosti da se pobijedi starost.
Prema nekim izvještajima, više od četiri stotine laboratorija u svijetu danas je na neki način uključeno u ovu temu.
Obećanje za proučavanje apoptoze za molekularnu biologiju je zbog činjenice da ovaj fenomen (i, šire gledano, ćelijska smrt) pokriva kombinaciju mnogih naučnih ideja i pravaca. Ćelija, bila jednostavna ili složena, uvijek je složen sistem, a smrt je sastavno svojstvo živih bića. Stoga je proučavanje smrti općenito obećavajuće za razumijevanje suštine života.
I zaista, u praktičnom smislu, proučavanje mehanizama smrti omogućit će preciziranje djelovanja mnogih lijekova.
Relativno nedavno, fenomen je otkriven efekat posmatrača (« efekat posmatrača"): kada ćelije koje umiru iz bilo kog razloga šalju određeni signal zdravim ćelijama u blizini i one se samounište. Šta ih motiviše? Postoje li neke hipoteze o tome?
Ovo je primjer biološke regulacije u složenom sistemu: na taj način ćelije se međusobno ubijaju šaljući signale svojim susjedima. Signal (obično protein rastvorljiv u vodi) nije štetan za sopstvene ćelije, ali je destruktivan za ćelije različitog porekla koje se nalaze u istoj populaciji - igra se zasniva na ovoj razlici u osetljivosti.
Koja je uloga kisika i vodikovog peroksida u procesu apoptoze?
Veoma važno - radikali kiseonika su hemijski veoma aktivni. Pokreću reakcije koje oštećuju proteine, nukleinske kiseline i lipide.
Rice. povećava kada kliknete na njega kursorom.
Terapijski učinak jonizujućeg zračenja i antraciklinskih antibiotika zasniva se na ovom svojstvu. Ekscitacija specijalnih hemijskih jedinjenja - fotosenzibilizatora - svetlošću izaziva eksploziju kiseonika i teško oštećenje ćelija. Ako se takav fotosenzibilizator akumulira u tumoru i ovaj se osvijetli, dolazi do smrti tumorskih stanica. U onkologiji se takva terapija naziva fotodinamička i široko se koristi, međutim, za tumore koji su dostupni svjetlosti i nisu velike veličine.
Princip apoptoze se uočava i na ćelijskom i na subćelijskom nivou, u tkivima i organima. Akademik Ruske akademije nauka Vladimir Skulačev predložio je da se ovaj fenomen nazove fenoptoza. Zašto u prirodi neke biljke i životinje (bambus nakon cvjetanja, losos nakon mrijesta) uključuju program samouništenja u cvijetu svog života? Malo je vjerovatno da će to biti posljedica ireverzibilnih genskih mutacija.
Vjerovatno nije povezano, ali ovo je mehanizam prirode - jezik kojim se kaže da će izblijedjeli bambus umrijeti... Mehanizam je epigenetski - nema mutacija, ali dolazi do brzih promjena u fizičko-hemijskim svojstvima hromatina , a važan gen (geni) iz rada postaje tih. Takav jezik ne zahtijeva nikakvo uništavanje - dovoljno je spojiti ili odvojiti kemijsku grupu - metil, fosfat, acetil - s jednog proteina na drugi.
Dosta nagoveštaja...
Postoji hipoteza da je rak i programirana smrt genetski nestabilnog organizma koja sadrži nepopravljivu štetu (i samim tim opasna za evoluciju). Sve češće se može čuti od onkologa da je pojava potpuno transformisane ćelije samo pitanje vremena. Ako je tako, onda rak nije bolest, kao starost, već određeni rezultat razvoja živog sistema. Ali naučnici pretpostavljaju, a futurolozi predviđaju, pobjedu nad rakom u budućnosti. I zaista, na kraju, čovjek je odavno prestao očekivati milost od evolucije. Da li je moguće pobijediti rak?
Možda se ne može pobijediti - rak je jedan od mehanizama uklanjanja nesposobne osobe, uz druge tipične patološke procese - upale, alergije. Organski život se gradi na prometu organizama – smrt je neizbežna, a mehanizmi za njeno sprovođenje su neophodni. Rak je jedan od takvih mehanizama. Zadatak naučnika je da odgode smrt, a ne da je izbjegnu.
Ako postoji jaka veza između starenja i razvoja raka, a očigledno niko u to ne sumnja, možda je potrebno proširiti front borbe protiv njega na razmjere borbe protiv starenja?
Borba protiv starenja je neophodna kako u okviru borbe protiv tumora, tako iu drugim aspektima - to je nesumnjivo.
Odbrana tijela protiv raka zasniva se na apoptozi. Zašto apoptoza prestaje djelovati nakon niza mutacija? Zašto, u nekom trenutku, tijelo prestane da se opire i počne da pomaže tumoru (na primjer, imunološkom sistemu)?
Zato što je apoptoza, kao i svaki biološki proces, poremećena mutacijama, a takođe i zato što se apoptoza može lako poremetiti bez mutacija.
Koja je uloga grupe enzima citokroma P450 u procesu karcinogeneze?
3.Sir John Sulston- Britanski biolog, član Kraljevskog društva Velike Britanije. Njegova laboratorija je sastavila potpun opis redoslijeda podjele embrionalnih ćelija nematode Caenorhabditis elegans i pratila sudbinu apsolutno svih njenih 959 ćelija tokom razvoja.
Bez sumnje. Postojanje ovakvih proteina potvrđuje suštinski značaj apoptoze u biologiji – mehanizmi ove pojave nisu slučajni, oni su kodirani u DNK ćelije i stupaju u akciju kada postoji odgovarajući signal. Bez njih nema smrti.
Nedavno su američki istraživači sa Instituta za medicinu Albert Einstein otkrili da mali fragment intracelularnog proteina p115 aktivira apoptozu.
Prije apoptoze, p115 se raspada na dva fragmenta, od kojih se manji sastoji od 205 aminokiselina. Prema naučnicima, on igra važnu ulogu u procesu ćelijske smrti, jer njegova ekspresija dovodi do oslobađanja citokroma C iz mitohondrija u citoplazmu ćelija, što dovodi do njihove smrti. Naučnici se nadaju da bi ovo otkriće moglo dovesti do razvoja novih lijekova za borbu protiv raka i drugih patologija koje karakterizira pretjerana proliferacija stanica.
Po Vašem mišljenju, koja su od najnovijih otkrića u oblasti apoptoze ključna za medicinu i biologiju?
Na sl. ekspresija malog fragmenta proteina p115 (prikazano zelenom bojom) dovodi do oslobađanja citokroma C (crvenog) iz mitohondrija u citoplazmu ćelija, što dovodi do smrti ćelije.
http://www.cbio.ru/article.php?storyid=3319
Novi pristupi liječenju proliferativnih bolesti baziraju se na sličnom fenomenu – stvaranju uvjeta pod kojima bi vlastiti proteini stanice djelovali kao ubice. Dakle, proteolitičko cijepanje proteinske poli(ADP-riboza) polimeraze, koje nastaje tijekom indukcije apoptoze, formira njen fragment koji se vezuje za DNK i sprječava popravak njenog oštećenja. Normalna proteinska poli(ADP-riboza) polimeraza, neophodna za zacjeljivanje oštećenja DNK, postaje destruktivna za ćeliju.
Najnovija otkrića koja sada dobijaju važnu praktičnu primjenu za regulaciju stanične smrti uključuju dokaze o mogućnosti supresije specifičnog gena u ćeliji i cijelom organizmu uvođenjem takozvane kratke antisens RNK.
Tehnologija tihih gena ( utišavanje geni), kada vezivanje kratkih dvolančanih RNA molekula za regulatornu sekvencu ciljnog gena omogućava zaustavljanje procesa sinteze u ovom genu.
Obećavajuća vektorska (virusna) genska terapija.
Ovi alati, proizvod dugogodišnje saradnje između hemičara i biologa, omogućavaju postizanje dugoročnog isključivanja gena. Ako su proizvodi takvih gena važni za vitalnost ćelije, mi izazivamo smrt s minimalnim nuspojavama. Ovo poslednje je posebno važno u onkološkoj klinici - često pacijenti teže tolerišu hemoradioterapiju nego samu bolest... Standardni lekovi se još uvek slabo razumeju koje ćelije i na koji način uništavati. Genska terapija može biti efikasnija, a nuspojave liječenja mogu biti smanjene.
Nesumnjivo je plodan, iako nailazi na brojne poteškoće, koncept target-directed - targeted - (iz engleskog u cilj - cilj, cilj) terapija tumora.
Na sl.
d učinak lijeka Herceptin - (proizvođača Roshe / Švicarska). Kreiran na bazi antitijela koja mogu blokirati proteine HER2 receptora.
Inhibira razvoj tumora.
Stabilizira stanje pacijenta.
Skraćuje period hemoterapije.
(Slika se uvećava kada kliknete na nju kursorom)
Pojedinačni lijekovi stvoreni da inaktiviraju specifičnu metu (protein) u tumorskoj ćeliji su visoko efikasni i dobro se podnose tokom dugih tokova liječenja (primjeri - Gleevec, Iressa).
Vaša laboratorija se bavi istraživanjem strategija za ciljanje puteva inicijacije i implementacije smrti tumorskih ćelija. Dokle ste stigli u rješavanju ovih problema?
Specijalisti naše laboratorije su ustanovili mehanizme smrti tumorskih ćelija pod uticajem novih lekova stvorenih u Rusiji. Konkretno, identificiran je mehanizam u kojem je moguće zaobići otpornost tumorskih stanica na lijekove: nova kemijska jedinjenja prevazilaze barijeru koja inače sprječava ulazak lijekova u ćeliju.
Pored istraživanja uloge hemijskih jedinjenja u reprogramiranju ćelija u ćelije raka i u smrti ćelija raka, bavite se i rasvetljavanjem molekularnih mehanizama ćelijske smrti. Šta ostaje nejasno u vezi sa ovim mehanizmima? Na koja pitanja naučnici još moraju da odgovore?
Važno je shvatiti kako izbjeći indukciju apoptoze u netumorskim stanicama. Ubijanje ćelije nije problem, problem je kako zaštititi zdravu...
Radi li vaša laboratorija na proučavanju mehanizama ubojite funkcije stanica raka? Da li je u principu moguće blokirati destruktivnu aktivnost ćelije raka i njen uticaj na normalna tkiva?
Moguće i neophodno. Čini se da sredstva inaktiviraju faktor nekroze tumora, toksin koji luče ćelije raka i izazivaju uništavanje normalnih ćelija, svojevrsni efekat posmatrača. Ovi proizvodi prolaze početna klinička ispitivanja.
Radili ste u SAD osam godina. Šta razlikuje ruski i zapadni pristup borbi protiv raka? Poznato je da se u Sjedinjenim Državama izdvajaju značajna sredstva za borbu protiv njega i prevenciju raka. A najvažniji rezultat ovih mjera je da se smrtnost od raka postepeno smanjuje.
U Rusiji je situacija sa pojavom raka i dalje teška. Koje mjere mogu preokrenuti nepovoljnu situaciju?
Zapadni naučni stil karakteriše težnja za dubljim proučavanjem mehanizama, a ne samo fenomena, celovitost reprezentacije, zahvaljujući širokim interdisciplinarnim vezama, i velika konkurencija za kreiranje važnih naučnih informacija.
Smrtnost od raka i dalje je globalni problem, ali se na nekim lokacijama situacija popravila. Na primjer, bilo je manje slučajeva raka želuca - promijenjeni su uslovi u ishrani, dugoročno skladištenje hrane postalo je bezbedno razvojem rashladne industrije, organizovana je antiduvanska propaganda - ove javne mere zaista donose pozitivne rezultate .
O inovacijama u zdravstvena zaštita(prvenstveno u oblasti lečenja karcinoma) planirano 10 milijardi dolara– duplo više nego što je predviđeno u tekućoj finansijskoj godini.
A situacija u Rusiji se može poboljšati udruživanjem zajedničkih napora mnogih društvenih slojeva i, naravno, finansijskim sredstvima adekvatnim za ovako složene i važne zadatke.
