Програмирана клетъчна смърт. Александър Щил

За да стесните резултатите от търсенето, можете да прецизирате заявката си, като посочите полетата за търсене. Списъкът с полета е представен по-горе. Например:

Можете да търсите в няколко полета едновременно:

Логически оператори

Операторът по подразбиране е И.
Оператор Иозначава, че документът трябва да съответства на всички елементи в групата:

Проучване и Развитие

Оператор ИЛИозначава, че документът трябва да съответства на една от стойностите в групата:

проучване ИЛИразвитие

Оператор НЕизключва документи, съдържащи този елемент:

проучване НЕразвитие

Тип търсене

Когато пишете заявка, можете да посочите метода, по който ще се търси фразата. Поддържат се четири метода: търсене с отчитане на морфологията, без морфология, търсене по префикс, търсене по фраза.
По подразбиране търсенето се извършва, като се вземе предвид морфологията.
За да търсите без морфология, просто поставете знак „долар“ пред думите във фразата:

$ проучване $ развитие

За да търсите префикс, трябва да поставите звездичка след заявката:

проучване *

За да търсите фраза, трябва да оградите заявката в двойни кавички:

" научноизследователска и развойна дейност "

Търсене по синоними

За да включите синоними на дума в резултатите от търсенето, трябва да поставите хеш " # “ преди дума или израз в скоби.
Когато се приложи към една дума, ще бъдат намерени до три синонима за нея.
Когато се прилага към израз в скоби, към всяка дума ще бъде добавен синоним, ако бъде намерен такъв.
Не е съвместим с търсене без морфология, търсене с префикс или търсене по фраза.

# проучване

Групиране

За да групирате фрази за търсене, трябва да използвате скоби. Това ви позволява да контролирате булевата логика на заявката.
Например, трябва да направите заявка: намерете документи, чийто автор е Иванов или Петров, а заглавието съдържа думите изследвания или разработки:

Приблизително търсене на думи

За приблизително търсене трябва да поставите тилда " ~ " в края на дума от фраза. Например:

бром ~

При търсене ще бъдат намерени думи като "бром", "ром", "индустриален" и др.
Можете допълнително да посочите максималния брой възможни редакции: 0, 1 или 2. Например:

бром ~1

По подразбиране са разрешени 2 редакции.

Критерий за близост

За да търсите по критерий за близост, трябва да поставите тилда " ~ " в края на фразата. Например, за да намерите документи с думите изследвания и разработки в рамките на 2 думи, използвайте следната заявка:

" Проучване и Развитие "~2

Уместност на изразите

За да промените уместността на отделните изрази в търсенето, използвайте знака " ^ “ в края на израза, последвано от нивото на уместност на този израз спрямо останалите.
Колкото по-високо е нивото, толкова по-подходящ е изразът.
Например в този израз думата „изследвания“ е четири пъти по-подходяща от думата „развитие“:

проучване ^4 развитие

По подразбиране нивото е 1. Валидните стойности са положително реално число.

Търсете в интервал

За да посочите интервала, в който трябва да се намира стойността на дадено поле, трябва да посочите граничните стойности в скоби, разделени от оператора ДА СЕ.
Ще се извърши лексикографско сортиране.

Такава заявка ще върне резултати с автор, започващ от Иванов и завършващ с Петров, но Иванов и Петров няма да бъдат включени в резултата.
За да включите стойност в диапазон, използвайте квадратни скоби. За да изключите стойност, използвайте фигурни скоби.

Автореферат на дисертациятапо медицина на тема Лекарствена резистентност на туморни клетки, медиирана от Р-гликопротеин: механизми на спешно формиране и подходи за преодоляване

Като ръкопис

Щил Александър Албертович

ЛЕКАРСТВЕНА РЕЗИСТЕНТНОСТ НА ТУМОРНИ КЛЕТКИ, МЕДИРАНА ОТ Р-ГЛИКОПРОТЕИН: СПЕШНИ МЕХАНИЗМИ И ПОДХОДИ ЗА ПРЕОДОЛЯВАНЕ

Москва 2003 г

Работата е извършена в Държавната институция Руски онкологичен изследователски център на името на Н. Н. Блохин на Руската академия на медицинските науки, Москва

Официални опоненти:

Доктор на медицинските науки, професор A.M. Гарин,

Доктор на биологичните науки, професор, заслужил учен на Руската федерация А. Н. Салрин,

Доктор на биологичните науки, професор Н.С. Сергеева,

Водеща институция: Руска медицинска академия за следдипломно образование на Министерството на здравеопазването на Руската федерация.

Защитата на дисертационния труд ще се състои на 25 декември 2003 г. на заседание на специализирания академичен съвет D.001.017.01 на ул.

RONC кръстен на. Руската академия на медицинските науки N.N.Blokhin на адрес: 115478, Москва, Каширско шосе, 24.

Дисертацията може да бъде намерена в библиотеката на Руския център за изследване на рака. Н. Н. Блохин RAMS.

Научен секретар на специализирания академичен съвет

Доктор на медицинските науки

Ю.В. Шишкин

Обща характеристика на работата Актуалността на темата

I. Мултилекарствена резистентност на туморни клетки: биологични механизми и значение в онкологията.

Въпреки значителния напредък във фармакологията, включително развитието на технологии за създаване на лекарства с очаквани свойства, успехът на химиотерапията при тумори е ограничен от най-важната характеристика на живите системи - способността да реагират на промените във външната среда. Една от проявите на такава еластичност е развитието на резистентност на туморните клетки към лекарства [използвани в химиотерапията. Широкото разпространение и дългосрочната, постоянна природа на клетъчната адаптация към външни влияния предполагат, че преодоляването на лекарствената резистентност може да бъде свързано не само с търсенето на по-ефективни лекарства: вероятно няма лекарство, към което клетките да не могат да развият резистентност. Само изясняването на биологичните механизми на устойчивост на различни видове стрес отново ще послужи за разработване на стратегии за преодоляване на лекарствената резистентност, необходимо условие за повишаване ефективността на лечението на онкоболните.

Мултирезистентността (MDR) на туморите - запазването на жизнеспособността на туморните клетки в отговор на влиянието на различни лекарства - е една от основните причини за прогресията на заболяването: туморът е нечувствителен към химиотерапия, независимо от комбинацията от различни лекарства. Феноменът MDR има дългосрочен и стабилен характер: механизмите на резистентност се наследяват през поколения клетки. По този начин MDR е един от ключовите фактори за прогресията на тумора.

Има два основни типа резистентност на клетките към токсини. Първичен г.е. резистентност, наблюдавана преди излагане на химиотерапия) се дължи на експресията на защитни механизми по време на туморната прогресия. Да, активиране

антиапоптозните механизми, придаващи резистентност към имунните ефектори, могат да бъдат свързани с лекарствената резистентност. Вторичната (придобита) резистентност възниква в клетки, изложени на стрес. Преди тези влияния задвижващите механизми в такива клетки са слабо изразени или липсват; оцелявайки след третиране с един токсин, клетките придобиват резистентност към много вещества - MDR (Riordan, Ling, 1985). По-нататъшната селекция консолидира придобития фенотип през поколения клетки.

Най-важният механизъм на MDR е намаленото натрупване на токсини в клетката, поради отделянето на вещества в междуклетъчната среда. Такъв транспорт се осъществява от интегралния протеин на P-гликопротеина на плазмената мембрана (Pgp) поради енергията на хидролизата на АТФ (Juliano, Ling, 1984).Множество данни показват, че повишенията на MDRI и Pgp mRNA често са фактори за резистентност на множество видове тумори за лечение (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).

II. Развитие на MDR в туморни клетки: биологични механизми като цели за превенция

Разумно е да се предположи, че увеличаването на количеството на MDRI иРНК се дължи на амплификация на този ген. Този MDR механизъм е идентифициран в култивирани клетъчни линии, избрани за оцеляване в присъствието на токсини (Roninson, 1991). Въпреки това, когато се анализират човешки тумори, амплификацията на MDRI ген не се открива нито в първични тумори, нито в неоплазми след лечение. Вероятната причина за клинична MDR е свръхекспресия на MDRI и Pgp с непроменена генна структура (запазване на броя на копията и нуклеотидната последователност), т.е. епигенетичен актив! фенотип. В култури от човешки туморни клетки е отбелязано повишаване на нивото на MDRI иРНК и количеството на Pgp след еднократно третиране с химиотерапевтичното лекарство

различни по химическа структура и механизми на действие (Chaillon and Erwin, 1993). Получени са доказателства за натрупване на MOI 1 mRNA в метастази на рак в белодробната тъкан още 20-50 минути след началото на интраоперативната белодробна инфузия с доксорубицин (Abolhoda et al., 1999). Тези резултати предполагат възможността за епигенетично активиране на MDR в експериментални и клинични ситуации: повишаване на MDR1 и Pgp mRNA в тумори може да настъпи без амплификация на MDR1 гена.

Този тип биологична регулация - спешно активиране на фенотипа - включва индуциране на транскрипция на гена (гените), кодиращи съответния фенотип, и/или пост-преходен контрол (стабилизиране на NK, регулиране на протеиновия синтез и функциониране). спрямо MDR, този тип регулация означава възможността за индуциране на MYR гена\ (клетъчни сливания и относително бързото развитие на резистентност в [ушните клетки в отговор на стрес. Индуцируемостта на MYR 1 гена предполага развитието на сигнални пътища от клетъчната периферия към ядрото.Такива пътища могат да бъдат сигнални механизми, осъществяващи стрес: протеин киназа C KS), фосфолипази и вътреклетъчен Ca2+, митоген-активирани невропсинази, ядрен фактор kappa B (NkB).Предаване на сигнала към регулаторната област на KYR \ ген и транскриптът осигурява активиране на генната компресия.

Изследването на регулирането на MDR има и фундаментален практически аспект. Инхибирането на тези механизми чрез фармакологични и/или терапевтични интервенции би предотвратило развитието на MDR по време на миотерапия.

III. Преодоляване на образуваната MDR от туморни клетки.

Ако блокирането на сигналите за активиране на гена MYR може да предотврати образуването на MDR в първично чувствителни клетки, тогава това е така

подходът е неприложим за преодоляване на вече формирана съпротива. Традиционният метод за борба с вторичната MDR е използването на Pgp модулатори в комбинация с цитостатици (Lehne, 2000). Въпреки това, употребата на Pgp инхибитори е ограничена от странични ефекти (нарушения на сърдечния ритъм, имунен дисбаланс). Също толкова важно е, че ефективността на комбинациите модулатор+цитостатик може да бъде намалена поради блокиране на поне някои механизми на клетъчна смърт по време на селекцията на MDR.

Преодоляването на образуваната MDR е постижимо, ако са изпълнени две условия: 1) концентрацията на лекарството трябва да е достатъчна, за да активира ефекторните механизми на клетъчната смърт, 2) функциите на тези механизми трябва да бъдат запазени в клетките с MDR. Първото условие е изпълнено, ако лекарството преодолее Pgp бариерата. Необходимо е обаче да се докаже, че постигането на критична вътреклетъчна концентрация на агента е достатъчно, за да активира смъртта на клетка, която е устойчива на много влияния. Механизмите за оцеляване, работещи в резистентни клетки, трябва да служат като мишени за елиминирането на последните.

За да се приложи второто условие, подходите, насочени към лизиране на резистентни клетки като механизъм за предизвикване на тяхната смърт, изглеждат обещаващи. Ваксинирането на мишки със сингенни миеломни клетки, трансфектирани с кДНК на определени цитокини, води до развитие на цитотоксичен Т-лимфоцит (CTL)-медииран имунен отговор и отхвърляне на инокулирания тумор при имунизирани животни (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. ., 1996). CTL лизират клетки с помощта на гранзим В и перфорин. Тъй като гранзим В активира каспаза 3, един от дисталните ефектори на апоптозата, и перфоринът причинява първично увреждане на плазмената мембрана (некроза), може да се надяваме, че CTLs ще бъдат ефективни, ако механизмите на проксималната смърт са блокирани; задействане на дистални връзки на апоптоза в комбинация с некроза

води до смърт на клетки, резистентни към антитуморни лекарства, които предизвикват програмирана клетъчна смърт.

Формулиране на проблема

MDR е клинично неблагоприятен феномен, чието преодоляване изисква познаване на механизмите на неговото развитие и начините, по които настъпва клетъчната смърт, необходимо е да се изследват и двата аспекта на проблема. Първо, необходимо е да се изследват механизмите на образуване на MDR в MDR1/Pgp-отрицателни човешки клетки; изследването на тези механизми ще послужи за предотвратяване на развитието на резистентност в предимно чувствителни клетки. Второ, анализът на процесите на смърт, протичащи в клетките на MDR, ще създаде основата за преодоляване на резистентността в ситуации, в които се е образувала вторична MDR.

Целта на изследването е да се установят механизмите на спешно образуване на лимфни възли в човешките туморни клетки и да се разработят подходи за преодоляване на този ад на резистентност.

1. Да се оптимизират модели за развитие на MDR в човешки туморни клетъчни култури в отговор на ефектите на химиотерапевтични лекарства и експериментални агонисти и антагонисти на сигнални механизми.

2. Определете основния механизъм за спешно развитие на MDR, когато клетките се лекуват с антитуморни средства: амплификация на MDR гена, селекция на Pgp-положителни клетки или de novo индукция на MDR.

3. Изследвайте пътищата на вътреклетъчно предаване на сигнала, които регулират активирането на MDR - протеин киназа С, фосфолипаза С, вътреклетъчен Ca2+, митоген-активирани протеин кинази, NFkB).

4. Да се идентифицира ролята на транскрипционното активиране и пост-транскрипционната регулация (mRNA стабилност) на MDR генната експресия в острото развитие на MDR в отговор на ефектите от химиотерапията.

5. Разработете начини за предотвратяване на развитието на MDR в туморни клетки чрез комбиниране на химиотерапевтични лекарства с блокери на CR-активиращи сигнални пътища и инхибитори на генна транскрипция

6. Да се изследват кинетиката на активиране на иницииращи и ефекторни каспи, промени в трансмембранния потенциал на митохондриите, протеолитично разцепване на поли(ADP)рибоза полимераза, междунуклеозомна фрагментация на ДНК и целостта на плазмената мембрана в родителските клетки и варианти с MDR при лечение с лекарство, което не се транспортира от P-гликопротеин.

7. Използвайте ваксинация с експресия на туморни клетки

цитокини за генериране на имунен отговор срещу MDR клетки. »

Разпоредби, представени за защита.

1. Образуването на Pgp-медииран MDR - спешен клетъчен отговор на много влияния - се медиира от епигенетично активиране на гена MDR 1. Това активиране се дължи на множество механизми на вътреклетъчно предаване на сигнала, индукция на генния промотор и стабилизиране на иРНК и могат да бъдат предотвратени от инхибитори на тези сигнали.

2. Преодоляването на Pgp-медиирана MDR може да бъде свързано с целенасочен ефект върху плазмената мембрана на резистентни клетки. Pgp не предпазва клетките от нарушаване на целостта на плазмената мембрана - некроза.

Научно познание

1. За първи път е обоснована идеята за формирането на MDR като спешен клетъчен отговор на екзогенен стимул;

2. За първи път подробно е изследван механизмът на развитие на специфичен фенотип на лекарствена резистентност, P£p-медииран MDR: епигенетично активиране на MYR 1 гена, кодиращ този протеин.

3. За първи път е разработен модел на спешно активиране на MHS гена,

придружено от придобиване на стабилен фенотип на Pgp-медииран MDR в култивирани човешки туморни клетки; 1. Идентифицирани са пътища на сигнална трансдукция, механизми на активиране на транскрипция и пост-транскрипционна регулация на гена MOK 1 в клетки, изложени на антитуморни лекарства. 5. За първи път класове фармакологични вещества - блокери на вътреклетъчното предаване на сигнала - са характеризирани за предотвратяване на образуването на RCR-медиирана MDR в туморни клетки. 5. За първи път са изследвани механизмите на смърт, действащи в клетки с PgP-медиирана MDR, и е разработен подход за преодоляване на резистентността, който включва първично увреждане на целостта на плазмената мембрана.

Практическа стойност.

1. Разработване на методи за предотвратяване на спешното развитие на Pgp-медиирана MDR в култивирани туморни клетки, когато са изложени на химиотерапевтични лекарства.

2. Предклинични изпитвания на модифицирани генетично модифицирани ваксини за преодоляване на MDR.

Апробация на работата.

Дисертацията беше обсъдена на 30 юни 2003 г. на съвместна конференция на отделите по генетика на туморни клетки, цитогенетика с групата по молекулярна генетика, вирусни и клетъчни онкогени, молекулярна ендокринология, противотуморен имунитет, биохимична фармакология, медицински изследвания, експериментална диагностика и биотерапия на тумори; Катедри по шмунология, хематология, химиотерапия, клинична фармакология, съвременни методи на лечение на Руския център за изследване на рака, кръстен на. Н.Н.Блохша RAMS.

Основните материали на дисертацията са представени на следните конференции: 2-ри международен симпозиум "Cylostatic Drug Resistance", (K Германия, 1991); Gordon Conference "Advances in Chemotherapy" (Ню Йорк, Лондон, САЩ, 1994); "Молекулярна токсикология" (Copper Mountain, САЩ, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, USA, 1996); "Nucleic Acids - Integrating Molecular Diagnostics and Therapy" (Сан Диего, САЩ, 1996); годишни конференции на Американската асоциация за изследване на рака (1994-2001): 6-ти и 7-ми конгреси "Напредък в онкологията", (Херсонисос, Гърция, 2001,2002); "Структурата и функциите на клетъчното ядро" (Санкт Петербург, 2002), както и на семинари в Oncotech, Inc. (Irvine, САЩ, 1996), Salk Institute (LaJolla, САЩ, 1997), Lee Moffitt Cancer Center (Тампа, САЩ, 1997), The Jackson Laborati (Bar Harbor, САЩ, 1997), Sloan-Kettgering Cancer Center, New Yo ] САЩ, 1999), университетите в Копенхаген (2002), Инсбрук (2002) и Гронингс! (2003), Московски държавен университет. М. В. Ломоносов (2002 г.), Изследователски институт по експериментална патология, онкология и радиобиология, кръстен на. R.E. Kavetsky (Киев, 2002).

Публикации.

Структура и обхват на дисертационния труд.

Дисертационният труд е представен на 181 страници машинопис и се състои от увод на главите „Обзор на литературата“, „Материали и методи на изследване“, „Резултати от изследването“ (две части), дискусия и заключения. Работата съдържа 44 фигури и 6 таблици. Библиографският материал включва връзки към 270 литературни източника.

Материали и методи на изследване.

Лабораторни животни и клетъчни линии. Използвани са Balb/c мишки. За експерименти върху MDR активиране използвахме човешки клетъчни линии H9 (Т-клетъчна левкемия), K562 (промиелоцитна левкемия), SW<

(рак на дебелото черво), както и сублиниго K562Í/S9, в който Pgp се експресира без селекция на клетки за резистентност към токсини (Mechetner et al., 1997). За експерименти за създаване на противотуморен имунитет са използвани миеломни линии MPC11, J558 и S194. За да се получат сублинии с MDR, беше извършена поетапна селекция на MPC11 клетки за резистентност към доксорубицин. Независимите MPC1 подразделения lDoxlO-1 и MPCllDoxlO-2 пролиферират в присъствието на 100 nM доксорубинова киселина.

MDR изследване: MDRI ген РНК, Pgp количество и функция.

За активиране на MDR използвахме лигозин-1Р-арабинофуранозид (цитозар, Ara C), доксорубицин, винкристин, нокодазол, блсомицин, сфингомиелиназа, Ca2+ йонофор A23187, тапсигаргин, 2-дезоксиглюкоза, трихостатин А и форболов естер 12-0-тетрадеканоилми ristate 13 -ацетат (TFA). За инхибиране на активирането на MDR, актиномицин D, α-аманитин, ектеинасцидин 743 (ET743), хелеритрин, бис-индолилмалеимид I, калфостин С, BARTA/AM, TMB-8, пиролидиндиптиокарбамат (PDTC), тозил-L-фенилхлорометил кетон ( TPCMK), натриев салицилат, салицилова киселина, PD98095. Инхибиторите се добавят към клетките за 30 минути. преди да добавите активатори. Нивото на MDR\mRNA в клетките се изследва чрез полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (PCR) (Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000), като се използват праймери: MDRV. прав: 5"-ССС ATS ATT GCA ATA GCA GG-3"; реверс: 5"-GTT CAA ACT TCT GCT SCT GA-3". Дължина на продукта 167 bp. p2-микроглобулин: директен: 5"-ASS CCC ACT GAA AAA GAT GA-3"; реверс: 5"-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3". Дължина на продукта 120 bp.

Количеството на Pgp и неговата транспортна функция се определят чрез поточна цитометрия с монополно антитяло UIC2 (Mechetner et al., 1997). Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-конюгирани анти-миши IgG антитела бяха използвани като вторични антитела. За преподаване на Pgp-

зависим транспорт, използвани са флуоресцентни субстрати Pgp-родамин 123 (в експерименти за индукция на MDR) (Neyfakh, 1988) и калцеин ацетоксиметилов естер (в експерименти с миеломни клетки) (Holló et al., 1996; Shtü et al., 1999).

Тест за клетъчна смърт. Клетъчното оцеляване в присъствието на токсини е изследвано чрез редукция на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сулфофенил)-2Р-тетразолий (MTT тест) (Mossman, 1983; Сидорова и др., 2002). Използвани са V-FITC анексии за определяне на броя на апоптотичните клетки; некротичните клетки бяха открити с пропидиев йодид (PI). Трансмембранният електрически потенциал на митохондриите се определя от флуоресценцията на сондата JC-1 (Zamzair et al., 1997). За да се определи фрагментацията на геномна ДНК, клетките се лизират в буфер, съдържащ натриев цитрат, NP-40, РНКаза А и PI; суспензията беше анализирана на поточен цитометър (Shtil et al., 1999; Фрагментирана ДНК беше открита в суб-Gl региона. За изследване на образуването на свободни форми на кислород в клетките беше използван дихлорофлуоресцеин диацетат естер (DCFDA), който прониква цитоплазмата и флуоресцира след окисление от вътреклетъчни метаболити.

РКС активността в цитозола и фракциите на частиците се определя чрез радиоактивен метод чрез фосфорилиране на миелинов основен протеин след клетъчен лизис и разделяне на фракциите чрез центрофугиране (Shtil et al. 2000).

Активността на митоген-активирани протеин кинази ERK1/2 и JNK1 се определя чрез фосфорилиране на специфични субстрати (миелинов основен протеин и c-Jun) след клетъчен лизис и имунопреципитация на киназите (et al., 1996).

Репортерни плазмиди, експресионни вектори, трансфекция.

K562 и B\Y620 клетки бяха трифектирани с плазмид, носещ област от троксималния промотор на MOL 1 гена -1202/+118 nt. по отношение на началния сайт на транскрипция, клониран във вектора pOB2b. Репортерният протеин беше Pge/1y луцифераза. За да се тества наивността на трансактивиране на NaκB, клетките бяха трифектирани с конструкция промотор-репортер, съдържаща места на свързване за OTkB (5xNκB-lgocyferase). За да се потисне луциферазната активност, клетките се инжектират едновременно със сакмид, носещ Rental луциферазата под контрола на SIV40 промотора. В някои експерименти активността на луциферазата Pne]\y е свързана с концентрацията на общия SEL в трансфектираните клетки. За трансфекция използвахме Spofeknsh или Lipofectamine, както и "генната пушка" (за миеломни клетки) Nabillevich et al., 1996).Вектори, експресиращи p50 и p65 IkB субединиците под контрола на BU40 промотора, бяха използвани за котрансфекция с паразитът - 1202/+118-луцифераза. Активността на луциферазите в клетка 1 клетки е изследвана чрез химио-поминесцентния метод.

Имунизация на мишки. MPC11 клетки и MDR сублинии бяха облъчени (40 ur), трифектирани с плазмид, носещ сДНК на гранулоцитно-макрофаг-стимулиращ солеността фактор (GM-CSF) и инжектирани подкожно в мишки (1.5 х 105 години на животно). Контролните мишки бяха инжектирани със същия брой облъчени клетки, трансфектирани с вектора без вмъкване. След 7 дни пресни клетки бяха облъчени и трифектирани с плазмид, носещ ДНК на интерлевкин-12 (IL-12) или облъчени клетки, трансфектирани с хазмид без вмъкване (контрола). След още 7 дни (общо 14 дни след първата ваксинация), животните се инокулират със свежи клетки подкожно (10-та на седмица) (Tisher et al., 1998).

CTL активност в смесена култура с миеломни клетки. Далаците бяха отстранени 11 дни след инжектиране на IL-2-трансфектирани миеломни клетки в мишки. Спленоцитите се култивират в продължение на 5 дни при 37°C, 5%

COg с пресни облъчени клетки от линията, използвана за имунизация. Пресни миеломни клетки след това се зареждат с 51Cr (CTL целеви клетки). CTL активността се оценява чрез освобождаването на mSG в средата след инкубиране с мишени. За да се инхибира обработката на перфорин, спленоцитите се инкубират с конканамицин А и след това с мишени (Kataok et al., 1996).

Резултати от изследванията

Спешно активиране на Pgp-медиирана MDR.

MDRI иРНК се натрупва в клетките в отговор на антитуморни лекарства (Chaudhary and Roninson, 1993). За да се изясни дали този ефект е свързан със селекцията на Pgp-положителни клетки или с индуцирането на MDR, бяха проведени експерименти върху MES/Pgp-отрицателни H9 клетки. Клетките бяха третирани с Ara C, не-Pgp транспортирано лекарство, използвано при пациенти с рак на гърдата и хематологични злокачествени заболявания. Експресия на MDR\ в нетретирани клетки не се открива след 25 цикъла на PCR, докато в Ara C-третирани клетки се наблюдава увеличение на MDRI mRNA след 3-6 часа. въздействие (фиг. 1, А). Увеличаване на MDRI иРНК може да се наблюдава още по-бързо - само след 1 час експозиция, ако концентрацията на цитозара се увеличи до 75 µM. Увеличаването на MDRI иРНК продължава в клетки, които преживяват еднократно излагане на Ara C за най-малко 6 седмици.

След това проверихме дали количеството на Pgp се увеличава успоредно с натрупването на MDRI иРНК. На фиг. Фигура 1В показва, че третирани с Ara C клетки експресират Pgp. Важно е, че излагането на Ara C причинява изместване вдясно на цялата популация, което показва, че почти всяка клетка в културата е способна да натрупва Pgp. Третираните с Ara C клетки експресират функционално активен Pgp: в тези клетки елиминиране

родамин 123 е по-мощен, отколкото в непокътнати клетки; ефектът се отстранява от верапамил, блокер на Pgp-зависим транспорт.

O 1 3 6 10 16 24 ЧАСА.

флуоресценция (Ig) -

Фиг. 1. Увеличаване на MDRX и Pgp mRNA след еднократно излагане на Ara C. A: H9 клетки, третирани с 10 μM Ara C. MDR1 и p2-микроглобулин (B2M) mRNA се определят чрез PCR след обратна транскрипция. B: клетки, третирани с 10 µM Ara C за 24 часа (бр<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых

аси експозиция на агент, който не се транспортира от Pgp. Означава, че

Най-вероятният механизъм за този ефект е индуцирането на фенотип

не подбор на „съществуващи“ резистентни клетки.

На фиг. Фигура 2 показва зависимостта на клетъчното оцеляване от концентрацията на винкристин, химиотерапевтично лекарство, транспортирано от Pgp. Клетки, които са оцелели

Ориз. 2. Еднократно излагане на cptozar води до образуването на стабилно Pgp-транспортирано лекарство.

Н9 клетките се третират с 10 цМ Ara C за 24 часа, ресуспендират се в свежа среда и се инкубират за 12 дни. След възстановяване на логаритмичния растеж на клетките, тяхната чувствителност към винкристин е изследвана в сравнение с клетки, които не са третирани с цитозар (контрола). Резултати от 4 експеримента (MTT тест)

По този начин еднократното излагане на Pgp-отрицателни клетки на не-Pgp-транспортирано химиотерапевтично лекарство води до бързо - в рамките на един клетъчен цикъл - натрупване на иРНК на MDRI гена, функционално компетентен Pgp и, най-важното, развитие на резистентност към Pgp-транспортиран агент Първично чувствителните клетки придобиват Pgp-медииран MDR. Механизмът на това явление не е селекцията на Pgp-положителни клетки, а активирането на de novo фенотипа. Как възниква Pgp-медиирано образуване? MDR: поради активиране на MDRX генна транскрипция или стабилизиране на иРНК, функционират ли и двата механизма?

В експериментите, представени на Фиг. 3, Н9 клетките бяха третирани с Ara C в присъствие! инхибитори на транскрипцията - актиномицин D, a-аманитин и ектеинасцидин 743 (ET743). Всички тествани инхибитори предотвратяват Ara C-индуцираното повишаване на нивата на MDRI mRNA.

Ориз. 3. Инхибиторите на транскрипцията предотвратяват натрупването на MDR1 РНК. H9 клетките бяха третирани с 10 цМ Ara C в продължение на 24 часа. без или в присъствието на актиномицин D, α-аманитин или ET743. Резултатите от 3 експеримента са обобщени.

За да се изследва полуживотът (стабилността) на иРНК, клетките се третират с Ara C в продължение на 10 часа. и се прехвърлят в свежа среда или среда с актиномицин D и се инкубират за още 36 часа. В нетретираните клетки MDRI mRNA се оказа краткотрайна: нейният полуживот беше ~ 30 минути. Третирането с Ara C удължава полуживота на иРНК до 6 часа. По този начин, натрупването на MDRI mRNA и, следователно, развитието на Pgp-медиирана MDR в отговор на цитотоксичен стрес, се причинява не само от активирането на MDR1 транскрипцията, но също и от стабилизирането на mRNA на този ген.

Механизми на вътреклетъчно предаване на сигнала при активиране на MDR Фигура 4 показва, че еднократно третиране на H9 клетки с TFA, PKC агонист, води до индукция на MDRI гена. Специфични PKC инхибитори - хелеритрин, калфостин С и бис-индолилмалеимид I - предотвратяват активирането на MDR от форболов естер и химиотерапия. Подобен

Данните са получени върху клетки K562, третирани с Ara C, доксорубицин или TFA в присъствието на посочените PKC инхибитори.

Ориз. 4. PKC инхибиторите предотвратяват индукцията на MDRI. H9 клетките бяха третирани с 10 цМ Ara C в продължение на 16 часа. без или в присъствието на PKC инхибитори. Резултатите от 3 експеримента са обобщени.

В обобщение, PKC е важен за регулирането на MDRI (и следователно MJI фенотипа; този ген може да бъде индуциран от PKC агонист, а PKC инхибиторите предотвратяват активирането на MDRI от противоракови лекарства.

Физиологичният агонист на PKC е диацилглицерол (DAT), който се образува по време на хидролизата на фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (PIg) от фосфатидилинозитол-специфична фосфолипаза С и/или по време на разграждането на фосфатидилхолин под действието на фосфолипаза С, специфична за този фосфолипид (Berridge, Irvine, 1984). Активирането на MDRI, индуцирано от Ara C или доксорубицин, може да бъде блокирано от неомицин сулфат и U73122, инхибитори на фосфатидилинозитол-специфичната фосфолипаза С (фиг. 5). Активирането на MDRI от форболов естер е нечувствително към неомицин сулфат и U73122, тъй като TFA е директен PKC агонист и тази киназа функционира дистално спрямо фосфолипаза С. Инхибиране на фосфатидилхолин-специфично

Юсфолипаза С (лекарство В609) не води до промени в експресията на MYR 1 Фиг. 5). Тези резултати показват важността на хидролизата на PI2 на специфичния за юсфатидилиносенгол фосфолипазон С при активирането на MYA 1.

Ориз. 5. Инхибитори на фосфолипаза С при индукция на MDR\.

H9 клетките бяха третирани с 10 цМ Ara C в продължение на 16 часа. без или в присъствието на неомицин сулфат, U73122 или D609. Резултатите от 3 експеримента са обобщени.

Фосфолипаза С разгражда PI2 на DAT и FI. Първият продукт активира PKC, вторият повишава нивото на вътреклетъчния Ca2+ поради мобилизирането му от ектоплазмения ретикулум. Ролята на вътреклетъчния Ca2+ в индуцирането на MDRI се доказва от способността на Ca2+-специфичния йонофор A23187 и тапсигаргин, Ca2+-ATPase инхибитор, да активират този ген; специфичният Ca2+ хелатор BARTA/AM предотвратява индуцирането на MDR\ както от химиотерапия, така и от TFA (фиг. 6).

1 2 3 4 5 в 7 8 E 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Rns. b. Ролята на вътреклетъчния Ca2+ в индукцията на A) R1.

Н9 клетки бяха третирани с MOI индуктори в продължение на 16 часа. самостоятелно или в присъствието на калциев хелатор BARTA/AM. Следи: 1-нетретирани клетки, 2,3-A23187; 4.5-

тапсигаргин; 6,7-AgaC; 8,9-доксорубицин; 10,11-блеомицин; 12,13-2-дезокси-глюкоза; 14,15-нокодазол; 16,17-сфингомиелиназа; 18,19-TFA. Четни следи: индуктор нечетен (с изключение на 1): индуктор -5 µM VARTA/AM.

За да се изясни участието на интра- и извънклетъчния Ca2+ в активирането на MDR, бяха проведени две серии от експерименти. Първо се изследва генното активиране при условия на клетъчна инкубация в среда без Са2+. Отстраняването на извънклетъчния Ca2+ не нарушава активирането на MDRI чрез химиотерапия и TFA. Второ, агентът TMB-8, който предотвратява навлизането на Ca2+ в клетките и не променя концентрацията на вътреклетъчния Ca2+, не повлиява индукцията на MDRI. Следователно, вътреклетъчен, но не извънклетъчен калций е необходим за активиране на MDRX. Горните експерименти доказват фундаменталната роля на фосфолипазата C->DAG-*PKS и PI3->Ca2+ сигналните пътища при активирането на MDRX гена от различни вещества, включително химиотерапия.

PKC обаче не е универсален механизъм за активиране на MDR. Активността на PKC варира в клетките, третирани с отделни MDRX индуктори. T< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).

" Таблица 1. Ефекти на MDRI генни индуктори върху активността на PKC.

Лечение PKC активност, pmol/mg протеин/мин.

фракция на цитозолните частици

Контрола 119±13 59+9

TFA, YuONM 47+10* 153+14*

Ara C, 25 цМ 143+16 65+10

Керамид, 1 µM 138+15 27+8*

Керамид, YumkM 83+15* 15+7*

*Р<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.

PKC инхибиторите хелеригрин и бис-индол-малеимид I предотвратяват активирането на MDR\Ara C, доцеорубицин и TFA, но не и церамид (фиг. 7). Следователно, активирането на PKC не е предпоставка за индукцията на MDRX гена. Някои агенти (напр. ceramvd) активират AKC-независими сигнални механизми или действат дистално спрямо AKC.

Ориз. 7. Ceramnd активира MDR\ независимо от намесата на ACL.

H9 клетките бяха третирани с 25 цМ С2-церамид за 24 часа. самостоятелно или в присъствието на PKC инхибитори. Контролът на ефективността на инхибиторите е тяхното блокиране на активирането на MDR при излагане на 10 µM цитозар.

Такива механгами могат да бъдат митоген-активирани протеин кинази. Доксорубицин и Ara C в концентрации, които активират MDR\ повишават активността на JNK1, но не и ERK1/2, докато TFA активира ERK1/2, но активността на JNK1 не се променя (фиг. 8). В съответствие с тези данни, инхибиторът ERKI/2 PD98059 премахва активирането на MDRI от TFA, но не и от химиотерапия. По този начин митоген-активираните протеин кинази служат като ниво на дивергенция на MDR1-активиращите сигнали, генерирани от различни вещества.

Активиране на MAP кинази от доксорубицин и TPA

Ориз. 8. Диференциално активиране на MAP кинази от MDR1 индуктори. H9 клетки бяха третирани с доксорубицин и TFA. Активностите на ERK1/2 и JNK1 се определят след имунопреципитация и фосфорилиране на субстрати. Ефектите на индукторите се изразяват като ниво на активиране на всяка киназа в сравнение с нетретирани клетки, в които активността е зададена на 1. Данните от 3 експеримента се сумират.

Транскрипционният фактор NFkB е механизъм за бърз отговор на клетките към външни стимули (Karin, 1995). В клетка в покой този протеин се намира в цитоплазмата в комплекс с инхибиторната субединица; в отговор на експозиция, NFkB се дисоциира от комплекса, транспортира се в ядрото и активира генните регулаторни области, които имат NFkB свързващи места. NFkB инхибиторите PDTC, TPCMC и салицилатите предотвратяват активирането на MDRX от цитозар, доксорубицин и TFA (фиг. 9). Особено важно е, че салицилап, широко използвано в клиниката лекарство, се оказва ефективен блокер на спешното активиране на MDRI. Освен това, натриевият салицилат анулира дългосрочното (до 7 дни) активиране на MDRX от цитозар (фиг. 10), потвърждавайки; значението на NFkB като механизъм за активиране на MDR.

Ориз. 9. Предотвратяване на индукция на MDR1 от NFkB инхибитори. H9 клетките бяха третирани с 10 μM Ara C, 5 μM доксорубицин или 10 nM TFA за 16 часа. самостоятелно или в присъствието на инхибитори на NFkB активирането. Обобщени са резултатите от 4 експеримента.

4, измийте

L ha S - + +----

салицилат - - + \ s 5 7

дни без АГАС

Ориз. 10. Дългосрочен ефект на натриев салцинлат като инхибитор на индукцията на MDRI.

Н9 клетките бяха третирани с 10 цМ Ara C в продължение на 48 часа. самостоятелно или в присъствието на натриев салицилат, ресуспендирани в свежа среда и инкубирани за още 1-7 дни.

Важността на установяването на ролята на NκB е и във факта, че този механизъм "обединява" цитоплазмени и ядрени събития в активирането на гена MYR 1. Тази връзка се потвърждава от експерименти за активиране на генния промотор; AYUSH екзогенен No.kV. Котрансфекцията на OTkV субединици р50 и р65 води до активиране на региона -1202/+118 nt. промотор AYUSH (фиг. 11). Въпреки това, в посочения регион, каноничната последователност 5"-COOIM^YUSS-3" (R-всяка пуринова база, aL-всяка пиримидинова основа) за взаимодействие с NaκB или хомоложни последователности не беше открита. Възможни са следните предположения: 1) NokV взаимодейства с все още неидентифицирана последователност в областта -1202/+118 i.i.; 2) NkB активира междинен ген (гени), чийто продукт се свързва с региона -1202/+118 nt. и индуцира MDR1 промотора.

Ориз. 11. NFkB - активатор на MDR промотора.

К562 клетки бяха трансфектирани с посочените конструкции и плазмид, носещ Renilla luciferase rei под SV40 промотора. Активност на луцифераза на светулка, отразяваща индукция на -1202/+118 nt регион на MDRX промотора (означен като MDF, нормализиран към луциферазна активност на Renilla.

Регулиране на MDR1 генния промотор.

Пътищата за предаване на L1-активиращи сигнали трябва да имат обща "точка на конвергенция" - регулаторната област на гена и иРНК. За да изследваме промотора на MDRI, използвахме лекарства, които модулират физикохимичното състояние на хроматина - инхибитори на хистон деацетилаза трихостатин А и натриев бутират, представители на класове химиотерапевтични лекарства, които директно регулират генната транскрипция. Важно е да се сравни механизмът на активиране на MDR от тези агенти с Ara C и доксорубицин, лекарства, за които хроматинът не е директна мишена. Трихостатин А и натриев бутират активират ендогенния MDRX ген в клетки H9, K562 и SW620. Увеличаването на иРНК (фиг. 12, ляв панел) беше придружено от активиране на луцифераза, транскрибирана от -1202M18 nt място. MDRI промотор (фиг. 12, десен панел).

Ориз. 12. Инхибиторите на хистон деацетилаза индуцират ендогенния MDRX ген и промотор (преходна трансфекция).

Slash, H9, K562 и SW620 клетки бяха третирани с посочените лекарства в продължение на 24 часа. Нивото на MDRX иРНК е изследвано в GTCR. Вдясно: К562 клетките бяха трансфектирани с -1202/+P8 n.o.-луциферазен конструкт. След 24 часа. клетките бяха стимулирани с посочените лекарства в продължение на 16 часа. Представени са резултатите от 3 експеримента.

Установено е, че трихостатин А и бутиратът активират MDRI поради взаимодействието на транскрипционния фактор NF-Y с обърнатата HAAT кутия (Jin and Scolto, 1998), което потвърждава веригата от събития „модификация индуктор-хроматин -> активиране на промоутърът на MDRI. Въпреки това, при условията на коланна трансфекция, хроматинът на плазмида остава „несъвършен“.

За да се изследва ролята на хроматина в индукцията на MDRI, SW620 клетките бяха трансфектирани с -1202/+118 nt луциферазен конструкт на светулка и плазмид, носещ neo гена; след това клетките бяха избрани за оцеляване в присъствието на неомицин. В селектанти, както и по време на временна трансфекция, трихостатин А и натриев бутират причиняват натрупването на ендогенна MDRI иРНК и индуцират транскрипция от областта -1202/+118 i.i. промотор на този ген. Активирането на MDRI от инхибитори на хистон деацетилаза беше премахнато от ET743, блокер на транскрипция. Това показва пряка връзка между увеличаването на количеството на MDRI иРНК и активирането на промотора на този ген чрез ацетилиране на хроматин.

Тези данни са получени, когато клетките са били изложени на агенти, които директно променят физикохимичното състояние на хроматина. Механизмът винаги ли е идентифициран, тъй като не всички химиотерапевтични лекарства (и други екзогенни стимули) са директни регулатори на хроматина? Отбелязахме, че полуживотът: MDRI иРНК се увеличава в клетки, третирани с Ara C и TFA. Фигура 1 показва, че TFA и трихостатин А са мощни индуктори на MDRI промоторна активност (транскрипция), докато нито Ara C, нито доксорубицин, нито церамид активират промотора или причиняват само слаб ефект.

Ориз. 13. Ефекти на MDR активаторите върху индукцията на MDRI промотор. К562 клетки бяха трансфектирани с -1202/+118 nt луциферазен конструкт на светулка, разделени на равни части и стимулирани в продължение на 16 часа. посочените лекарства.

Луциферазната активност в нетретирани клетки, нормализирана към общото протеиново съдържание в клетъчните лизати, беше настроена на 1. Резултатите бяха възпроизведени в 3 експеримента.

Тези резултати предполагат, че повишаване на нивото на A/III1 mRNA възниква както в резултат на активиране на транскрипция (TFA, трихостатин А), така и без директна индукция на промотора (цитозар, доксорубицин, керамид). В последния случай трябва да се разпознаят или механизмите на стабилизиране на иРНК, или активирането на междинен ген, чийто продукт индуцира MIEX промотора или стабилизира транскрипта (вижте експерименти с екзогенен NaκB).

Таблица 2. Инхибитори на сигнални механизми, които предотвратяват спешното активиране на MF1 гена tsntozprom.

Лекарство Вътреклетъчна мишена Инхибиторна концентрация

хелеритрин PKS 10 µM

калфостин S PKS 1 µM

бис-индолил-

малеимид I PKS 5 цМ

VARTA/AM Ca2+ 5 µM

PDTK No.kV 5 µM

GFKhMK No.kV 25 µM

натриев салицилат No.kV 20 mM

ютирин №kV 10 mM

Ziesters висш плазмен

мембрана на мастни киселини? Yumkg/ml

1КТШГОМИШШ Б удължаване на препис? 500-1000 ng/ml

х-аманитин РНК полимераза II 9 μg/ml

zhgeinascischsh 743 не е инсталиран 100 nM

Таблица 2 показва фармакологични лекарства, представляващи групи от инхибитори на сигналната трансдукция, които предотвратяват активирането на MDR от цигосар или доксорубицин в клетки на левкемия H9 и K562.

Преодоляване на Pgp-медиирана MDR: мишена на плазмената мембрана

цитотоксично действие.

По този начин, Pgp-медиираната MDR може да се образува доста бързо по време на едно клетъчно делене и да персистира в поколения оцелели клетки. Много стимули са индуктори на MDR, включително клиничната употреба на противотуморни лекарства от различни химични групи. Pgp е отличителният белег на механизмите, които предотвратяват активирането на програмираната смърт (апопто) (Johnstone et al., 1999). Следователно, тумор, който е предимно резистентен на апоптогенни стимули и бързо придобива MDR в отговор на лечението, представлява особено предизвикателство за терапията Какви са стратегиите за преодоляване на многофакторната съпротива?

Изследвана е смъртта на такива клетки под въздействието на имунни ефектори. Предпоставката за този подход бяха данните за отхвърлянето на ваксиниран миелом от спленоцити, които се натрупват по време на ваксинацията на мишки; същият тумор, модифициран да експресира цитокини (Turner et al., 1996). Тъй като свойствата на сублиниите MPC1 IDoxlO-1 и MPC1 1Dox10-2 се оказаха подобни, клетките MPCllDoxlO-1 са анализирани по-долу.

Фенотипът на MDR в селектантите се характеризира със свръхекспресия на гена mdrVo, намален транспорт на калцеин и резистентност към доксорубицин и винкристин, Pgp субстрати. За да се създаде имунитет към инокулация с миелол, MPC11 и MPCI IDox10-1 клетки бяха трансфектирани с кДНК на GM-KS IL-12 цитокините. Броят на инокулираните клетки е пет пъти по-висок от минималната 100% унищожаваща тумора доза.

Таблица 3. Проценти на отхвърляне на тумора при контрола и

имунизирани животни.

Присаждане на мишки

MPC11 MPCllDoxlO-1

Непокътнати 0/15* 0/10

Имунизация с MPC11 клетки:

облъчени клетки 1/15 0/10

■M-CSF/IL-12-трансфектирани клетки 15/15** 9/10**

Имунизация с MPC1 Xox10-1 клетки:

облъчени клетки 0/15 0/10

"M-CSF/IL-12-трансфектирани клетки 9/10** 10/10**

Процент на отхвърляне на тумора: в числителя - броят на мишките, които не са развили тумор; при 1 замяна - общият брой ваксинирани мишки, **P<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.

Таблица 3 показва, че клетките MPC11 и MPC1 IDoxIO са тумор-продуциращи: при 100% от неимунизираните животни туморите се появяват 8-10 дни след инокулирането на съответните клетки. Въпреки това, при мишки, имунизирани с цитокин-експресиращи клетки, тумори не се появяват (ваксиниране с MPC11) или са редки (ваксиниране с резистентна сублиния). Антитуморният имунитет е дълготраен: туморите не се появяват в рамките на 5 седмици след инокулацията на свежи клетки. Честотата на отхвърляне на присадката е подобна между групите, имунизирани с MPC 11 клетки и резистентната сублиния. Тези резултати показват възможността за смърт на злокачествени резистентни клетки, когато са изложени на фактор(и), открит(и) в in vivo експерименти.

Такъв фактор са CTLs, генерирани в далака в отговор на имунизация с цитолитично експресиращи клетки. На фиг. Фигура 14 показва, че спленоцити от мишки, имунизирани с GM-CSF- и IL-12-експресиращи MPC 11 клетки, лизират MPC 11 и MPCllDoxlO-1 прицелни клетки с почти идентична ефективност (Фигура 14).

-ér-MPCU/MPCJlDoilO

MRS11/MRSI

ефектор.цел

Ориз. 14. CTL лизис на родителски и Pgp-положителни клетки.

Числител: клетки за имунизация, знаменател: клетки за присаждане.

Следователно, антитуморният имунитет при животни, ваксинирани с цитокин-експресираща клетъчна ваксина, е свързан с чувствителността на MDR клетките към логичното действие на CTL.

Убиващата активност на CTLs се дължи на секрецията от тези клетки на лиганда CD95/Fas и/или тандем гранзим В-перфорин (Vetke, 1994). За да се разреши въпросът кой от тези механизми функционира в изследваната система, клетъчното оцеляване беше изследвано в присъствието на лиганда Fas.Клетките MPC11 и MPC1 ShoxY-1 се оказаха устойчиви дори на относително високи концентрации на лиганда Fas. По този начин гранзим B/перфорин трябва да се счита за кандидат механизъм за цитотоксичното действие на имунните UTJ. Наистина, предварителната инкубация на имуно-CTL с конканамицин А, инхибитор на обработката на перфорин, намалява лизиса на целевите клетки MPCllDoxl 0-1 (фиг. 15).

За да се намерят начини за преодоляване на MDR, е важно сублиниите с MJB да запазят чувствителността към цитотоксични ефекти поради нарушаване на целостта на плазмената мембрана от перфорин. Проникването на гранзим В в клетката през порите в плазмената мембрана, образувана от перфорин, ще доведе до активиране на ефегрин каспази. Дакел

killer tandem - едновременното действие на агент, който образува пори във външната мембрана и протеаза - позволява да се причини смъртта на клетки, които са устойчиви на редица външни влияния. Следователно плазмената мембрана е важна цел за терапия, насочена към елиминиране на резистентни клетки.

T; с k) o o o

n (o n ii) o o

ефектор: цел

Ориз. 15. Granznm B/psrforin - механизъм на CTL-медиирана смърт. Конканамицин А (отворени ленти) намалява CTL-медиирания лизис на MPC1 XoxI-1 клетки. Тъмните колони показват лизис на CTL мишени без предварителна инкубация с конканамицин А. Показан е един от 3 представителни експеримента.

Zerschied и свободните кислородни радикали за преодоляване на MDR. Ако плазмената мембрана е желаната цел, тогава как да причиним нейното увреждане? Особено желателно е такъв ефект да бъде упражнен от актьор, общ за много противоракови лекарства. Един от тези „посредници“ е ceramvd. За да бъде керамидът ефективен за треодолизация на MDR, той трябва да отговаря на поне две изисквания: ;) да не се транспортира извън клетката от Pgp; 2) задействат пътища на смърт, които функционират в резистентни клетки. Достатъчно ли е да се „заобиколи” мембранният транспортер, водещият механизъм на MDR, за да се предизвика смъртта на клетките, които са устойчиви на редица влияния?

Церамидът не се транспортира от P-gpicoprotein.

Тъй като церамидът се натрупва в отговор на различни химиотерапевтични лекарства, ние проверихме дали този метаболит отговаря на тези условия. Оказа се, че кинетиката на натрупване на церамид в родителските K562 клетки и тяхната Pgp-позитивна сублиния K5621/89 е почти еднаква (фиг. 16). В същото време клетките K562^B9 натрупват значително по-малко родамин 123 от клетките K562 (контрол на Pgp-медиирания транспорт). Следователно, керамидът не е транспортен субстрат за Pgp.

8000 6000 4000 2000 0

0 0,05 0,2 1 5 C5-BOO!RU-церамид

Ориз. 16. Pgp не транспортира късоверижен керамид. К562 и К5621/59 клетки се инкубират в продължение на 30 минути. с C5-церамид, конюгиран с флуорохром VSY1RU (горен панел) или родамин (III)123 (долен панел). Клетъчната луминесценция се изследва с помощта на поточна цитометрия. Данни от 3 експеримента.

Няма разлики в цитотоксичността на синтетичните (C2) и естествените (Ci) керамиди за K562 и K5621/89 клетки, както и за двойки

родителски клетки и селектанти: MCP-7 и MCP-7Ac1g, KV-3-1 и KV-8-5-11. По този начин керамидът причинява смъртта на Pgp-отрицателни и Pgp-положителни клетки с еднаква ефективност.

не предотвратява нарушаването на целостта на плазмената мембрана.

За да се идентифицират механизмите на смъртта на клетки K5621/59 под въздействието на керамид, бяха изследвани следните параметри: активиране на каспази 9 и 3, разцепване на поли-ADP-рибоза полимераза (PAKR), междунуклеозомно разграждане на ДНК, интрамембранна транслокация на фосфатидилсерин (чрез свързване на анексин V), трансмембранен електрически митохондриален потенциал и интегритет на плазмената мембрана (чрез инкорпориране на PI в клетките). На фиг. 17 показва, че до 24ч. излагане на керамид, процентът на умиращите клетки достига 37+4%. Особено важно е появата на "двойно положителни" (анексин-PI4) клетки, което означава, че в клетките K562LB9 керамидът доста рано причинява нарушаване на пропускливостта на плазмената мембрана (некроза или късна апоптоза). В същото време не е открито активиране на каспаза 3, характерно за класическата апоптоза; PAS протеолизата се оказа късно събитие (48 часа експозиция).

Ефектът на керамида върху клетките K5621/B9 практически не е придружен от промяна в трансмембранния потенциал на митохондриите: този показател в умиращите клетки не се различава от съответната стойност за нетретирани клетки. Междунуклеозомната фрагментация на ДНК също не е водещ признак за смърт: само около 11% от събитията са настъпили в областта под-01 (хиподиплоидни клетки), докато процентът на умиращите клетки (сума от анексин+/PI, анексин7PI+ и двойно положителни) при същата продължителност на експозицията е 64 + 4%.Така най-важният признак за смърт на клетки K562LB9 под въздействието на керамид е ранно нарушение на целостта на плазмената мембрана - некроза.

време (часове) с керамид

■ K562, Анексин+ □ K562, Анексин+PI+ BK562i/S9,nH+

IK562.PI+ V K562i/S9,AHHeKCHH+ ■ K562|789,Анексин+PI+

Ориз. 17. Индикатори за смърт на клетки K562 и K562L/S9 под въздействието на керамид. Клетките бяха третирани с 25 μM С2-церамид за посочените периоди от време.Процентът на анексиране на V-позитивни, пропидиев йодид (PI+)-позитивни и „двойно положителни” (анексин + PI+) клетки беше определен чрез поточна цитометрия.

В К562 клетките р53 не функционира и се експресира химерната протеин киназа Br/Ab1, т.е. Тези клетки съдържат молекулярни детерминанти на резистентност към апоптоза. Следователно подлинията K562i/S9 може да се разглежда като модел на плейотропна устойчивост, където Pgp е един от механизмите. Още по-важни са данните за способността на керамида да причинява смърт! на такива клетки по механизма на некроза.

Метаболитите, които могат да причинят некроза, могат да бъдат свободни кислородни радикали. За да се установи тяхната роля в индуцираната от керамид смърт на K562/iS9 клетки, беше изследвана цитотоксичността на керамида в присъствието на N ацетилцистеин (NAC), хелатор на кислородни радикали, и скоростта на образуване на кислородни радикали в клетки, третирани с е изследван керамид. b Фигура 18 показва, че NAC премахва цитотоксичността на керамида. По този начин свободният кислород играе решаваща роля в смъртта на резистентните клетки, когато са изложени на керамид. Фигура 19 показва зависимостта

Луоресценция на клетки, заредени с OCPOA в зависимост от времето на действие на керамида и

„контролен агент – водороден пероксид, донор на O2.“ H2O2 причинява бързо

същото след 20 минути. - повишаване на клетъчната флуоресценция. Причинени от керамид

обратен ефект: след 15 минути. ударът е бил силен - с 1,5

Ред - намаляване на блясъка. Само до 24 часа. интензивност на обработката

клетъчната флуоресценция се върна до нивото на този индикатор в

третирани клетки и се увеличава с 48-72 часа. въздействие, когато сумата

Вече имаше много растящи клетки (фиг. 17). Следователно в преработените

амидните клетки първоначално претърпяват редукция и окисление

настъпва по-късно, вероятно в резултат на изчерпване на ресурсите за възстановяване на едноклетъчните субстрати.

Фиг. 18. NAC блокира клетъчната смърт на K562i/S9. Клетките бяха третирани с Cr-церамид без или с 5 mM NAC. NAC самостоятелно няма ефект върху жизнеспособността на клетките.

Ориз. 19. Окисление в клетки К562|/89 под въздействието на керамид. Клетките бяха третирани с 25 цМ С2-церамид за посочените интервали от време. Вътреклетъчното окисление се изследва чрез промени във флуоресценцията на клетки, натоварени с E>SGOA. H2Og се използва като контрола за „кислородна експлозия“. Резултатите от 3 експеримента са обобщени.

Обсъждане на резултатите

Анализът на механизмите на активиране на гена MOI1 ни позволява да заявим следното: 1) Генът AUM и фенотипът на MDR могат да бъдат индуцирани чрез краткосрочно излагане на клетките на много вещества. Свръхекспресия на MBJ\ и натрупване на Pgp се откриват в клетки, които оцеляват след прекратяване! ксенобиотични ефекти. По този начин епигенетичното активиране на MYR\ гена осигурява стабилен MDR фенотип.

2) Спешното образуване на MDR се регулира от общи клетъчни сигнални механизми. Действително, активирането на фосфолипазите, мобилизирането на вътреклетъчния Са2+, индуцирането на NaκB и каскадите от активирани от стрес протеин кинази са механизми, които осигуряват клетъчния отговор на стреса. В допълнение, транскрипционните фактори и функционално активните места в

ipoMOTope на гена MDR1, важен за активирането на MDR, не е уникален за този ген: ■JF-Y, CCAAT box и хроматин-модулиращите сигнали са важни за регулирането на транскрипцията на повечето еукариотни гени. Това, очевидно, обяснява високата индуцируемост на гена MDRX: този ген се активира от стимули на краката в клетки с различна хистогенеза. На свой ред, регулирането на MDRX чрез общи механизми за прилагане на стрес подчертава ивиологичното значение на активирането на MDR заедно с други реакции на клетката към екзогенни влияния.

3) Множеството и взаимозаменяемостта на механизмите за активиране на MDR shs.20) се определят от многостепенния характер на регулацията на този фенотип. И всяко от тези нива дава възможност на клетката да „избере” дали да активира или не MDR. Първо, изборът се диктува от естеството на стимула (различните субекти действат чрез различни механизми). Второ, специфичният механизъм зависи от наличието на определени сигнални молекули и тяхното взаимодействие в мрежи от този тип.Трето, изборът се извършва на нивото на действителните механизми на записване (състоянието на хроматина в DRI промоторната област).От тези съображения , причините за високата индуцируемост на MDRX (широката взаимозаменяемост и припокриването на сигнални и транскрипционни механизми осигурява индукция от много стимули и в различни типове клетки) и случаите на липса на индукция не се индуцират от всеки стимул и не във всеки експериментален система).

Схемата за спешно активиране на MDRX гена (на примера на цитозар и TFA) е показана на фиг. 20.

Концепцията за индукция на MDRX като забавено събитие, включващо първо активирането на протеини, необходими за индуцирането на toro MDRX, допълнително усложнява картината на епигенетичното активиране на MDR.<ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,

Регулиране на MY1 чрез химиотерапия и TPA

неомицин, 1173122

активиране на транскрипцията, стабилизиране на иРНК

Ориз. 20. Механизми на спешно активиране на гена MY 1.

интензифициране или поддържане на скоростта на транскрипция. Възможността една клетка да избере различни начини за индуциране на MDR – директно (без активиране на междинни гени) и/или медиирано от индукция на други гени – прави още по-трудно предотвратяването на развитието на MDR.

Активиране на транскрипцията на гена L)/? 1 не е единственият механизъм за развитие на MDR. Друг важен компонент на епигенетичната регулация може да бъде стабилизирането на nRNA MOK 1. Възможно е, във връзка с баланса между индукцията на транскрипция и стабилизирането на mRNA MOK 1, механизмите на активиране на MDR под въздействието на различни индуктори и в различни клетки видовете също са различни. Това предположение е в съответствие с концепцията за многостепенна регулация на експресията на MyACh гена (фиг. 19).

4) Целенасочената превенция на MDR е възможна чрез установяване на механизмите на предаване на M)L1-активиращи сигнали. Необходимостта от предотвратяване на развитието на MDR в клиниката се потвърждава от връзката между развитието на MDR и цитотоксичността на лекарствата. Наистина, нивото на mRNA/εγ1 в клетките, третирани с токсини, се увеличава с увеличаване на концентрациите на последните. Следователно използването на режими на химиотерапия с високи дози (оправдано за повишаване на ефективността на лечението) може да доведе до развитие на MDR в оцелелите клетки. Концентрациите на лекарствата, необходими за пълната резорбция на тумора, могат да бъдат по-високи от допустимите за пациента, което определя границата за повишаване на дозата при химиотерапия. Вътреклетъчните сигнални антагонисти, идентифицирани по-горе, могат да служат като прототипи за бъдещи лекарствени MDR блокери, използвани в комбинация с традиционни противоракови лекарства. По този начин предотвратяването на спешното развитие на MDR разширява възможностите за преодоляване на това клинично неблагоприятно явление.

Какви са подходите за преодоляване на установена MDR? Една от „уязвимите“ мишени в резистентните клетки може да бъде плазмената мембрана. Нарушаването на неговата цялост причинява смъртта на резистентни клетки: Pgp не предотвратява смъртта от влияния, които предизвикват некроза. Идентифицирана е терапевтично важна клетъчна структура, която трябва да бъде насочена. Очевидно просто мембранолитичните агенти са неподходящи поради неконтролирана токсичност към тъканите, включително нетуморните. Необходимо е да се намерят агенти, които преодоляват Pgp бариерата и причиняват увреждане на плазмената мембрана, т.е. създават вътреклетъчна концентрация на лекарството, достатъчна за активиране на некроза.Вещество, което отговаря на това условие, може да бъде церамид, сфинголипид, който се натрупва в клетката в отговор на много стимули, включително противотуморни лекарства. Церамидът не се транспортира от Pgp, което гарантира, че концентрацията на този метаболит в резистентните клетки е достатъчна, за да предизвика смърт.

Токсичността на керамида към резистентни клетки означава, че сигналните пътища, дистални от натрупването на керамид в тези клетки, не са блокирани от Pgp или други механизми, свързани с MDR селекция. Следователно преодоляването на резистентността трябва да включва намиране на начини за натрупване на керамид (и вероятно други токсични метаболити) в резистентни клетки. Цитотоксичността на керамида изисква кавеоли или техни аналози - субмембранни образувания, богати на фосфолипиди и протеини и се натрупват по време на селекция за MDR (La\ et al., 1998). Важно е, че селекцията за MDR може да бъде придружена от увеличаване на клетъчните молекулярни цели за противоракова терапия.

Свободните форми на кислород изглежда са основен механизъм за смърт, предизвикана от керамиди. Това повдига въпроса за значението на митохондриите за оцеляването на MDR клетки. Митохондриален път

предава допълнителни сигнали за активиране на ефекторни каспази. ■Литохондриалната „примка“ е мощен фактор за потенциране на такива сигнали; „спадането на електрическия потенциал на митохондриите и особено освобождаването на цитохром С в плазмата осигуряват необратимостта на процеса на смърт. Тъй като не е възможно да се предвиди дали селекцията за резистентност ще бъде свързана с инактивиране на един или друг път на смърт, важно е само „надеждна“ каскада да остане функционална в MDR клетки.

Нашите резултати показват чувствителност към кислородни адикали в клетъчни линии с Pgp-медиирана MDR. Може да се предположи, че въпреки че първичната резистентност и селекцията за лекарствена резистентност се определят от много механизми, все още е възможно да се преодолее многофакторната резистентност чрез увеличаване на вътреклетъчното окисление. Свободният кислород веднага влиза в множество окислителни реакции, водещи до увреждане на важни за живота на клетката структури - ДНК и мембрани. В горните експерименти некрозата се оказа водещият метод за избелване при излагане на кислородни радикали. Това не означава, че некрозата е единственият начин за смърт, предизвикана от свободни форми на кислород. В конкретна ситуация трябва да се установи преобладаването на този или друг вид смърт; Стандартното разграничение между апоптоза и некроза не характеризира разнообразието от механизми на смъртта. Тази оценка е полезна за определяне дали увреждането на мембраната е първично или този процес е забавен. Въпреки това изглежда важно да се оцени пропускливостта на плазмената мембрана във всяка ситуация: нарушението на целостта на мембраната причинява необратимост.Следователно некротичният компонент на смъртта е важен за генерирането на MDR клетки, тъй като Pgp може да защити клетките от агенти които предизвикват апоптоза, но не и от вещества, които предизвикват апоптоза, причиняващи некроза.

Последното обстоятелство не е изненадващо. За функционирането на този протеин на плазмената мембрана е необходимо определено физико-химично състояние поради неговата цялост. При некроза ще настъпи тежко увреждане на клетката, главно поради нарушаване на транспорта на вода и йони. Тези увреждания ще засегнат почти всички клетъчни структури, за разлика от апоптотичните каскади, които се изразяват в последователно разцепване на субстрати - енергийно зависим процес, който включва образуването на многокомпонентни протеиново-липидни комплекси в клетката и строгата специфичност на взаимодействието на каспази със субстрати. Блокирането на една или повече връзки на такава каскада (например, в резултат на нарушен липиден транспорт в клетки с MNA MS, не се образуват „правилно“ локализирани сигнални комплекси) ще прекъсне предаването на сигнали към основните механизми, което води до клетката избягване на смъртта и, в крайна сметка, формиране на резистентност Също така поради тази причина, за борба с MDR, е желателно механизмите на смъртта да бъдат множество и да включват активиране не само на каспази, но и на: други семейства протеази (лизозомни, протеазомни, ядрени), както и потенциране на сигнала (митохондриален път) и нарушаване на пропускливостта на плазмената мембрана. Колкото повече механизми на смърт могат да бъдат активирани в резистентни клетки, толкова по-надежден е крайният резултат за преодоляване на MDR.

1. Генът MYR\ и медиираният от P-гликопротеин MDR фенотип могат да бъдат индуцирани чрез едно краткотрайно излагане на MN клетки< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в

ции на клетки, оцелели след експозиция. Епигенетичното активиране на MOT произвежда стабилен MDR фенотип.

2) Спешното образуване на MDR се осигурява чрез активиране на експресията на гена ER1: индукция на неговата транскрипция и стабилизиране на иРНК.

3) Активирането на MDR включва общите мехазоми на отговора на клетката на стрес: пътя на сфатидилинозитола, протеин киназа С, мобилизиране на вътреклетъчния 2+, активиране на NaκB, митоген-активирани протеин кинази и регулиране на физическото състояние на хроматина. Инхибирането на тези механизми предотвратява развитието на MDR в клетки, които преживяват лечението с тези туморни лекарства.

4) Преодоляването на PgP бариерата и индуцирането на механизми за смърт, които функционират в клетки с MDR, са необходими и достатъчни условия за унищожаването на такива клетки.

5) Pgp поотделно и MDR фенотипът като цяло не осигуряват оцеляването на pgp при влияния, които причиняват първично нарушение на целостта на оматичната мембрана. По този начин плазмената мембрана е апевтична мишена и индуцирането на некроза е една от стратегиите за преодоляване на артериалното съпротивление.

6) Смъртта на клетки с MDR, причинена от нарушение на целостта на зимната мембрана (медииран от перфорация лизис), се причинява от отоксични Т-лимфоцити, генерирани в отговор на имунизация с холе клетки, модифицирани да експресират цитокини.

7) Вътреклетъчните метаболити, които могат да увредят зимната мембрана и да причинят смъртта на клетки с MDR, са свободни кислородни молекули. Генерирането им под въздействието на антитуморни гарати е ефективен механизъм за преодоляване на MDR.

Основни публикации по темата на дисертацията:

1. Shtil A., Shushanov A., Stavrovskaya A., Moynova E. Честота на метастазите в туморни клетки на сирийски хамстер, избрани за ниски нива на „типична“ мултилекарствена резистентност. Експериментална и токсикологична патология, 1994, 46, 257-262.

2. Ерохина М., Щил А., Шушанов С., Сидорова Т., Ставровская А. Частично възстановяване на актиновия цитоскелет в трансформирани фибробласти на сирийски хамстер, избрани за ниски нива на "типична" резистентност към множество лекарства J/FEBS Letters, 1994,341, 295-298.

3. Stromskaya T., Filippova N., Rybalkina E., Egudina S., Shtil A., Elisseenkova A., Stavrovskaya "A. Промени в синтеза на меланин в човешки меланомни клетки, селектирани in vitro за многолекарствена lesislaaccJ/Експериментална и токсикологична патология, 199 47, 157-166.

4. Yu R., Shtil A., Tan T.-H., Roninson I., Kong T. Adriamycin активира c-Jun N-терминална киназа в човешки левкемични клетки: значение за апоптозата JlCancer Letter: 1996,107, 73 -81.

5. Комаров П., Штил А., Бъкингам Л., Баласубраманиан М., Пиранър О., Емануел М, Ронинсън И., Кун Дж. Инхибиране на индуцирана от цитарабин MDR1 (активиране на P-гликопротеинов ген в човешки туморни клетки от мастни киселина-PEG-диестери на мастни киселини, нови инхибитори на функцията на Р-гликопротеин I I International Journal of Cancer, 1996, 68 245-250.

6. Walter R., Shtil A., Roninson I., Holian O. 60 Hz електрически полета инхибират активността на протеин киназа С и повишена регулация на гена за резистентност към множество лекарства (MDR1) JIRadiatio Research, 1997, 147, 369-375.

7. Walter R., Shtil A., Roninson I., Reyes H., Holian 0. Ефекти от 60 Hz електрическа фон протеин киназа С активност и експресия на ген за резистентност към множество лекарства (MDR1) // Current Surgery, 1997, 54,366-370 .

Stromskaya T., Rybalkina E., Filippova N., Shtil A., Stavrovskaya A. Регулиране на MDR1 генната експресия и функцията на P-гликопротеин в култивирани меланомни и хепатомни клетки.//British Journal of Cancer, 1998, 77, 1716-1725 .

Komarov P., Shtil A., Holian 0., Tee L., Buckingham L., Mechetner E., Roninson I., Coon J. Активиране на гена LRP (белодробен съпротивителен протеин) чрез краткосрочно излагане на човешки левкемични клетки до форболов естер и цитарабин.f/Oncology Research, 1998, 10, 185-192.

I. Shtil A, Mandlekar S, Yu R., Walter R., Hagen K., Roninson I., Tan T.-H., Kong T. Диференциална регулация на митоген-активирани протеин кинази от микротубулно-свързващи агенти в човешка гърда ракови клетки J/Oncogene, 1999, 18, 377-384.

Damiano J., Cress A., Hazlehurst L., Shtil A. и Dalton W. Лекарствена резистентност, медиирана от клетъчна адхезия (CAM-DR): роля на интегрини и резистентност към апоптоза в човешки миеломни клетъчни линии MBlood, 1999, 93, 1658- 1667 г.

Shtil A., Turner J., Durfee J., Dalton W. и Yu H. Базираната на цитокини туморна клетъчна ваксина е еднакво ефективна срещу родителски и изогенни мултирезистентни миеломни клетки: ролята на цитотоксичните Т-лимфоцити. I/Кръв, 1999, 93, 1831-1837.

Shtil A., Ktitorova O., Kakpakova E. и Holian O. Диференциални ефекти на MDR1 (мултилекарствена резистентност) ген-активиращи агенти върху протеин киназа С: доказателство за излишък на механизми на придобита MDR в клетки на левкемия.//Левкемия и Лимфом, 2000, 40, 191-195.

Shtil A., Grinchuk T., Tee L., Mechetner E., Ignatova T. Свръхекспресията на гена MDR1 е свързана с намален митохондриален трансмембранен потенциал в K562 човешки левкемични клетки, избрани за Р-гликопротеин-медиирана мултилекарствена резистентност.//International Journal of Oncology, 2000, 17, 387-392. Shtil A., Turner J., Dalton W., Yu H. Алтернативни пътища на клетъчна смърт за: заобикаляне на плейотропната резистентност в миеломните клетки: роля на цитотоксичните Т-лимфоцити // Левкемия и лимфом, 2000, 38, 59-70.

16. Щил А.А. Пътища на сигнална трансдукция и транскрипционни механизми като цели за превенция на появата на резистентност към множество лекарства в човешки ракови клетки. HCurre, Drug Targets, 2001, 2, 57-77.

17. Shtil A. A. Епигенетично активиране на мултилекарствена резистентност на туморни клетки: предаване на сигнала, транскрипционно активиране и възможности за превенция // "Напредък на съвременната биология", 2001, 121, 563-575.

18. Сидорова Т.А., Нигматов А., Какпакова Е.С., Ставровская А.А., Герасимова Г.К., Щил А.А. и Серебтяков Е.П. Ефекти на изопреноидните аналози oiSDB-етилендиамин върху мултирезистентни туморни клетки самостоятелно и в комбинация с химиотерапевтични ефекти.l/Journal of Medicinal Chemistry, 2002,21,5330-5339.

19. Shtil A. A. Поява на резистентност към множество лекарства в левкемични клетки по време на химиотерапия: механизми и превенция.1 ¡Journal of Hematotherapy and Stei Cell Research, 2002, 11, 231-241.

20. Shtil A. A. Многофакторна лекарствена резистентност: P-гликопротеин на върха на Vyraxmi.ll Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research, 2002,11,437-43

21. Shtil A. A. P-гликопротеин като терапевтична цел: добри новини.l/Leukemia, 2002, 2169-2170.

22. Щил А.А. Развитие на множествена лекарствена резистентност като спешен клетъчен отговор на екзогенни влияния // „Биологични мембрани (2003,20,236-243.

23. Lehne G., Shtil A. A. Насочване към P-гликопротеин за изпълнение на механизми за клетъчна смърт при рак., H "Целеви терапии за рак, Одисея", 2003, 203-i

Обслужване на копирна техника на Държавния научноизследователски център на име. Н.Х. Blokhin RAMS Подписано за публикуване 14 . II .03 Заповед № 24"/. Тираж 100 бр.

Тази дисертационна работа трябва да бъде достъпна в библиотеките в близко бъдеще.

480 търкайте. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Дисертация, - 480 рубли, доставка 1-3 часа, от 10-19 (московско време), с изключение на неделя

Щил, Александър Албертович. Лекарствена резистентност на туморни клетки, медиирана от P-гликопротеин: механизми на спешно образуване и подходи за преодоляване: резюме на дисертацията. ... Доктор на медицинските науки: 14.00.14.- Москва, 2003.- 46 с.: ил.

Въведение в работата

Уместност на темата

I. Мултилекарствена резистентност на туморни клетки:

биологични механизми и значение в онкологията.

Въпреки значителния напредък във фармакологията, включително развитието на технологията за създаване на лекарства с очаквани свойства, успехът на химиотерапията при тумори е ограничен от най-важната характеристика на живите системи - способността да реагират на промените във външната среда. Една от проявите на такава дастичност е развитието на резистентност на туморните клетки към лекарства [използвани в химиотерапията. Широкото разпространение и дългосрочната, постоянна природа на клетъчната адаптация към външни влияния предполагат, че преодоляването на лекарствената резистентност може да бъде свързано не само с търсенето на по-ефективни лекарства: вероятно няма лекарство, към което клетките да не могат да развият резистентност. Само изясняването на логичните механизми на устойчивост на различни видове стрес ще послужи като основа за разработване на стратегии за преодоляване на лекарствената резистентност, необходимо условие за повишаване на ефективността на лечението на онкологично болните.

Мултилекарствената резистентност (MDR) на неоплазмите - запазването на жизнеспособността на туморните клетки в отговор на въздействието на различни лекарства - е една от основните причини за прогресията! Заболявания: туморът е нечувствителен към химиотерапия, независимо от използваната комбинация от лекарства. Феноменът MDR има дългосрочен и стабилен характер: механизмите на резистентност се наследяват през поколения клетки. По този начин MDR е един от ключовите фактори за прогресията на тумора.

Има два основни типа резистентност на клетките към токсини. Първичен г.е. Резистентността, наблюдавана преди излагане на химиотерапевтични лекарства, се дължи на експресията на защитни механизми по време на туморната прогресия. Да, активиране

антиапоптозните механизми, придаващи резистентност към имунните ефектори, могат да бъдат свързани с лекарствената резистентност. Вторичната (придобита) резистентност възниква в клетки, изложени на стрес. Преди тези ефекти защитните механизми в такива клетки са слабо изразени или липсват; оцелявайки след третиране с един токсин, клетките придобиват резистентност към много вещества - MDR (Riordan, Ling, 1985). По-нататъшната селекция консолидира придобития фенотип през поколения клетки.

Най-важният механизъм на MDR е намаленото натрупване на токсини в клетката, поради отделянето на вещества в междуклетъчната среда. Такъв транспорт се осъществява от интегралния протеин на P-гликопротеина на плазмената мембрана (Pgp) поради енергията на АТФ хидролизата (Juliano, Ling, 1984)."! Човешкият Pgp е кодиран от гена MDRI(мултилекарствена резистентност 1), локализирана на хромозома 7 (Chen et al., 1986). Многобройни данни показват, че увеличаването на иРНК MDRIи Pgp често служи като фактор в резистентността на множество видове тумори към лечение (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).

II. Развитие на MDR в туморни клетки: биологично механизми като целиЗа предотвратяване

Разумно е да се предположи, че увеличаването на количеството на иРНК MDRIпричинени от амплификация на този ген. Този MDR механизъм е идентифициран в култивирани клетъчни линии, избрани за оцеляване в присъствието на токсини (Roninson, 1991). Въпреки това, когато се анализират човешки тумори, амплификацията на ген MDR1не се открива нито в първични тумори, нито в неоплазми след лечение. Вероятна причина за клинична MDR е свръхекспресията MDRIи Pgp с непроменена генна структура (запазване на броя на копията и нуклеотидната последователност), т.е. епигенетична активност на фенотипа. В култури от човешки туморни клетки, повишаване на нивото на иРНК MDRIи количеството Pgp, отбелязано по време на едно лечение с химиотерапия

различни по химическа структура и механизми на действие (Chaudhary, Aninson, 1993). Получени са доказателства за натрупване на иРНК MDR\при метастази на рак в белодробната тъкан още 20-50 минути след началото на интраоперативната белодробна инфузия с доксорубицин (Abolhoda et al., 1999). Тези резултати (потвърждават възможността за епигенетично активиране на MDR в експеримент и в други ситуации: повишена иРНК MDR\и Pgp в тумори могат да възникнат без генна амплификация MDRI.

Този тип биологична регулация - спешно активиране на фенотипа - включва индуциране на транскрипция на гена (гените), кодиращи съответния фенотип, и/или посттранскрипционен контрол (стабилизиране на NK, регулиране на протеиновия синтез и функциониране). за MDR, този тип регулация означава възможност за генна индукция MDR\клетъчни стимули и сравнително бързото развитие на резистентност в r/холестеролните клетки в отговор на стрес. Генна индуцируемост MDRIпредполага развитието на сигнални пътища от клетъчната периферия към ядрото. Такива пътища могат да включват сигнални механизми, прилагащи стрес: протеин киназа C ІКС), фосфолипази и вътреклетъчен Са 2+, митоген-активирани уринарни кинази, ядрен фактор капа В (NFkB). Сигнализиране към регулаторната област на ген MDRIи транскриптът осигурява активиране на генната компресия.

Изследването на регулирането на MDR има и фундаментален практически аспект. Инхибирането на тези механизми с помощта на фармакологични и/или генетични влияния би предотвратило развитието на MDR в процеса [myoteragash.

III. Преодоляване на образуваната MDR от туморни клетки.

Ако блокира активиращ ген MDR\сигнали могат да предотвратят образуването на MDR в първичните сензорни клетки, тогава такива

подходът е неприложим за преодоляване на вече формирана съпротива. Традиционният метод за борба с вторичната MDR е използването на Pgp модулатори в комбинация с цитостатици (Lehne, 2000). Въпреки това, употребата на Pgp инхибитори е ограничена от странични ефекти (нарушения на сърдечния ритъм, имунен дисбаланс). Също толкова важно е, че ефективността на комбинациите модулатор + хормон-статик може да бъде намалена поради блокиране на поне някои механизми на клетъчна смърт по време на селекцията за MDR.

За да се приложи второто условие, подходите, насочени към лизиране на резистентни клетки като механизъм за предизвикване на тяхната смърт, изглеждат обещаващи. Ваксинирането на мишки със сингенни миеломни клетки, трансфектирани с кДНК на определени цитокини, води до развитие на цитотоксичен Т-лимфоцит (CTL)-медииран имунен отговор и отхвърляне на присадения тумор при имунизирани животни (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al. ., 1996). CTL лизират клетки с помощта на гранзим В и перфорин. Тъй като гранзим В активира каспаза 3, един от дисталните ефектори на апоптозата, и перфоринът причинява първично увреждане на плазмената мембрана (некроза), може да се надяваме, че SL ще бъдат ефективни, ако механизмите на проксималната смърт са блокирани; задействане на дистални връзки на апоптоза в комбинация с некроза

води до смърт на клетки, резистентни към антитуморни лекарства - стимулатори на програмирана клетъчна смърт.

Формулиране на проблема

MDR е клинично неблагоприятен феномен, чието преодоляване изисква познаване на механизмите на неговото развитие и начините, по които настъпва клетъчната смърт, необходимо е да се изследват и двата аспекта на проблема. Първо, необходимо е да се изследват механизмите на развитие на MDR при MD/? l/Pgp-отрицателни човешки клетки, изследването на тези механизми ще послужи за предотвратяване на развитието на резистентност в предимно чувствителни клетки. На второ място, анализът на процесите на смърт, протичащи в клетките с MDR, ще създаде основата за преодоляване на резистентността в ситуации, когато се формира вторична MDR.

Целта на изследването е да се установят механизмите на спешно образуване на лимфни възли в човешките туморни клетки и да се разработят подходи за преодоляване на тази резистентност.

Да се оптимизират модели за развитие на MDR в човешки туморни клетъчни култури в отговор на ефектите от химиотерапията и експериментални агонисти и антагонисти на сигнални механизми.

Определете основните! механизъм на спешно развитие на MDR, когато клетките се третират с антитуморни средства: генна амплификация MDRI,селекция на Pgp-положителни клетки или de novo потискане на MDR.

Изследвайте пътищата на вътреклетъчно предаване на сигнала, които регулират активирането на MDR - протеин киназа С, фосфолипаза С, клетъчен Ca +, митоген-активирани протеин кинази, NFkB).

Да се идентифицира ролята на трансгресионното активиране и посттрансгресивното регулиране (стабилност на иРНК) на генната експресия MDRIв непосредственото развитие на MDR в отговор на излагане на химиотерапия.

Да се разработят начини за предотвратяване на развитието на MDR в туморни клетки при комбиниране на химиотерапевтични лекарства с блокери MDR\-активиране на сигнални пътища и инхибитори на генна транскрипция

За изследване на кинетиката на активиране на секретиращи и ефекторни капси, промени в трансмембранния потенциал на митохондриите, протеолитично разцепване на поли (ADP) рибоза полимераза, междунуклеозомна фрагментация на ДНК и целостта на плазмената мембрана в родителските клетки и варианти с MDR, когато се третират с лекарството не се транспортира от P-гликопротеин.

Използвайте ваксинация с цитокин-експресиращи туморни клетки, за да генерирате имунен отговор срещу MDR клетки.

Разпоредби, представени за защита.

Образуването на Pgp-медиирана MDR - спешен клетъчен отговор на много влияния - се медиира от епигенетично активиране на гена MDRI.Това активиране се дължи на множество механизми на вътреклетъчно сигнализиране, индукция на генен промотор и стабилизиране на иРНК и може да бъде предотвратено от инхибитори на тези сигнали.

Преодоляването на Pgp-медиирана MDR може да бъде свързано с насочване към плазмената мембрана на резистентни клетки. Pgp не предпазва клетките от нарушаване на целостта на плазмената мембрана - некроза.

Научна основа За първи път е обоснована идеята за образуването на MDR като спешен отговор на клетка към екзогенен стимул;

За първи път подробно е изследван механизмът на развитие на специфичен фенотип на лекарствена резистентност - Pgp-медиирана MDR: епигенетично активиране на гена, кодиращ този протеин MDRI.

3. За първи път е разработен модел на спешна генна активация MDRI,

придружено от придобиване на стабилен фенотип на Pgp-медииран MDR в култивирани човешки туморни клетки; \. Идентифицирани са пътища на сигнална трансдукция, механизми на активиране на транскрипция и пост-транскрипционна генна регулация MDRXв клетки, изложени на антитуморни лекарства. 5. За първи път класове фармакологични вещества - блокери на вътреклетъчното предаване на сигнала - са характеризирани за предотвратяване на образуването на Pgp-медиирана MDR в туморни клетки. 5. За първи път са изследвани механизмите на смърт, действащи в клетки с Pgp-медиирана MDR, и е разработен подход за преодоляване на резистентността, който включва първично увреждане на целостта на плазмената мембрана.

Практическа стойност.

Разработване на методи за предотвратяване на спешното развитие на Pgp-медиирана MDR в култивирани туморни клетки, когато са изложени на химиотерапевтични лекарства.

Предклинични изпитвания на модифицирани генетично модифицирани ваксини за преодоляване на MDR.

Апробация на работата.

Дисертацията беше обсъдена на 30 юни 2003 г. на съвместна конференция на лаборатории по генетика на туморни клетки, цитогенетика с група молекулярна генетика, вирусни и клетъчни онкогени, молекулярна ендокринология, противотуморен имунитет, биохимична фармакология, медицински изследвания, експериментална диагностика и биотерапия на тумори; Отделение по шмунология, хематология, химиотерапия, клинична фармакология, съвременни методи на лечение на Руския център за изследване на рака, кръстен на. Н. Н. Блохин RAMS.

Основните материали на дисертацията са представени на следните конференции: 2-ри международен симпозиум "Цитостатична лекарствена резистентност", (U Германия, 1991 г.); Gordon Conference "Advances in Chemotherapy" (Ню Йорк, Лондон, САЩ, 1994); "Молекулярна токсикология" (Copler Mountain, САЩ, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, USA, 1996); "Nucleic Acids - Integrating Molecular Diagnostics and Therapy" (Сан Диего, САЩ, 1996); годишна конференция на Американската асоциация за изследване на рака (1994-2001): 6-та И 7-ми конгрес "Advances in Oncology", (Херсонисос, Гърция, 2001,2002); "Структурата и функциите на клетъчното ядро" (Санкт Петербург, 2002), както и на семинари в Oncotech, Inc. (Ървайн, САЩ, 1996 г.), Salk Institute (LaJolla, САЩ, 1997 г.), Раков център Лий Мофит (Тампа, САЩ, 1997 г.), Джаксън лаборатория (Бар Харбър, САЩ, 1997 г.), Раков център Слоун-Кетеринг, Ню Йо ] САЩ, 1999), университети в Копенхаген (2002), Инсбрук (2002) и Гронинге (2003), Московски държавен университет. М. В. Ломоносов (2002 г.), Изследователски институт по експериментална патология, онкология и радиобиология, кръстен на. R.E. Kavetsky (Киев, 2002).

Публикации.

Структура и обхват на дисертационния труд.

Изследвания на програмирана клетъчна смърт - апоптоза (от гръцки. αποπτωσις - падане на листата) – през последното десетилетие са довели до няколко важни научни открития: открита е холистична система за осъществяване на това явление – идентифицирани са гени, които го регулират, както и повърхностни клетъчни рецептори и техните лиганди, които медиират клетъчната смърт.
В многобройни експерименти учените са доказали: програмираната смърт е задължително и неразделно свойство на всяка клетка на всяка многоклетъчна система. (Всеки ден около 5% от клетките на тялото претърпяват апоптоза и нови заемат тяхното място. На една клетка са необходими от 15 минути до 2 часа, за да изчезне безследно).
През 2002 г. молекулярният биолог Сидни Бренер ( Сидни Бренер, Робърт Хорвиц ( Х. Робърт Хорвиц) и Джон Сълстън ( Джон Едуард Сълстън) за открития в областта на „генетичното регулиране на развитието на организма и програмираната клетъчна смърт“ е удостоен с Нобелова награда за физиология или медицина.
Експертите смятат, че по-нататъшните изследвания на апоптозата могат да допринесат за разработването на лекарства срещу опасни заболявания като рак, инсулт, инфаркт, болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон и някои други.

АЛЕКСАНДЪР АЛБЕРТОВИЧ СТИЛ– доктор на медицинските науки, ръководител на лабораторията по механизми на смъртта на туморни клетки, Научноизследователски институт по карциногенеза, Руски център за изследване на рака, кръстен на. Н.Н. Блохин Руска академия на медицинските науки.

Специалист в областта на клетъчната и молекулярна онкология.

Научни интереси: механизми на програмирана клетъчна смърт (бактерии и еукариоти, по-специално туморни клетки).

Въпроси_Елена Ветрова
Март април
Москва, 2009 г

Александър Албертович, апоптозата е един от ключовите биологични процеси, които се случват в тялото през целия му живот. Той играе критична роля в ембрионалното развитие на тялото (морфогенеза) и в поддържането на динамичния баланс в органите и тъканите (хомеостаза), както и в процеса на започване и развитие на тумори(канцерогенеза).
В какви други случаи се включва програмата за самоубийство на клетките в тялото? И как тази програма "знае" кое е добро за тялото и кое е лошо?

На фиг. апоптоза. Процесът започва, когато функционалността на клетката е изчерпана. Гените, които осигуряват клетъчното делене, са блокирани и гените, които осигуряват синтеза на литик (от гръцки.литикос - отървавам се , разтварям ) ензими – стимулирани. Тези ензими навлизат в ядрото и лизират (унищожават) хроматинахромозоми- комплекс от ДНК, РНК и протеини. Хромозомите се разпадат и синтезът в клетката спира.
Някои външни признаци на апоптоза в клетка:
пикноза (свиване на ядрото);
хроматолиза (намаляване на ядреното оцветяване);
кариорексис (разпадане на ядрото на части);
разрушаване на цитоплазмата и др.
Останките се фагоцитират (поглъщат) от макрофаги.

Програмираната смърт се активира по време на физиологични процеси - в най-простите организми, например бактерии, за да се поддържа размерът на клетъчната популация, който е оптимален за дадени условия на околната среда (хранителни вещества, температура). Този ефект се наблюдава в биофилми, саморегулиращи се бактериални общности.
В ембрионалното развитие на тъканите и органите на висшите организми и при възрастния организъм програмираната смърт служи за замяна на клетъчните популации - стареещи и губещи функции - с млади.
Програмата не знае кое е добро и кое е лошо за тялото, просто така работи животът - смъртта е страна на живота...

Тоест, страничен ефект от еволюцията е товаза какво говори Август Вайсман?Немски зоолог и еволюционист, написал в края на 19 век...

...Следователно смъртта на нетуморни клетки по време на химиотерапия е лоша: апоптозата на нормалните клетки тук е нежелателна, но програмата не разпределя между „лоши и добри“, а позволява на тези, които могат да оцелеят, да оцелеят, унищожавайки повече уязвими, по-чувствителни... Справедливостта в човешките разбирания тук не работи и трябва да платите за тази безнадеждност и „безпринципност“.

Учените научиха за съществуването на апоптоза не толкова отдавна, преди около половин век. Как това откритие повлия на развитието на науката?

На фиг. активиране на генетичната програма за апоптоза в клетката под въздействието на външни фактори (сигнали)
(Фиг. се увеличава, когато щракнете върху нея с курсора)

Това откритие даде възможност за кратко време - за около 15 години - да се формират представи за най-важните биологични процеси - предаването на вътреклетъчни сигнали, регулацията на протеолизата - процесът на разграждане на протеини и пептиди в тялото, регулацията на формата на ядрото, органелите и мембраните.

Изследването на ролята на хроматиновите протеини в генната експресия се засили.

Обосновават се идеите за механизма на действие на цитостатиците, главно противотуморни лекарства и йонизиращи лъчения, върху туморни и нормални клетки.

Откриването на механизмите на клетъчната смърт днес е фокусирало много научни направления – от биологията и химията до терапията на болести по човека, животните и растенията.

Да, тази посока се счита за една от най-обещаващите в молекулярната биология. Оптимистично се свързва с разработването на принципно нови лекарства за лечение на все още нелечими дегенеративни заболявания, рак и дори възможността за победа над старостта.
Според някои доклади повече от четиристотин лаборатории в света днес по някакъв начин са въвлечени в тази тема.

Обещаването на изследването на апоптозата за молекулярната биология се дължи на факта, че това явление (и по-широко казано, клетъчната смърт) обхваща комбинация от много научни идеи и направления. Клетката, независимо дали е проста или сложна, винаги е сложна система, а смъртта е неделимо свойство на живите същества. Следователно изучаването на смъртта като цяло е обещаващо за разбирането на същността на живота.
И наистина, на практика изучаването на механизмите на смъртта ще даде възможност да се уточни действието на много лекарства.

Сравнително наскоро феноменът беше открит ефект на страничен наблюдател (« ефект на страничен наблюдател“): когато умиращите по някаква причина клетки изпращат определен сигнал до здравите клетки в съседство с тях и те се самоунищожават. Какво ги мотивира? Има ли хипотези за това?

Това е пример за биологична регулация в сложна система: по този начин клетките се убиват една друга, като изпращат сигнали на своите съседи. Сигналът (обикновено водоразтворим протеин) не е вреден за собствените клетки, но е разрушителен за клетки от различен произход, намиращи се в същата популация - играта се основава на тази разлика в чувствителността.

Каква е ролята на кислорода и водородния пероксид в процеса на апоптоза?

Много важно - кислородните радикали са много активни химически. Те предизвикват реакции, които увреждат протеини, нуклеинови киселини и липиди.

Ориз. се увеличава, когато щракнете върху него с курсора.

На това свойство се основава терапевтичният ефект на йонизиращото лъчение и антрациклиновите антибиотици. Възбуждането на специални химични съединения - фотосенсибилизатори - от светлина предизвиква кислородна експлозия и тежко увреждане на клетките. Ако такъв фотосенсибилизатор се натрупа в тумор и последният бъде осветен, настъпва смърт на туморни клетки. В онкологията такава терапия се нарича фотодинамична и се използва широко, но за тумори, които са достъпни за светлина и не са много големи по размер.

Принципът на апоптозата се наблюдава както на клетъчно, така и на субклетъчно ниво, в тъканите и органите. Академикът на Руската академия на науките Владимир Скулачев предложи това явление да се нарече феноптоза. Защо в природата някои растения и животни (бамбук след цъфтежа, сьомга след хвърляне на хайвера) включват програма за самоунищожение в разцвета на живота си? Малко вероятно е това да се дължи на необратими генни мутации.

Вероятно няма връзка, но това е механизмът на природата - езикът, на който се казва, че избледнелият бамбук ще умре... Механизмът е епигенетичен - няма мутации, но има бързи промени във физико-химичните свойства на хроматина , и важен ген (гени) от работа става мълчалив . Такъв език не изисква никакво разрушаване - достатъчно е да се прикрепи или откачи химична група - метил, фосфат, ацетил - от един протеин към друг.
Стига намек...

Има хипотеза, че ракът е и програмирана смърт на генетично нестабилен организъм, съдържащ непоправими увреждания (и следователно опасен за еволюцията). Все по-често може да се чуе онколози да казват, че появата на напълно трансформирана клетка е само въпрос на време. Ако е така, тогава ракът не е болест, като старостта, а определен резултат от развитието на живата система. Но учените предполагат и футуролозите прогнозират победа над рака в бъдеще. И наистина, в крайна сметка човекът отдавна е престанал да очаква милост от еволюцията. Възможно ли е да победим рака?

Може би не може да бъде победен - ракът е един от механизмите за отстраняване на нежизнеспособен индивид, наред с други типични патологични процеси - възпаление, алергии. Органичният живот е изграден върху оборота на организмите - смъртта е неизбежна и са необходими механизми за нейното осъществяване. Ракът е един такъв механизъм. Задачата на учените е да забавят смъртта, а не да я избягват.

Ако има силна връзка между стареенето и развитието на рак и очевидно никой не се съмнява в това, може би е необходимо да се разшири фронтът на борбата срещу него до мащаба на борбата срещу стареенето?

Борбата със стареенето е необходима както като част от борбата с туморите, така и в други аспекти - това е безспорно.

Противораковата защита на организма се основава на апоптоза. Защо апоптозата спира да работи след серия от мутации? Защо в един момент тялото спира да се съпротивлява и започва да помага на тумора (например имунната система)?

Тъй като апоптозата, като всеки биологичен процес, се нарушава от мутации, а също и защото апоптозата може лесно да бъде нарушена без мутации.

Каква е ролята на групата ензими на цитохром Р450 в процеса на канцерогенеза?

3.Сър Джон Сълстън- британски биолог, член на Кралското общество на Великобритания. Неговата лаборатория състави пълно описание на реда на делене на ембрионалните клетки на нематода Caenorhabditis elegans и проследи съдбата на абсолютно всички негови 959 клетки по време на развитието.

Без съмнение. Съществуването на такива протеини потвърждава същественото значение на апоптозата в биологията - механизмите на това явление не са случайни, те са кодирани в ДНК на клетката и се задействат при подходящ сигнал. Без тях няма смърт.

Наскоро американски изследователи от Института по медицина Алберт Айнщайн откриха, че малък фрагмент от вътреклетъчния протеин p115 активира апоптозата.
Преди апоптозата p115 се разпада на два фрагмента, по-малкият от които се състои от 205 аминокиселини. Според учените той играе важна роля в процеса на клетъчна смърт, тъй като неговата експресия води до освобождаване на цитохром С от митохондриите в цитоплазмата на клетките, което води до тяхната смърт. Учените се надяват, че това откритие може да доведе до разработването на нови лекарства за борба с рака и други патологии, характеризиращи се с прекомерна клетъчна пролиферация.
Според вас кои от последните открития в областта на апоптозата са ключови за медицината и биологията?

На фиг. експресията на малък фрагмент от протеина p115 (показан в зелено) води до освобождаване на цитохром С (червен) от митохондриите в цитоплазмата на клетките, което води до клетъчна смърт.
http://www.cbio.ru/article.php?storyid=3319

Новите подходи за лечение на пролиферативни заболявания се основават на подобен феномен - да се създадат условия, при които собствените протеини на клетката да работят като убийци. По този начин протеолитичното разцепване на протеиновата поли (ADP-рибоза) полимераза, което се случва по време на индуцирането на апоптоза, образува неговия фрагмент, който се свързва с ДНК и предотвратява възстановяването на нейното увреждане. Нормалната протеинова поли(ADP-рибоза) полимераза, необходима за лечение на увреждане на ДНК, става разрушителна за клетката.

Последните открития, които сега получават важни практически приложения за регулиране на клетъчната смърт, включват доказателство за възможността за потискане на специфичен ген в клетка и целия организъм чрез въвеждане на така наречената къса фиби антисенс РНК.

Безшумна генна технология ( заглушаванегени), когато свързването на къси двуверижни РНК молекули към регулаторната последователност на целевия ген прави възможно спирането на процеса на синтез в този ген.
Обещаваща векторна (вирусна) генна терапия.

Тези инструменти, продукт на дългогодишно сътрудничество между химици и биолози, правят възможно постигането на дългосрочно спиране на гените. Ако продуктите на такива гени са важни за жизнеспособността на клетките, ние предизвикваме смърт с минимални странични ефекти. Последното е особено важно в онкологична клиника - често химиолъчетерапията се понася от пациентите по-тежко от самото заболяване... Стандартните лекарства все още са слабо разбрани кои клетки да унищожават и по какъв начин. Генната терапия може да бъде по-ефективна и страничните ефекти от лечението могат да бъдат намалени.

Несъмнено плодотворна, макар и срещаща редица трудности, е концепцията за target-directed - целеви - (от английски в мишена - цел, цел) лечение на тумори.

На фиг. д ефект на лекарството Herceptin - (производство на Roshe / Швейцария). Създаден на базата на антитела, които могат да блокират HER2 рецепторните протеини.
Потиска развитието на тумора.
Стабилизира състоянието на пациента.
Съкращава периода на химиотерапията.

(Фиг. се увеличава, когато щракнете върху нея с курсора)

Индивидуалните лекарства, създадени да инактивират специфична мишена (протеин) в туморна клетка, са много ефективни и се понасят добре при продължителни курсове на лечение (примери - Gleevec, Iressa).

Вашата лаборатория се занимава с изследване на стратегии за насочване към пътищата на иницииране и прилагане на смъртта на туморни клетки. Докъде стигнахте в решаването на тези проблеми?

Специалисти от нашата лаборатория са установили механизмите на смъртта на туморните клетки под въздействието на нови лекарства, създадени в Русия. По-специално, идентифициран е механизъм, при който е възможно да се заобиколи лекарствената резистентност на туморните клетки: нови химични съединения преодоляват бариерата, която иначе пречи на лекарствата да навлязат в клетката.

В допълнение към изследването на ролята на химичните съединения в препрограмирането на клетките в ракови клетки и смъртта на раковите клетки, вие се занимавате с изясняване на молекулярните механизми на клетъчната смърт. Какво остава неясното за тези механизми? На какви въпроси учените все още трябва да отговорят?

Важно е да разберете как да избегнете индуцирането на апоптоза в нетуморни клетки. Убиването на клетка не е проблем, проблемът е как да защитим една здрава...

Вашата лаборатория работи ли върху изучаването на механизмите на убийствената функция на раковите клетки? Възможно ли е по принцип да се блокира разрушаващата тялото дейност на раковата клетка и нейното въздействие върху нормалните тъкани?

Възможно и необходимо. Оказаха се средства за инактивиране на фактора на туморната некроза, токсин, секретиран от ракова клетка и причиняващ унищожаването на нормалните клетки, един вид ефект на страничен наблюдател. Тези продукти преминават първоначални клинични изпитвания.

Осем години сте работили в САЩ. Какво отличава руския и западния подход в борбата с рака? Известно е, че в САЩ се отделят значителни средства за борба с него и за профилактика на рака. И най-важният резултат от тези мерки е, че смъртността от рак постепенно намалява.
В Русия ситуацията с раковите заболявания остава трудна. Какви мерки могат да обърнат неблагоприятната ситуация?

Западният научен стил се характеризира с желание за задълбочено изследване на механизмите, а не само на явления, пълнота на представянето, благодарение на широки междудисциплинарни връзки и висока конкуренция за създаване на важна научна информация.

Смъртността от рак продължава да бъде глобален проблем, но за някои места ситуацията се е подобрила. Например, има по-малко случаи на рак на стомаха - диетичните условия са се променили, дългосрочното съхранение на храната е станало безопасно с развитието на хладилната индустрия, организирана е пропаганда срещу тютюна - тези обществени мерки наистина носят положителни резултати .
За иновациите в здравеопазване(предимно в областта на лечението на рак). 10 милиарда долара– двойно повече от предвиденото за текущата финансова година.

И ситуацията в Русия може да се подобри чрез обединяване на съвместните усилия на много социални слоеве и, разбира се, с адекватно финансиране на такива сложни и важни задачи.