Morte celular programada. Alexander Shtil
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Resumo de dissertaçãona medicina sobre o tema resistência às drogas mediada pela glicoproteína-P de células tumorais: mecanismos de formação urgente e abordagens para superação
Como um manuscrito
Shtil Alexander Albertovich
RESISTÊNCIA À MEDICAMENTOS DE CÉLULAS TUMORAIS MEDIADAS POR P-GLICOPROTEÍNA: MECANISMOS DE FORMAÇÃO URGENTE E ABORDAGENS PARA SUPERAR
Moscou 2003
O trabalho foi realizado no Centro Russo de Pesquisa do Câncer da Instituição Estatal em homenagem a N.N. Blokhin, Academia Russa de Ciências Médicas, Moscou
Oponentes oficiais:
doutor em Medicina, Professor A.M. Garin,
doutor em Ciências Biológicas, Professor, Cientista Homenageado da Federação Russa A.N. Salrin,
doutor em Ciências Biológicas, Professor N.S. Sergeeva,
Instituição líder: Academia Médica Russa de Educação de Pós-Graduação do Ministério da Saúde da Federação Russa.
A defesa da tese ocorrerá no dia 25 de dezembro de 2003 em reunião do Conselho Científico especializado D.001.017.01 em
RONTS eles. N.N.Blokhin RAMS no endereço: 115478, Moscou, rodovia Kashirskoe, 24.
A tese pode ser encontrada na biblioteca do Centro Russo de Oncologia. N.N.Blokhin RAMS.
Secretário científico do conselho científico especializado
doutor em Ciências Médicas
Yu.V. Shishkin
Características gerais da obra
I. Resistência a múltiplas drogas de células tumorais: mecanismos biológicos e significado em oncologia.
Apesar dos avanços significativos na farmacologia, incluindo o desenvolvimento de tecnologias para a criação de drogas com propriedades esperadas, o sucesso da quimioterapia para tumores é limitado pela característica mais importante dos sistemas vivos - a capacidade de se atualizar com as mudanças no ambiente externo. Um hectare de manifestações dessa elasticidade é o desenvolvimento de resistência das células tumorais aos medicamentos [usados \u200b\u200bna quimioterapia. A prevalência generalizada e o caráter estável e de longo prazo da adaptação das células às influências externas sugerem que a superação da resistência aos medicamentos pode estar associada não apenas à busca por medicamentos mais eficazes: provavelmente não há medicamento para o qual as células não sejam capazes de desenvolver resistência. Somente a elucidação dos mecanismos biológicos de resistência aos diversos tipos de estresse servirá de base para o desenvolvimento de estratégias de superação da resistência aos medicamentos, condição necessária para aumentar a eficácia do tratamento de pacientes com câncer.
A resistência múltipla a medicamentos (MDR) das neoplasias - preservação da viabilidade das células tumorais em resposta à exposição a várias substâncias medicinais - é uma das principais razões para a progressão da doença: o tumor é insensível à quimioterapia, independentemente da combinação de drogas sendo alterada. O fenômeno MDR tem um caráter estável e de longo prazo: os mecanismos de resistência são herdados em gerações celulares. Assim, a MDR é um dos principais fatores na progressão do tumor.
Existem dois tipos principais de resistência celular a toxinas. G.E. primário observada antes da exposição à quimioterapia) a resistência deve-se à expressão de mecanismos de defesa durante a progressão do tumor. Então, ativação
os mecanismos antiapoptóticos que medeiam a resistência a um efetor da imunidade podem estar relacionados à resistência aos medicamentos. A resistência secundária (adquirida) surge em células expostas ao estresse. Antes dessas influências, os mecanismos da planta em tais células são mal expressos ou ausentes; sobrevivendo após o tratamento com uma toxina, as células adquirem resistência a várias substâncias - MDR (Riordan, Ling, 1985). A seleção posterior consolida o fenótipo adquirido em gerações de células.
O mecanismo mais importante da MDR é um acúmulo reduzido de toxinas na célula, devido à excreção de substâncias no meio extracelular. Esse transporte é realizado pela proteína integral da glicoproteína P da membrana plasmática (Pgp) devido à energia de hidrólise de ATP (Juliano e Ling, 1984). "! A Pgp humana é codificada pelo gene MDRI (resistência a múltiplas drogas 1), localizado no cromossomo 7 (Chen et al., 1986) Numerosos dados indicam que um aumento em MDRI e Pgp mRNA é frequentemente um fator na resistência de muitos tipos de tumores ao tratamento (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).
II. Formação de MDR em células tumorais: mecanismos biológicos como alvos de prevenção
É razoável supor que o aumento na quantidade de mRNA de MDRI seja devido à amplificação desse gene. Este mecanismo MDR foi identificado em linhagens de células em cultura que foram submetidas à seleção para sobrevivência na presença de toxinas (Roninson, 1991). No entanto, na análise de tumores humanos, a amplificação do gene MDRI não foi detectada nem em tumores primários nem em neoplasias após o tratamento. A causa provável da MDR clínica é a superexpressão de MDRI e Pgp com uma estrutura de gene inalterada (preservação do número de cópias da sequência de inucleotídeos), ou seja, ativo epigenético! fenótipo. Em culturas de células tumorais humanas, um aumento no nível de mRNA de MDRI e na quantidade de Pgp foi observado após um único tratamento com um medicamento de quimioterapia
eles são diferentes na estrutura química e nos mecanismos de ação (ChaudoBary, Epiphany, 1993). A evidência foi obtida para o acúmulo de MOI 1 mRNA em metástases de rcoma no tecido pulmonar tão cedo quanto 20-50 min após o início da infusão pulmonar intra-operatória com doxorrubicina (Abolhoda et al., 1999). Esses resultados sugerem a possibilidade de ativação epigenética do MDR em experimentos e em situações mentais: um aumento no mRNA MNR 1 e Pgp em tumores pode ocorrer sem amplificação do gene MNR1.
Este tipo de regulação biológica - ativação urgente do fenótipo - considera a indução da transcrição do (s) gene (s) que codificam o fenótipo correspondente e / ou controle pós-transcricional (estabilização de NK, regulação da síntese e funcionamento de proteínas). Em relação ao MDR, este tipo de regulação significa a possibilidade de indução do gene MYR. e Ca2 + intracelular, uteshpsinases ativadas por mitogênio, fator nuclear kappa B (NaKB) Sinalizando para a região gulatória do gene RNR1 e o transcrito fornece ativação da compressão do gene.
O estudo da regulação MDR também tem um aspecto prático fundamental. A inibição desses mecanismos por efeitos farmacológicos e / ou não tóxicos impediria o desenvolvimento de MDR durante a mioterapia.
III. Superando as células tumorais MDR formadas.
Se o bloqueio dos sinais de ativação do gene MYS pode impedir a formação de MDR nas células primárias sensíveis, então tal
a abordagem é inaplicável para superar a resistência já formada. O método tradicional de combate ao MDR secundário é o uso de moduladores Pgp em combinação com citostáticos (Lehne, 2000). No entanto, o uso de inibidores de Pgp é limitado por efeitos colaterais (arritmias cardíacas, desequilíbrio imunológico). É igualmente importante que as combinações efetivas de modulador + citostático possam ser reduzidas pelo bloqueio de pelo menos alguns dos mecanismos de morte celular durante a seleção para MDR.
A superação da MDR formada é alcançável quando duas condições são satisfeitas: 1) a concentração da droga deve ser suficiente para ativar os mecanismos efetores de morte celular, 2) as funções desses mecanismos devem ser preservadas em células com MDR. A primeira condição é atendida se o medicamento cruzar a barreira da Pgp. No entanto, é necessário provar que o alcance da concentração intracelular crítica do agente é suficiente para ativar a morte de uma célula resistente a muitas influências. Os mecanismos de sobrevivência que funcionam nas células resistentes devem servir de alvos para a eliminação destas.
Para a implementação da segunda condição, parece promissora uma abordagem voltada para a lise de células resistentes como mecanismo de indução de sua morte. A vacinação de camundongos com células de mieloma singênico transfectadas com cDNAs de certas citocinas leva ao desenvolvimento de uma resposta imune mediada por linfócitos T citotóxicos (CTLs) e rejeição do tumor inoculado em animais imunizados (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al., 1996). Os CTLs lisam as células com granzima B e perforina. Visto que a granzima B ativa a caspase 3, um dos efetores distais da apoptose, e a perforina causa dano primário à membrana plasmática (necrose), espera-se que os CTLs sejam eficazes se os mecanismos de morte proximal forem bloqueados; desencadeamento de apoptose distal em combinação com necrose
leva à morte de células resistentes a drogas anticâncer - indutoras de morte celular programada.
Formulação do problema
A MDR é um fenômeno clinicamente desfavorável, cuja superação requer conhecimento dos mecanismos de seu desenvolvimento e das formas de realizar a morte celular, devendo investigar ambos os aspectos do problema. Em primeiro lugar, é necessário estudar os mecanismos de formação de MDR em células humanas MDR1 / Pgp-negativas, a investigação desses mecanismos servirá para prevenir o desenvolvimento de resistência em células primárias sensíveis. Em segundo lugar, a análise dos processos de morte que funcionam nas células MDR criará a base para superar a resistência em situações em que se formou MDR secundário.
O objetivo do estudo é estabelecer os mecanismos de formação urgente de [LN em células tumorais humanas e desenvolver abordagens para superar esse inferno de resistência.
1. Otimizar os modelos de formação de MDR em culturas de células tumorais humanas em resposta aos efeitos das drogas quimioterápicas e agonistas e antagonistas experimentais dos mecanismos de sinalização.
2. Determinar o principal mecanismo de desenvolvimento urgente de MDR após o tratamento de células com agentes anticâncer: amplificação do gene MDR, seleção de células Pgp-positivas ou indução de novo MDR.
3. Investigar as vias de transmissão de sinais intracelulares que regulam a ativação de MDR - proteína quinase C, fosfolipase C, Ca2 + intracelular, proteína quinases ativadas por mitogênio, NFkB).
4. Elucidar o papel da ativação transcricional e da regulação pós-transcricional (estabilidade do mRNA) da expressão do gene MDR \\ no desenvolvimento urgente de MDR em resposta à quimioterapia.
5. Desenvolver maneiras de prevenir o desenvolvimento de MDR em células tumorais ao combinar drogas de quimioterapia com bloqueadores das vias de sinalização de ativação de CJF e inibidores da transcrição gênica
6. Estudar a cinética de ativação das cúspides iniciadoras e efetoras, alterações no potencial transmembrana da mitocôndria, clivagem proteolítica da poli (ADP) ribose polimerase, fragmentação internucleossômica do DNA e a integridade da membrana plasmática em células parentais e variantes com MDR após o tratamento com uma droga não transportada pela glicoproteína P.
7. Usar vacinação com células tumorais expressando
citocinas para gerar uma resposta imune contra células MDR. "
Provisões para Defesa.
1. A formação de MDR mediada por Pgp - uma resposta celular urgente a muitas influências - é mediada pela ativação epigenética do gene MZN 1. Essa ativação é devido a vários mecanismos de transmissão de sinal intracelular, indução do promotor do gene e estabilização do mRNA e pode ser evitada por inibidores desses sinais.
2. A superação da MDR mediada por Pgp pode estar associada a um efeito direcionado na membrana plasmática de células resistentes. A Pgp não protege as células de danos à integridade da membrana plasmática - necrose.
Povzna científica
1. Pela primeira vez, o conceito de formação de MDR como uma resposta urgente de uma célula a um estímulo exógeno foi substanciado;
2. Pela primeira vez, o mecanismo de formação de um fenótipo específico de resistência a drogas - MDR mediado por P £ p: ativação epigenética do gene MOR 1 que codifica essa proteína - foi estudado em detalhes.
3. Pela primeira vez, um modelo de ativação urgente do gene MVS foi desenvolvido.
acompanhada pela aquisição de um fenótipo estável mediado por Pgp MDR na cultura de células tumorais humanas; 1. Vias de transdução de sinal, mecanismos de ativação da transcrição e regulação pós-transcricional do gene MOK 1 em células expostas a drogas anticâncer foram identificados. 5. Pela primeira vez, foram caracterizadas as classes de substâncias farmacológicas - bloqueadores da transmissão do sinal intracelular - para prevenir a formação de MDR mediada por Rcr em células tumorais. 5. Pela primeira vez, os mecanismos de morte, funcionando em células com MDR mediada por Pgp, foram investigados, e uma abordagem para superar a resistência foi desenvolvida, que consiste em dano primário à integridade da membrana plasmática.
Valor prático.
1. Desenvolvimento de métodos para prevenir a formação urgente de MDR mediada por Pgp em cultura de células tumorais sob a influência de drogas quimioterápicas.
2. Testes pré-clínicos de vacinas modificadas geneticamente para superar a MDR.
Aprovação do trabalho.
A dissertação foi discutida em 30 de junho de 2003 em uma conferência conjunta de gaboragórios de genética de células tumorais, citogenética com o grupo de genética molecular, oncogenes virais e celulares, endocrinologia molecular, imunidade antitumoral, farmacologia bioquímica, tratamento médico, diagnóstico experimental e bioterapia de tumores; Departamentos de Schmunology, Hematology, Chemotherapy, Clinical Pharmacology, "Shredded Methods of Treatment" N.N.Blokhsha RAMS.
Os principais materiais da dissertação foram apresentados nas seguintes conferências: 2º Simpósio Internacional "Cylostatic Drug Resistance", (K Germany, 1991); Gordon Conference "Advances in Chemotherapy" (NYC London, USA, 1994); Molecular Toxicology (Copper Mountain, EUA, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, EUA, 1996); Nucleic Acids - Integrating Molecular Diagnostics and Therapy (San Diego, EUA, 1996); Conferência anual da American Association of Cancer Research (1994-2001): 6º e 7º Congressos Advances in Oncology, (Hersonissos, Grécia, 2001,2002); "Estruturas e funções do núcleo da célula" (St. Petersburg, 2002), bem como em seminários na Oncotech, Inc. (Irvine, EUA, 1996), The Salk Institute (LaHoya, EUA, 1997), Lee Moffith Cancer Center (Tampa, EUA, 1997), The Jackson Laborati (Bar Harbor, EUA, 1997), Sloan-Catgering Cancer Center, Novo Yo] EUA, 1999), universidades de Copenhagen (2002), Innsbruck (2002) e Gronings! (2003), Moscow State University. MV Lomonosov (2002), Instituto de Pesquisa de Patologia Experimental de Oncologia e Radiobiologia com o nome de M.V. R.E. Kavetsky (Kiev, 2002).
Publicações.
A estrutura e âmbito da tese.
A tese é apresentada em 181 páginas digitadas e consiste na introdução dos capítulos "Revisão da Literatura", "Materiais e Métodos de Pesquisa", "Resultados da Pesquisa" (duas partes), discussão e conclusões. A obra contém 44 figuras 6 tabelas. O material bibliográfico inclui referências a 270 fontes de literatura.
Materiais e métodos de pesquisa.
Animais de laboratório e linhas celulares. Camundongos Balb / c foram usados. Para experimentos de ativação de MDR, linhas de células humanas H9 (leucemia de células T), K562 (leucemia promielocítica), SW<
(câncer de cólon), bem como sublinigo K562Í / S9, em que Pgp é expressa sem seleção de células para resistência a toxinas (Mechetner et al., 1997). Para experimentos para criar imunidade antitumoral, as linhas de mieloma MPC11, J558 e S194 foram usadas. Para obter sublinhas com MDR, foi realizada uma seleção gradual de células MPC11 para resistência à doxorrubicina. As sub-leis independentes MPC1 lDoxlO-1 e MPCllDoxlO-2 proliferaram na presença de doxorrubina 100 nM.
Pesquisa sobre MDR: e RNA MDRI, quantidade e função de Pgp.
Para ativar a MDR, usamos shgozin-1P- E\u003e -arabinofuranosídeo (Cytosar, Ara C), doxorrubicina, vincristina, nocodazol, blsomicina, esfingomielinase, ionóforo Ca2 + A23187, thapsigargina, 2-desoxiglicose A23-0 13-acetato (TFA). Para inibir a ativação do MDR, actinomicina D, a-amanitina, ecteinascidina 743 (ET743), queleritrina, bis-indolilmaleimida I, calfostina C, BAPTA / AM, TMV-8, pthiocarbamato de pirrolidina (PDTK), tosilometil-L-fonil salicilato de sódio, ácido salicílico, PD98095. Os inibidores foram adicionados às células durante 30 minutos. antes de adicionar ativadores. O nível de mRNA MDR \\ nas células foi investigado pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR) com transcrição reversa (Noonan et al., 1990; Shtil et al., 2000) usando os iniciadores: MDRV. direto: 5 "-ССС АТС АТТ GCA ATA GCA GG-3"; reverso: 5 "-GTT CAA ACT TST GCT SST GA-3". Comprimento do produto 167 bp p2-microglobulina: direto: 5 "-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3"; reverso: 5 "-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3". Comprimento do produto 120 bp
A quantidade de Pgp e sua função de transporte foram determinadas por citometria de fluxo com anticorpos monoclonais UIC2 (Mechetner et al., 1997). Anticorpos para IgG de camundongo conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram usados \u200b\u200bcomo anticorpos secundários. Para ensinar Pgp-
o transporte dependente utilizou substratos fluorescentes Pgp-rodamina 123 (em experimentos de indução MDR) (Neyfakh, 1988) e éster acetoximetílico de calceína (em experimentos com células de mieloma) (Holló et al., 1996; Shtü et al., 1999).
Pesquisa de morte celular. A sobrevivência celular na presença de toxinas foi estudada pela redução de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2P-tetrazólio (teste MTT) (Mossman, 1983 ; Sidorova et al., 2002). A anexação V-FITC foi usada para determinar o número de células apoptóticas; células necróticas foram detectadas por iodeto de propídio (PI). O potencial elétrico transmembrana da mitocôndria foi determinado pela fluorescência da sonda JC-1 (Zamzair et al., 1997). Para determinar a fragmentação do DNA genômico, as células foram lisadas em tampão contendo citrato de sódio, NP-40, RNase A e PI; a suspensão foi analisada em um citômetro de fluxo (Shtil et al., 1999; DNA fragmentado foi detectado na região sub-Gl. Para estudar a formação de espécies de oxigênio livre nas células, foi usado éster de diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA), que penetra no citoplasma e fluorescência após a oxidação por metabólitos intracelulares.
A atividade do PCC no citosol e na fração de partícula foi determinada pelo método radioativo por fosforilação da proteína básica da mielina após a lise celular e separação das frações por centrifugação (Shtil et al. 2000).
A atividade das proteínas quinases ativadas por mitogênio ERK1 / 2 e JNK1 foi determinada por fosforilação de substratos específicos (proteína básica de mielina e c-Jun) após lise celular e imunoprecipitação de quinases (et al., 1996).
Plasmídeos repórter, vetores de expressão, transfecção.
As células K562 e B \\ V620 foram trafegadas com um plasmídeo carregando uma região do promotor troximal do gene MOL 1 -1202 / + 118 nt. em relação ao local de iniciação da transcrição, clonado no vetor pOB2b. Luciferase Pge / 1y atuou como repórter Selcom. Para testar a ingenuidade de transativação de NaKB, as células foram trafetadas com uma estrutura de sonor promotor-repórter tendo locais de ligação de RTKB (5xNaKB-lociferase). Para hormonar a atividade da luciferase, as células foram simultaneamente injetadas com shazmida, que carrega a luciferase de Reinida sob o controle do promotor 8V40. No veneno dos experimentos, a atividade da luciferase Pne] \\ y foi atribuída à concentração de proteína total nas células transfectadas. Para a transfecção, usamos cpofecini ou lipofectamina, bem como um gene gun (para células de mieloma) KahlichleV1 cb e [a!., 1996). Vetores que expressam a submídia p50 e p65 ^ kB sob o controle do promotor BU40 foram usados \u200b\u200bpara cotransfecção com schasmida 1202 / + 118-luciferase A atividade das luciferases em células 1 foi investigada pelo método quimi-minescente.
Imunização de camundongos. As células MPC11 e sub-linha com MDR foram irradiadas (40 ~ p), presas com um plasmídeo carregando o cDNA do fator estimulador de granulócito-macrófago-solonia (GM-CSF) e injetadas em camundongos (1,5x105 anos por animal) por via subcutânea. Os camundongos de controle foram injetados com o mesmo número de células irradiadas transfectadas com o vetor sem inserção. Após 7 dias, células frescas foram irradiadas e presas com um plasmídeo contendo DNA de [interleucina-12 (IL-12) ou células irradiadas transfectadas com um shazmid sem inserção (controle). Mais 7 dias (apenas 14 dias após a vacinação precoce), os animais foram inoculados com células frescas por via subcutânea (10e por cabeça) (Tisheg et al., 1998).
Atividade CTL em uma cultura mista com células de mieloma. O baço foi removido 11 dias após a injeção das células de mieloma transfectadas com IL-2 nos ratos. Os esplenócitos foram cultivados por 5 dias a 37 ° C, 5%
CO2 com células recentemente irradiadas da linha usada para imunização. Em seguida, células de mieloma frescas foram carregadas com 51Cr (células alvo CTL). A atividade CTL foi avaliada pela liberação de mSg no meio após a incubação com os alvos. Para inibir o processamento da perforina, os baços foram incubados com concanamicina A e depois com alvos (Kataok et al., 1996).
Resultados da pesquisa
Ativação urgente de MDR mediado por Pgp.
I-RNA MDRI se acumula nas células em resposta aos efeitos de drogas anticâncer (Chaudhary, Roninson, 1993). Para esclarecer se este efeito está associado à seleção de células Pgp-positivas ou à indução de MDR, foram realizados experimentos em células H9 MES / Pgp-negativas. As células foram tratadas com Ara C, um fármaco Pgp não transportado usado em pacientes com câncer de mama e neoplasias hematológicas. A expressão de MDR \\ em células não tratadas não foi detectada após 25 ciclos de PCR, enquanto em células tratadas com Ara C, um aumento no mRNA de MDRI foi observado após 3-6 horas. impacto (Fig. 1, A). Um aumento no mRNA de MDRI pode ser observado ainda mais rápido - após 1 hora de exposição, a concentração de citosar pode ser aumentada para 75 μM. O aumento no mRNA de MDRI persiste em células que sobreviveram a uma única exposição ao Ara C por pelo menos 6 semanas.
Além disso, foi investigado se a quantidade de Pgp aumentou em paralelo com o acúmulo de mRNA de MDRI. Na fig. 1b mostra que as células tratadas com Ara C expressam Pgp. É importante que a exposição ao Ara C cause um deslocamento para a direita de toda a população, o que indica que quase todas as células em cultura são capazes de acumular Pgp. As células tratadas com Ara C expressam Pgp funcionalmente ativa: nessas células, a eliminação
a rodamina 123 é mais intensa do que em células intactas; o efeito é removido por verapamil, um bloqueador de transporte dependente de Pgp.
О 1 3 6 10 16 24 HORAS.
fluorescência (Ig) -
Figura 1. O aumento no mRNA MDRX e Pgp após uma única exposição a Ara C. A: Células H9 foram tratadas com 10 μM Ara C. MDR1 e mRNA p2-microglobulina (B2M) foi determinado por PCR após a transcrição reversa. B: as células foram tratadas com 10 μM de Ara C por 24 horas (nieu<яя панель). Контроль - необработанные клетки (верхняя панель). Таким образом, накопление иРНК MDR\ наблюдается в течение первых
ases de exposição a um agente não transportado pela Pgp. Significa que
o mecanismo mais provável desse efeito é a indução do fenótipo,
não seleção de células resistentes "preexistentes".
Na fig. 2 mostra a dependência da sobrevivência celular da concentração de vincristina, um medicamento quimioterápico transportado pela Pgp. Células sobreviventes
Figura: 2. Uma única exposição ao tsptosar leva à formação de uma droga transportada por Pgp de forma estável.
As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C por 24 horas, ressuspensas em meio fresco e incubadas por 12 dias. Após a restauração do crescimento logarítmico das células, sua sensibilidade à vincristina foi estudada em comparação com células não tratadas com citosar (controle). Resultados de 4 experimentos (teste MTT)
Assim, uma única exposição a um medicamento de quimioterapia não transportado por Pgp em células Pgp-negativas leva a um rápido - dentro de um ciclo celular - acúmulo de gene de mRNA MDRI funcionalmente competente Pgp e, mais importante, o desenvolvimento de resistência ao agente transportado por Pgp. Células principalmente sensíveis adquirem mediada por Pgp MDR. O mecanismo desse fenômeno não é a seleção de células Pgp-positivas, mas a ativação do fenótipo de novo. Como é a formação da Pgp mediada! MDR: ambos os mecanismos funcionam devido à ativação da transcrição do gene MDRX ou estabilização do mRNA?
Nos experimentos mostrados na Fig. 3, as células H9 foram tratadas com Ara C na presença de inibidores da transcrição - actinomicina D, a-amanitina e ecteinascidina 743 (ET743). Todos os inibidores investigados impediram o aumento induzido por Ara C nos níveis de mRNA de MDRI.
Figura: 3. Os inibidores da transcrição evitam o acúmulo de RNA MDR1. As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C por 24 h. sem ou na presença de actinomicina D, a-amanitina ou ET743. Os resultados de 3 experimentos são resumidos.
Para estudar a meia-vida (estabilidade) das células de mRNA foram tratadas com Ara C por 10 horas. e transferido para meio fresco ou meio com actinomicina D e incubado por mais 36 horas. Em células não tratadas, o mRNA de MDRI revelou ter vida curta: sua meia-vida era de aproximadamente 30 minutos. O tratamento com Ara C estendeu a meia-vida do mRNA para 6 horas. Assim, o acúmulo de mRNA MDRI e, consequentemente, o desenvolvimento de MDR mediado por Pgp em resposta ao estresse citotóxico, são causados \u200b\u200bnão apenas pela ativação da transcrição MDR1, mas também pela estabilização do mRNA desse gene.
Mecanismos de sinalização intracelular na ativação MDR A Fig. 4 mostra que um único tratamento de células H9 com TFA, um agonista de PKC, levou à indução do gene MDRI. Os inibidores de PKC específicos - queleritrina, calfostina C e bis-indolilmaleimida I - impediram a ativação de MDR / éster de forbol e quimioterapia. Semelhante
os dados foram obtidos em células K562 tratadas com Ara C, doxorrubicina ou TFA na presença dos inibidores de PKC indicados.
Figura: 4. Os inibidores de PCL impedem a indução de MDRI. As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C por 16 horas. sem ou na presença de inibidores de PKC. Os resultados de 3 experiências são resumidos.
Assim, PKD é importante para a regulação de MDRI (e, portanto, do fenótipo MJI, este gene pode ser induzido por um agonista de PKD, e os inibidores de PKD evitam a ativação de MDRI por drogas anticâncer.
O agonista fisiológico de PKC é o diacilglicerol (DAT), que é formado durante a hidrólise de fosfatidilinositol-4,5-difosfato (FIG) pela fosfolipase C específica de fosfatidilinositol e / ou durante a decomposição de fosfatidilcolina sob a ação de um fosfolipídeo específico de fosfatidilinositol, 1984. A ativação de MDRI induzida por Ara C ou doxorrubicina pode ser bloqueada por sulfato de neomicina e U73122, inibidores da fosfolipase C específica de fosfatidilinositol (Fig. 5). A ativação de MDRI por éster de forbol é insensível ao sulfato de neomicina e U73122 porque o TFA é um agonista direto de PCD, e esta quinase funciona distalmente à fosfolipase C. Inibição de específico de fosfatidilcolina
a yusfolipase C (preparação B609) não alterou a expressão de MOF 1 (Fig. 5). Esses resultados indicam a importância da hidrólise de PI2 pela fosfolipazona C específica de yusfatidilinosengol na ativação de MOF 1.
Figura: 5. Inibidores de fosfolipases C na indução de MDR \\.
As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C por 16 h. sem ou na presença de sulfato de neomicina, U73122 ou D609. Os resultados de 3 experiências são resumidos.
A fosfolipase C cliva PI2 em DAP e PIs. O primeiro produto ativa o LCP, o segundo aumenta o nível de Ca2 + intracelular devido à sua mobilização do retículo ezoplasmático. O papel do Ca2 + intracelular na indução de MDRI foi comprovado pela capacidade do ionóforo específico de Ca2 + A23187 e da tapsigargina, um inibidor de Ca2 + -ATPases, de ativar esse gene; o quelante específico Ca2 + BAPTA / AM evitou a indução de MDR1 por quimioterapia e TPA (Fig. 6).
1 2 3 4 5 v 7 8 E 10 11 12 14 14 15 1617 18 19 Rns. b. O papel do Ca2 + intracelular na indução (NA) R1.
As células H9 foram tratadas com indutores MOI \\ 16 h. sozinho ou na presença do quelante de cálcio BARTA / AM. Pistas: células 1 não tratadas, 2,3-A23187; 4,5-
thapsigargin; 6,7-AgaC; 8,9-doxorrubicina; 10,11-bleomicina; 12,13-2-desoxiglicose; 14,15-nocodazol; 16,17-esfingomielinase; 18,19-TFA. Trilhas pares: o indutor é ímpar (exceto para 1): o indutor é "-5 µM VARTA / AM.
Para elucidar a participação do Ca2 + intra e extracelular na ativação do MDR, duas séries de experimentos foram realizadas. Primeiramente, a ativação do gene foi estudada sob as condições de incubação de células em meio sem Ca2 +. A remoção do Ca2 + extracelular não interferiu na ativação da MDRI por quimioterapia e TPA. Em segundo lugar, o agente TMB-8, que impede a entrada de Ca2 + nas células e não altera a concentração de Ca2 + intracelular, não afetou a indução de MDRI. Assim, o cálcio intracelular, mas não extracelular, é necessário para a ativação do MDRX. Os experimentos acima comprovam o papel fundamental das vias de sinalização da fosfolipase C-\u003e DAG- * PKC e PI3-\u003e Ca2 + na ativação do gene MDRX por várias substâncias, incluindo drogas quimioterápicas.
No entanto, o PCD não é um mecanismo universal para ativar o MDR. A atividade PKC em células tratadas com indutores MDRX separados é diferente. T< активирует ПКС, Ara С не оказывает существенного влияния на активность этой киназы, а церамид - вторичный мессенджер, накапливающийся в обработанных химиопрепаратами клетках (Bose et al., 1995), ингибирует ее (табл. 1).
"Tabela 1. Efeitos dos indutores do gene MDRI na atividade de PKC.
Atividade de processamento PCL, pmol / mg proteína / min.
fração de partícula de citosol
Controle 119 ± 13 59 + 9
TFA, UNM 47 + 10 * 153 + 14 *
Ara C, 25 μM 143 + 16 65 + 10
Ceramida, 1 μM 138 + 15 27 + 8 *
Ceramida, YumkM 83 + 15 * 15 + 7 *
* R<0,05 в сравнении с контролем (необработанные клетки). Данные 6 опытов.
Os inibidores de PKC quelerigrina e bis-indolnlmaleimida I impediram a ativação de MDR \\ Ara C, doceorubicina e TPA, mas não ceramida (Fig. 7). Portanto, a ativação de PKD não é um pré-requisito para a indução do gene MDRX. Alguns agentes (por exemplo, ceramvd) ativam mecanismos de sinalização independentes de PKL ou atuam distalmente a PKL.
Figura: 7. Ceramnd ativa MDR \\ independentemente da injeção do PCS.
As células H9 foram tratadas com 25 μM C2-ceramida por 24 horas. sozinho ou na presença de inibidores de PKC. Controle da eficácia dos inibidores - bloqueio da ativação de MDR \\ quando exposto a 10 μM de citosar.
As proteínas quinases ativadas por mitógenos podem ser esses mecanismos. A doxorrubicina e Ara C em concentrações que ativam MDR \\ aumentaram a atividade de JNK1, mas não ERK1 / 2, enquanto o TPA ativou ERK1 / 2 e a atividade de JNK1 não se alterou (Fig. 8). De acordo com esses dados, o inibidor ERKI / 2 PD98059 aboliu a ativação da MDRI por TFA, mas não por quimioterapia. Assim, proteínas quinases ativadas por mitogênio são o nível de divergência dos sinais de ativação de MDR1 gerados por diferentes substâncias.
Ativação de MAP quinase por doxorrubicina e TPA
Figura: 8. Ativação diferencial de MAP-knnases por indutores MDR1. As células H9 foram tratadas com doxorrubicina e TFA. As atividades ERK1 / 2 e JNK1 foram determinadas após imunoprecipitação e substratos fosforilados. Os efeitos dos indutores são expressos como o nível de ativação de cada quinase em comparação com as células não tratadas, nas quais a atividade é considerada como 1. Os dados de 3 experimentos são resumidos.
O fator transcrítico NFkB é um mecanismo de resposta rápida das células a estímulos externos (Karin, 1995). Em uma célula em repouso, essa proteína está no citoplasma em um complexo com uma subunidade inibitória; em resposta ao efeito do NFkB, ele se dissocia do complexo, transportado para o núcleo, e ativa o gene cujas regiões regulatórias têm sítios de ligação ao NFkB. Os inibidores de NFkB PDTK, TPHMK e salicilatos impediram a ativação de MDRX pelo citosar, doxorrubicina e TPA (Fig. 9). É especialmente importante que os medicamentos salicylap amplamente usados \u200b\u200bna clínica sejam bloqueadores eficazes da ativação urgente de IADM. Além disso, o salicilato de sódio cancelou a ativação a longo prazo (até 7 dias) do MDRX pelo citosar (Fig. 10), confirmada; o valor de NFkB como um mecanismo de ativação MDR.
Figura: 9. Prevenção da indução de MDR1 por inibidores de NFkB. As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C, 5 μM de doxorrubicina ou 10 nM de TFA por 16 horas. sozinho ou na presença de inibidores da ativação de NFkB. Os resultados de 4 experimentos são resumidos.
4, lavar
L ha C - + + ----
salicilato - - + \\ s 5 7
dias sem Agas
Figura: 10. Efeito de longo prazo do saltlato de sódio como um inibidor da indução de MDRI.
As células H9 foram tratadas com 10 μM de Ara C por 48 horas. separadamente ou na presença de salicilato de sódio, ressuspenso em meio fresco e incubado por mais 1-7 dias.
A importância de se estabelecer o papel do NkB reside também no fato de que este mecanismo "une" eventos citoplasmáticos e nucleares na ativação do gene MON1, conexão esta confirmada por experimentos de ativação do promotor do gene; AYUSH exógeno No. kV. A co-transfecção das subunidades p50 e p65 OTcV levou à ativação da região -1202 / + 118 nt. o promotor AYuSh (Fig. 11). No entanto, na região indicada, a sequência canônica 5 "-COOIM ^ YUSS-3" (R-qualquer base de purina, al-qualquer pirimidina) para interação com NiKB ou sequências homólogas não foi encontrada. As seguintes suposições são possíveis: 1) NaKB interage com uma sequência não identificada na região -1202 / + 118 i.i. 2) O NaKB ativa um ou mais genes intermediários, cujo produto se liga à região -1202 / + 118 nt. e induz o promotor MDR1.
Figura: 11. NFkB - ativador do promotor MDR \\.
As células K562 foram transfectadas com as construções indicadas e um plasmídeo portador da luciferase de Renilla sob o promotor SV40. Atividade de luciferase de vagalume refletindo a indução da região -1202 / + 118 nt do promotor MDRX (designado como MDF normalizado para atividade de luciferase de Renilla.
Regulação do promotor do gene MDR1.
As vias para a transmissão de sinais ativadores de L / L\u003e L1 devem ter um "ponto de convergência" comum - a região reguladora do gene e do mRNA. Para estudar o promotor IADM, utilizamos fármacos que modulam o estado físico-químico da cromatina - inibidores das histona desacetilases tricostatina A e butirato de sódio, representantes das classes de quimioterápicos reguladores diretos da transcrição gênica. É importante comparar o mecanismo de ativação MDR por esses agentes e Ara C e doxorrubicina, drogas para as quais a cromatina não é um alvo direto. A tricostatina A e o butirato de sódio ativam o gene endógeno MDRX nas células H9, K562 e SW620. O aumento no mRNA (Fig. 12, painel esquerdo) foi acompanhado pela ativação da luciferase transcrita do local -1202M18 pb. o promotor MDRI (Fig. 12, painel direito).
Figura: 12. Os inibidores de histona desacetilases induzem o gene e promotor MDRX endógeno (transfecção transitória).
Slash, células H9, K562 e SW620 foram tratadas com as preparações indicadas por 24 horas. O nível de mRNA de MDRX foi investigado no GTCR. Direita: as células K562 foram transfectadas com a construção -1202 / + P8 ns-luciferase. Após 24 horas. as células são estimuladas com essas drogas por 16 horas. Os resultados de 3 experimentos são apresentados.
Verificou-se que a tricostatina A e o butirato ativam a IADM devido à interação do fator de transcrição NF-Y com uma caixa XAAT invertida (Jin, Scolto, 1998), o que confirma a cadeia de eventos "indutor - modificação da cromatina -\u003e ativação do promotor IADM". No entanto, sob condições de "transfecção de cinto", a cromatina no plasmídeo permanece "imperfeita".
Para estudar o papel da cromatina na indução de MDRI, as células SW620 foram transfectadas com a construção de luciferase -1202 / + 118 np-Firefly e um plasmídeo contendo o neo; em seguida, as células foram selecionadas para sobrevivência na presença de neomicina. Em seletivos, como na transfecção transitória, a tricostatina A e o butirato de sódio causaram o acúmulo de mRNA endógeno de MDRI e induziu a transcrição da região -1202 / + 118 ir. o promotor deste gene. A ativação da MDRI por inibidores da histona desacetilase foi abolida pelo ET743, um bloqueador transcricional. Isso demonstra uma relação direta entre o aumento da quantidade de mRNA MDRI e a ativação do promotor desse gene por meio da acetilação da cromatina.
Esses dados foram obtidos sob a ação de agentes sobre as células que alteram diretamente o estado físico-químico da cromatina. O mecanismo é sempre identificado, uma vez que nem todos os quimioterápicos (e outros estímulos exógenos) são reguladores diretos da cromatina? Notamos que a meia-vida: mRNA de MDRI é aumentada em células tratadas com Ara C e TPA. Figura 1: mostra que TFA e tricostatina A são indutores potentes da atividade do promotor (transcrição) de MDRI, enquanto nem Ara C, nem doxorrubicina, nem ceramida ativaram o promotor ou causaram apenas um efeito fraco.
Figura: 13. Efeitos de ativadores MDR na indução do promotor MDRI. As células K562 foram transfectadas com a construção de luciferase -1202 / + 118 np-Firefly, divididas em partes iguais e estimuladas durante 16 horas. os medicamentos indicados.
A atividade da luciferase em células não tratadas, normalizada para o teor de proteína total em lisados \u200b\u200bcelulares, foi considerada como 1. Os resultados foram reproduzidos em 3 experiências.
Esses resultados sugerem que um aumento no nível de mRNA A / III1 ocorre tanto como resultado da ativação da transcrição (TPA, tricostatina A), e sem indução direta do promotor (citosar, doxorrubicina, ceramida). No último caso, os mecanismos de estabilização do mRNA ou a ativação de um gene intermediário, cujo produto induz o promotor MIEX ou estabiliza o transcrito, devem ser reconhecidos (ver experimentos com NKB exógeno).
Tabela 2. Inibidores dos mecanismos de sinalização que impedem a ativação urgente do gene cntosprom MF1.
Concentração inibitória do alvo intracelular da droga
queleritrina PKS 10 μM
calfostina C PKS 1 μM
bis-indolil-
maleimida I PKS 5 μM
VARTA / AM Ca2 + 5 μM
PDTC No. kV 5 μM
GFKhMK No.kV 25 μM
salicilato de sódio No.kV 20 mM
yutirin No. kV 10 mM
zieethers de plasma superior
membrana de ácido graxo? Yumkg / ml
Alongamento do transcrito 1KTSHGOMISCHSH B? 500-1000 ng / ml
x-amanitina RNA polimerase II 9 μg / ml
zheinascischsh 743 não estabelecido 100 nM
A Tabela 2 mostra os agentes farmacológicos que representam os grupos de inibidores de transdução de sinal que impedem a ativação de MDR \\ cygozar ou doxorrubicina em células de leucemia H9 e K562.
Superando MDR mediado por Pgp: a membrana plasmática é direcionada
ação citotóxica.
Assim, o MDR mediado por Pgp pode ser formado rapidamente durante uma divisão celular e persistir em gerações de células sobreviventes. Muitos estímulos são indutores de MDR, incluindo drogas anticâncer de diferentes grupos químicos usados \u200b\u200bna clínica. Pgp é uma ode de mecanismos que evitam a ativação da morte programada (apopto (Johnstone et al., 1999). Portanto, um tumor com resistência primária a estímulos apoptogênicos e adquirindo MDR rapidamente em resposta ao tratamento é um desafio particular para a terapia. Quais são as estratégias para superar a resistência multifatorial?
A morte dessas células sob a ação de efetores da imunidade tem sido estudada. O pré-requisito para esta abordagem foram os dados sobre a rejeição do mieloma inoculado por esplenocigomas, que se acumulam durante a vacinação de camundongos; o mesmo tumor, modificado para expressar citocinas (Turner et al., 1996). Uma vez que as propriedades das sub-linhas MPC1 IDoxlO-1 e MPC1 1Dox10-2 se revelaram semelhantes, as células MPCllDoxlO-1 são analisadas abaixo.
O fenótipo MDR em seletivos foi caracterizado pela superexpressão do gene mdrVo, diminuição do transporte de calceína e resistência à doxorrubicina vincristina, um substrato da Pgp. Para criar imunidade ao enxerto de mielol, as células MPC11 e MPCI IDoxlO-1 foram transfectadas com cDNA de citocinas GM-KS IL-12. O número de células inoculadas foi cinco vezes maior do que a dose tumorigênica de 100% mínima.
Tabela 3. Frequência de rejeição do tumor no controle e
animais imunizados.
Vacinação de Rato
MPC11 MPCllDoxlO-1
Intacto 0/15 * 0/10
Imunização com células MPC11:
células irradiadas 1/15 0/10
■ Células transfectadas com M-CSF / IL-12 15/15 ** 9/10 **
Imunização com células MPC1 Schox10-1:
células irradiadas 0/15 0/10
"Células transfectadas com M-CSF / IL-12 9/10 ** 10/10 **
Taxa de rejeição do tumor: no numerador - o número de camundongos que não desenvolveram tumor; em 1 substituto - o número total de camundongos inoculados, ** Р<0,001 по критерию х2 в сравнении с еиммунизированными (интактными и вакцинированными только облученными клетками) ивотными.
A Tabela 3 mostra que as células MPC11 e MPC1 IDoxIO são tumorigênicas: em 100% dos animais não imunizados, os tumores apareceram 8-10 dias após a inoculação das células correspondentes. No entanto, em camundongos imunizados com outras células que expressam citocinas, os tumores não apareceram (inoculação com MPC11) ou eram raros (inoculação com uma linhagem resistente). A imunidade antitumoral provou ser de longa duração: os tumores não apareceram dentro de 5 semanas após a inoculação de células frescas. A taxa de rejeição das células enxertadas foi semelhante nos grupos imunizados com células MPC 11 e a sub-linha resistente. Esses resultados indicam a possibilidade de morte de células malignas resistentes quando expostas ao (s) fator (es) encontrado (s) em experimentos in vivo.
Este fator são os CTLs gerados no baço em resposta à imunização por células que expressam citoes. Na fig. 14 mostra que os esplenócitos de camundongos imunizados com células MPC 11 que expressam outro GM-CSF e IL-12 lisaram células alvo MPC 11 e MPCllDoxlO-1 com quase a mesma eficiência (Fig. 14).
-ér-MPCU / \u200b\u200bMPCJlDoilO
MRS11 / MRSI
effectorG.Mission
Figura: 14. Lise de CTLs de células parentais e Pgp-positivas.
Numerador: células a serem imunizadas, denominador: células a serem inoculadas.
Portanto, a imunidade antitumoral em animais vacinados com uma vacina de células que expressam citocinas está associada à sensibilidade das células MDR à ação lógica dos CTLs.
A atividade killer dos CTLs é devida à secreção do ligante CD95 / Fas e / ou granzima B-perforina em tandem por essas células (Vetke, 1994). Para resolver a questão de qual destes mecanismos funciona no sistema em estudo, foi estudada a sobrevivência das células na presença do ligando Fas. As células MPC11 e MPC1 Shox10-1 eram resistentes mesmo a concentrações relativamente elevadas do ligando Fas. Assim, a granzima B / perforina deve ser considerada candidata ao papel do mecanismo de ação citotóxica dos UTJs imunes. Na verdade, a pré-incubação de imuno] CTL com concanamicina A, um inibidor do processamento de perforina, diminuiu a lise das células alvo MPCllDoxl 0-1 (Fig. 15).
Para a busca de formas de superar a MDR, é importante que os sublinhados com MJB mantenham a sensibilidade à ação citotóxica devido ao rompimento da integridade da membrana plasmática pela perforina. A penetração da granzima B na célula através dos poros da membrana plasmática formada pela perforina levará à ativação de caspases efecgóricas. Dachshund
killer tandem - a ação simultânea de um agente que forma poros na membrana externa e a protease - permite que você cause a morte de células resistentes a uma série de influências externas. Consequentemente, a membrana plasmática é um alvo importante para a terapia que visa eliminar as células resistentes.
t; co k) o o o
n (o n ii) o o
efetor: alvo
Figura: 15. Granznm B / psrforin - o mecanismo de morte mediada por CTL. A concanamicina A (barras abertas) reduz a lise mediada por CTL de células MPC1 Schox10-1. Barras escuras - lise de alvos CTL sem pré-incubação com concanamicina A. É apresentada uma de 3 experiências representativas.
Zerschid e radicais livres de oxigênio na superação da MDR. Se a membrana plasmática é o alvo desejado, como pode ser danificada? É especialmente desejável que tal efeito seja exercido por um ator comum a muitos medicamentos anticâncer. Um desses "intermediários" é ceramvd. Para que a ceramida seja eficaz no tratamento da MDR, ela deve atender a pelo menos dois requisitos :;) não ser transportada para fora da célula pela Pgp; 2) desencadeiam vias de morte que funcionam em células resistentes. É suficiente "contornar" o transportador transmembrana, o principal mecanismo de MDR, para induzir a perda de células que são resistentes a uma série de influências?
A ceramida não é transportada pela P-hpicoproteína.
Como a ceramida se acumula em resposta à exposição a uma série de drogas quimioterápicas, investigamos se esse metabólito atende a essas condições. Descobriu-se que a cinética de acumulação de ceramida nas células K562 parentais e sua sub-linha K5621 / 89 Pgp-positiva é praticamente a mesma (Fig. 16). Ao mesmo tempo, as células K562-D9 acumularam significativamente menos rodamina 123 do que as células K562 (controle do transporte mediado por Pgp). Portanto, ceramida não é um substrato de transporte para Pgp.
8000 6000 4000 2000 0
0 0,05 0,2 1 5 C5-BOO! RU-ceramida
Figura: 16. Pgp não transporta ceramida de cadeia curta. As células K562 e K5621 / 59 foram incubadas durante 30 min. com C5-ceramida conjugada com fluorocromo VSYu1RU (painel superior) ou rodamina (R1) 123 (painel inferior). A luminescência celular foi investigada por citometria de fluxo. Dados de 3 experimentos.
Não houve diferenças na citotoxicidade das ceramidas sintéticas (C2) e naturais (Cu) para as células K562 e K5621 / 89, bem como para os casais
células parentais e selecionantes: MCP-7 e MCP-7Ac1g, KV-3-1 e KV-8-5-11. Assim, a ceramida causa a morte de células Pgp-negativas e Pgp-positivas com igual eficiência.
não interfere na violação da integridade da membrana plasmática.
Para identificar os mecanismos de morte celular K5621 / 59 sob a ação da ceramida, os seguintes parâmetros foram estudados: ativação das caspases 9 e 3, clivagem da poli-ADP-ribose polimerase (PAKP), degradação internucleossômica do DNA, translocação intramembrana de fosfatidilserina, (por ligação de anexina V), transmembrana potencial mitocondrial e integridade da membrana plasmática (por incorporação de IP nas células). Na fig. 17 mostra isso em 24 horas. exposição à ceramida, a porcentagem de células mortas atingiu 37 + 4%. O surgimento de células "duplamente positivas" (anexina ^ PI4) revelou-se especialmente importante, o que significa que a ceramida nas células K562LB9 causa ruptura precoce da permeabilidade da membrana plasmática (necrose ou apoptose tardia). Ao mesmo tempo, a ativação da caspase 3, característica da apoptose clássica, não foi revelada; proteólise de RAS\u003e foi um evento tardio (48 horas de exposição).
O efeito da ceramida nas células K5621 / B9 praticamente não foi acompanhado por uma alteração no potencial transmembranar das mitocôndrias: este indicador nas células moribundas não diferia do valor correspondente nas células não tratadas. A fragmentação internucleossômica do DNA também não foi um dos principais sinais de morte: apenas cerca de 11% dos eventos ocorreram na região sub-01 (células hipodiplóides), enquanto a porcentagem de células morrendo (soma de anexina + / PI ", anexina7PI + e duplo positivo) com a mesma duração Assim, o sinal mais importante da morte das células K562LB9 sob a ação da ceramida é uma violação precoce da integridade da membrana plasmática - necrose.
tempo (hora) com ceramida
■ K562, anexina + □ K562, anexina + PI + BK562i / S9, nH +
IK562.PI + V K562i / S9, AHHeKCHH + ■ K562 | 789, anexina + PI +
Figura: 17. Indicadores de morte das células K562 e K562L / S9 sob a influência da ceramida. As células foram tratadas com 25 μM C2-ceramida nos intervalos de tempo indicados. A porcentagem de anexação de células V-positivas, iodeto de propídio (PI +) - positivas e "duplamente positivas" (anexina + PI +) foi determinada por citometria de fluxo.
Em células K562, p53 não funciona, e a proteína quinase quimérica Bsr / Ab1 é expressa, isto é, essas células contêm determinantes moleculares de resistência à apoptose. Portanto, a sublinha K562i / S9 pode ser considerada um modelo de resistência pleiotrópica, onde a Pgp é um dos mecanismos. Mais importante ainda são os dados sobre a capacidade da ceramida de causar a morte! tais células pelo mecanismo de necrose.
Os radicais livres de oxigênio podem ser metabólitos que podem causar necrose. Para estabelecer seu papel na morte induzida por ceramidina de células K562 / iS9, a citotoxicidade da ceramida na presença de N acetilcisteína (NAC), um quelante de radical de oxigênio, foi estudada, e a cinética de formação de radical de oxigênio em células tratadas com ceramida foi estudada. B A Fig. 18 mostra que o NAC aboliu a citotoxicidade da ceramida. Assim, o oxigênio livre desempenha um papel decisivo na morte das células resistentes * quando expostas à ceramida. A Figura 19 mostra a dependência
a luorescência de células carregadas com OSROA a partir do momento de ação da ceramida e
"Um agente de controle - peróxido de hidrogênio, um doador de O2." H2O2 causou um rápido
depois de 20 minutos. - aumento da fluorescência das células. Ceramida causada
efeito yuopposite: após 15 min. o impacto foi observado de forma nítida - em 1,5
Linha - reduzindo o brilho. Apenas por 24 horas. intensidade de processamento
guorescência celular voltou ao nível deste indicador em
células tratadas e aumentou 48-72 horas. impacto quando a quantidade
o número de células amassadas já era grande (Fig. 17). Portanto, em processado
células ramidas, a redução ocorre inicialmente e a oxidação
ocorre posteriormente, provavelmente em decorrência do esgotamento dos recursos para a restauração dos substratos uricelulares.
Fig. 18. NAC bloqueia a morte de células K562i / S9. As células foram tratadas com Cr-ceramida sem ou com 5 mM de NAC. O NAC sozinho não afetou a viabilidade celular.
Figura: 19. Oxidação em células K562 | / 89 sob a ação da ceramida. As células foram tratadas com 25 μM C2-ceramida para os intervalos de tempo indicados. A oxidação intracelular foi estudada pela mudança na fluorescência das células, carregamos E\u003e CGOA. H2Og foi usado como um controle para a "explosão de oxigênio". Os resultados de 3 experimentos são resumidos.
A discussão dos resultados
A análise dos mecanismos de ativação do gene MOI1 permite afirmar o seguinte: 1) O gene ALM e o fenótipo MDR podem ser induzidos por exposição de curto prazo a muitas substâncias. A superexpressão de MBN \\ e o acúmulo de Pgp são detectados nas células que sobreviveram após o término! exposição a xenobióticos. Assim, a ativação epigenética do gene MYR fornece um fenótipo MDR estável.
2) A formação urgente de MDR é regulada pelos mecanismos gerais de sinalização da célula. De fato, ativação de fosfolipases, mobilização de Ca2 + intracelular, indução de NaKB e cascatas de proteínas quinases ativadas por estresse são os mecanismos que garantem a resposta celular ao estresse. Além disso, fatores de transcrição e locais funcionalmente ativos em
os ipoMOTopes do gene MDR1, que são importantes para a ativação do MDR, não são exclusivos deste eno: JF-Y, CCAAT box e sinais moduladores da cromatina são importantes para a regulação da transcrição da maioria dos genes eucarióticos. Isso, aparentemente, explica a alta indutibilidade do gene MDRX: esse gene é ativado por estímulos de pesticidas em células de diferentes histogêneses. Por sua vez, a regulação de MDRX por mecanismos comuns de realização de estresse enfatiza a importância iviológica da ativação de MDR, junto com outras reações do entalhe a influências exógenas.
3) A multiplicidade e intercambialidade dos mecanismos de ativação de MDR III.20) são determinadas pela natureza multinível da regulação deste fenótipo. em cada um desses níveis, a célula tem a oportunidade de “escolher” a ativação do MDR. Em primeiro lugar, a escolha é ditada pela natureza do estímulo (entidades diferentes agem por meio de mecanismos diferentes). Em segundo lugar, o mecanismo específico depende da presença de certas moléculas de sinalização e da sua interação em células deste tipo. Em terceiro lugar, a escolha ocorre ao nível dos mecanismos de inscrição reais (o estado da cromatina na região do promotor DRI). A partir destas considerações, é claro que as razões para a alta indutibilidade em MDRX (ampla intercambialidade e intercruzamento de sinalização e mecanismos de transcrição fornecem indução por muitas imulas e em diferentes tipos de células), e casos de ausência de indução não são gerados por todos os estímulos e nem em qualquer sistema experimental).
O esquema de ativação urgente do gene MDRX (pelo exemplo do citosar e TPA) é mostrado na Fig. 20.
O conceito de indução de MDRX como um evento retardado, que inicialmente considera a ativação de proteínas necessárias para a indução de toro MDRX, complica ainda mais o quadro de ativação epigenética de MDR.<ой каскадный механизм может быть главным или дополнительным,
Regulação de MY 1 por quimioterapia e TFA
neomicina, 1173122
ativação da estabilização do mRNA da transcrição
Figura: 20. Mecanismos de ativação urgente do gene MY 1.
intensificando ou mantendo a taxa de transcrição. A capacidade da célula de escolher diferentes vias de indução MDR - direta (sem ativação de genes intermediários) e / ou mediada pela indução de outros genes - complica ainda mais a prevenção do desenvolvimento de MDR.
Ativação da transcrição do gene LA) /? 1 não é o único mecanismo para a formação de MDR. Outro componente importante da regulação epigenética pode ser a estabilização do nRNA IOC 1. É possível que, no que diz respeito ao equilíbrio entre a indução da transcrição e a estabilização do mRNA MYR 1, os mecanismos de ativação MDR sob a influência de vários indutores e em diferentes tipos de células também sejam diferentes. Essa hipótese é consistente com o conceito de regulação de vários níveis da expressão do gene MyNX (Fig. 19).
4) A prevenção direcionada de MDR é possível com o estabelecimento de mecanismos de transmissão de sinais de ativação de M) L1. A necessidade de prevenir o desenvolvimento de MDR na clínica foi confirmada pela relação entre evisceração MDR e citotoxicidade do medicamento. De fato, o nível de mRNA / £ Y? 1 em células tratadas com toxinas aumenta com o aumento na concentração das últimas. Consequentemente, o uso de regimes de quimioterapia em altas doses (justificados para melhorar a eficácia do tratamento) pode levar ao desenvolvimento de MDR nas células sobreviventes. A concentração de medicamentos necessária para a reabsorção completa da neoplasia pode ser superior à tolerância do paciente, o que determina o limite do escalonamento da dose na quimioterapia. Os antagonistas de sinalização intracelular identificados acima podem servir como protótipos de futuros bloqueadores de drogas MDR usados \u200b\u200bem combinação com drogas anticâncer tradicionais. Assim, a prevenção do desenvolvimento urgente de MDR aumenta a possibilidade de superação desse fenômeno clinicamente desfavorável.
Quais são as abordagens para superar o MDR formado? Um dos alvos "vulneráveis" nas células resistentes pode ser a membrana plasmática. A violação de sua integridade causa a morte de células resistentes: a Pgp não impede a morte por efeitos que induzem a necrose. Uma estrutura celular terapeuticamente importante foi identificada como alvo. Obviamente, agentes simplesmente baseados em membrana são inadequados devido à toxicidade descontrolada para os tecidos, incluindo os não neoplásicos. Os agentes que cruzam a barreira Pgp e causam danos à membrana plasmática devem ser encontrados, ou seja, criar uma concentração intracelular da droga suficiente para ativar a necrose. Uma substância que satisfaz a condição especificada pode ser ceramida - um esfingolipídeo que se acumula na célula em resposta a muitos estímulos, incluindo drogas anticâncer. A ceramida não é transportada pela Pgp, que fornece concentração suficiente desse metabólito em clivagens resistentes para induzir a morte.
A toxicidade da ceramida para células resistentes significa que as vias de sinalização distais ao acúmulo de ceramida nessas células não são bloqueadas por Pgp ou outros mecanismos associados à seleção MDR. Consequentemente, a superação da resistência deve estar associada à busca de formas de acumular ceramida (e, possivelmente, outros metabólitos tóxicos) nas células resistentes. Para a citotoxicidade da ceramida, caveolae ou seus análogos são necessários - formações de submembrana ricas em fosfolipídios e proteínas e que se acumulam durante a seleção para MDR (La \\ et al., 1998). É importante que a seleção para MDR possa ser acompanhada por um aumento nos alvos moleculares celulares para terapia anticâncer.
As formas livres de oxigênio são um mecanismo essencial de morte induzida por ceramvd. Isso levanta a questão do papel das mitocôndrias na sobrevivência das células MDR. Via mitocondrial
gera sinais adicionais para a ativação de caspases efetoras. ■ O "laço" litocondrial é um fator poderoso na potencialização de tais sinais, "alimentos, uma queda no potencial elétrico das mitocôndrias e especialmente a liberação de citocromo C no proplasma garantem a irreversibilidade do processo de morte. Uma vez que não é possível prever se a seleção para resistência estará associada à inativação de uma ou outra via de morte, é importante que apenas uma cascata "confiável" retenha sua função nas células MDR.
Nossos resultados indicam a sensibilidade aos adicais de oxigênio de linhagens celulares com MDR mediada por Pgp. Pode-se supor que, embora a resistência primária e a seleção para resistência a drogas sejam impulsionadas por muitos mecanismos, ainda é possível superar a resistência multifatorial aumentando a oxidação intracelular. O oxigênio livre entra imediatamente em inúmeras reações de acidificação, causando danos às estruturas que são importantes para a vida da célula - DNA e membranas. Nos experimentos acima, a necrose acabou sendo o principal método do branco quando exposto a radicais de oxigênio. Não é nenhuma surpresa que a necrose seja a única via de morte induzida pelo oxigênio livre. Numa situação específica, é necessário estabelecer a predominância de) o ou outro tipo de óbito; A distinção padrão entre apoptose e necrose não caracteriza a variedade de mecanismos de morte. Esse gesto faz sentido para determinar se o dano à membrana da bainha é primário ou tardio. No entanto, parece importante avaliar a permeabilidade da membrana plasmática em qualquer gagueira: a violação da integridade da membrana leva à irreversibilidade [leucorreia. causando necrose.
A última circunstância não é surpreendente. Para o funcionamento desta proteína da membrana plasmática, é necessário seu determinado estado físico-químico, devido à sua integridade. Com a necrose, ocorrerão graves danos à célula, principalmente devido à violação do transporte de água e íons. Esses danos afetarão quase qualquer estrutura celular, em contraste com as cascatas apoptóticas, que são expressas na clivagem sequencial de substratos - um processo dependente de energia que envolve a formação de complexos de proteína-lipídio multicomponentes na célula e a estrita especificidade da interação de caspases com substratos. O bloqueio de uma ou várias ligações de tal cascata (por exemplo, como resultado do transporte de lipídios prejudicado em células com MNU ms, a formação de complexos de sinalização "corretamente" localizados) interromperá a transmissão de sinais para mecanismos a jusante, o que resultará no escape celular da morte e, como resultado, a formação de resistência Por esse motivo, para o combate ao MDR, é desejável que os mecanismos de morte sejam múltiplos e incluam a ativação não apenas de caspases, mas: outras famílias de proteases (lisossomal, proteossômica, nuclear), bem como potencialização de sinal (via mitocondrial) e rompimento da permeabilidade da membrana plasmática ... Quanto mais mecanismos de morte podem ser ativados em células resistentes, mais confiável é o resultado final - superar a MDR.
1. O gene MYR e o fenótipo de MDR mediado pela glicoproteína P podem ser induzidos por uma única exposição de curto prazo a células de< веществ, в том числе противоопухолевых препаратов. МЛУ закрепляется в
em células que sobreviveram à exposição. A ativação epigenética em MOT forma um fenótipo MDR estável.
2) A formação urgente de MDR é assegurada pela ativação da expressão do gene EN1: a indução de sua transcrição e a estabilização do mRNA.
3) Mecanismos gerais de resposta celular ao estresse estão envolvidos na ativação MDR: via do esfatidilinositol, proteína quinase C, mobilização de 2+ intracelular, ativação de NaKB, proteína quinases ativadas por mitogênio e regulação do estado físico da cromatina. A inibição desses mecanismos impede a formação de MDR em células que sobreviveram após o tratamento com drogas anticâncer.
4) A superação da barreira da Pgp e a indução dos mecanismos de morte existentes nas células com MDR são condições necessárias e suficientes para a mineração dessas células.
5) A Pgp sozinha e o fenótipo MDR como um todo não garantem a sobrevivência da Pgp quando exposta a influências que causam uma ruptura primária da integridade da membrana somática. Assim, a membrana plasmática é um alvo apeêutico, e a indução de necrose é uma das estratégias para superar a resistência arterial.
6) A morte de células com MDR, causada por uma violação da integridade da membrana zmática (lise mediada por desempenho), é causada por linfócitos T otóxicos gerados em resposta à imunização com células chol modificadas para expressar citocinas.
7) Os metabólitos intracelulares capazes de danificar a membrana zmática e causar a morte de células com MDR são ikals de oxigênio livres. Sua geração sob a ação de drogas antitumorais é um mecanismo eficaz para a superação da MDR.
Principais publicações sobre o tema da tese:
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3. Stromskaya T., Filippova N., Rybalkina E., Egudina S., Shtil A., Elisseenkova A., Stavrovskaya "A. Alterações na síntese de melanina em células de melanoma humano selecionar in vitro para multidrug lesislaacc J / Experimental and Toxicological Pathology, 199 47, 157-166.
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Serviço de equipamento duplicado H.H. Blokhin Academia Russa de Ciências Médicas Assinado para publicação 14. II .03y. Pedido nº 24 "/. Circulação 100 cópias.
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Calma, Alexander Albertovich. Resistência das células tumorais às drogas mediada pela glicoproteína-P: mecanismos de formação urgente e abordagens para a sua superação: resumo da tese. ... doutores em ciências médicas: 14.00.14. - Moscou, 2003. - 46 p.: doente.
Introdução ao trabalho
Relevância do tópico
I. Resistência a múltiplas drogas de células tumorais:
mecanismos biológicos e significado em oncologia.
Apesar dos avanços significativos na farmacologia, incluindo o desenvolvimento de tecnologia para a criação de drogas com as propriedades esperadas, o sucesso da quimioterapia para tumores é limitado pela característica mais importante dos sistemas vivos - a capacidade de se adaptar às mudanças no ambiente externo. Uma das manifestações dessa maciez é o desenvolvimento de resistência das células tumorais aos medicamentos [usados \u200b\u200bna quimioterapia. A ocorrência generalizada e o caráter estável e de longo prazo da adaptação celular às influências externas sugerem que a superação da resistência aos medicamentos pode estar associada não apenas à busca por medicamentos mais eficazes: provavelmente não existe medicamento para o qual as células não sejam capazes de desenvolver resistência. Somente a elucidação dos mecanismos biológicos de resistência aos diversos tipos de estresse servirá como “novo para o desenvolvimento de estratégias de superação da resistência aos medicamentos, condição necessária para aumentar a eficácia do tratamento de pacientes com câncer.
A resistência a múltiplas drogas (MDR) das neoplasias - a preservação da viabilidade das células tumorais em resposta à exposição a várias substâncias medicinais - é uma das principais razões para o progresso! doenças: o tumor é insensível à quimioterapia, independentemente da combinação de medicamentos utilizada. O fenômeno MDR tem um caráter estável e de longo prazo: os mecanismos de resistência são herdados em gerações celulares. Assim, a MDR é um dos principais fatores na progressão do tumor.
Existem dois tipos principais de resistência celular a toxinas. G.E. primário observada antes da exposição a quimiopreparações) a resistência deve-se à expressão de mecanismos de defesa durante a progressão do tumor. Então, ativação
os mecanismos antiapoptóticos que medeiam a resistência a um efetor da imunidade podem estar relacionados à resistência aos medicamentos. A resistência secundária (adquirida) surge em células expostas ao estresse. Antes desses efeitos, os mecanismos de defesa em tais células são mal expressos ou ausentes; sobrevivendo após o tratamento com uma toxina, as células adquirem resistência a várias substâncias - MDR (Riordan, Ling, 1985). Uma seleção posterior fixa o fenótipo adquirido nas gerações de células.
O mecanismo mais importante da MDR é um acúmulo reduzido de toxinas na célula, devido à excreção de substâncias no meio extracelular. Esse transporte é realizado pela proteína integral da glicoproteína P da membrana plasmática (Pgp) devido à energia de hidrólise do ATP (Juliano, Ling, 1984). "! A Pgp humana é codificada pelo gene IADM (resistência a múltiplas drogas 1), localizada no cromossomo 7 (Chen et al., 1986). Numerosos dados indicam t (que um aumento no mRNA IADM e a Pgp é freqüentemente um fator na resistência de muitos tipos de tumores ao tratamento (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).
II. Formação de MDR em células tumorais: biológica mecanismos como alvos para prevenção
É razoável supor que um aumento na quantidade de mRNA IADM devido à amplificação deste gene. Este mecanismo MDR foi identificado em linhagens de células em cultura que foram submetidas à seleção para sobrevivência na presença de toxinas (Roninson, 1991). No entanto, ao analisar tumores, a amplificação do gene de uma pessoa MDR1 não encontrado em tumores primários ou neoplasias após o tratamento. A causa provável da MDR clínica é a superexpressão IADM e Pgp com uma estrutura de gene inalterada (mantendo o número de cópias da sequência de inucleotídeo), ou seja, ativação epigenética do fenótipo. Em culturas de células tumorais humanas, um aumento no nível de mRNA IADM e a quantidade de Pgp foi observada com um único tratamento com quimioterapia
diferente na estrutura química e nos mecanismos de ação (Chaudhary, aninson, 1993). Evidência de acúmulo de mRNA obtida MDR \\ em metástases de rcoma no tecido pulmonar dentro de 20-50 minutos após o início do intra-operatório: fusão pulmonar com doxorrubicina (Abolhoda et al., 1999). Esses resultados (confirmam a possibilidade de ativação epigenética de MDR em experimentos e [situações técnicas: aumento de mRNA MDR \\ e Pgp em tumores pode descer sem amplificação do gene MDRI.
Este tipo de regulação biológica - ativação urgente do fenótipo - envolve a indução da transcrição do (s) gene (s) que codificam o fenótipo correspondente e / ou controle pós-transcricional (estabilização de NK, regulação da síntese e funcionamento de proteínas). Em relação ao MDR, este tipo de regulação significa a possibilidade de indução gênica MDR \\ estímulos celulares e desenvolvimento relativamente rápido de resistência nas células r / chol em resposta ao estresse. Indutibilidade do gene IADM assume as vias de transmissão do sinal do tivatsgao da periferia da célula para o núcleo. Essas vias) podem ser mecanismos de sinalização de realização de estresse: proteína quinase C ІКС), fosfolipases e Ca 2+ intracelular, uuteína quinases ativadas por mitogênio, fator nuclear kappa B (NFkB). Sinalizando para a região gulatória do gene IADM e a transcrição fornece ativação da compressão do gene.
O estudo da regulação MDR também tem um aspecto prático fundamental. A inibição desses mecanismos por meio de efeitos farmacológicos e / ou não tóxicos impediria o desenvolvimento de MDR no processo [myoteragash.
III. Superando as células tumorais MDR formadas.
Se estiver bloqueando genes ativadores MDR \\ sinais podem prevenir a formação de MDR em células sensoriais primárias, então tal
a abordagem é inaplicável para superar a resistência já formada. O método tradicional de combate ao MDR secundário é o uso de moduladores Pgp em combinação com citostáticos (Lehne, 2000). No entanto, o uso de inibidores de Pgp é limitado por efeitos colaterais (arritmias cardíacas, desequilíbrio imunológico). É igualmente importante que as combinações efetivas de modulador + tireostático possam ser reduzidas bloqueando pelo menos alguns dos mecanismos de morte celular durante a seleção para MDR.
A superação da MDR formada é alcançável quando duas condições são satisfeitas: 1) a concentração da droga deve ser suficiente para ativar os mecanismos efetores de morte celular, 2) as funções desses mecanismos devem ser retidas em células com MDR. A primeira condição é satisfeita se a droga cruzar a barreira Pgp. No entanto, é necessário provar que o alcance de uma concentração intracelular crítica do agente é suficiente para ativar a morte de uma célula resistente a muitas influências. Os mecanismos de sobrevivência que funcionam nas células resistentes devem servir de alvos para a eliminação destas.
Para a implementação da segunda condição, uma abordagem visando a lise de células resistentes como mecanismo de indução de sua morte parece promissora. A vacinação de camundongos com células de mieloma singênico transfectadas com cDNA de certas citocinas leva ao desenvolvimento de uma resposta imune mediada por linfócitos T citotóxicos (CTL) e rejeição do tumor enxertado) em animais imunizados (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al., 1996). Os CTLs lisam as células usando granzima B e perforina. Como a granzima B ativa a caspase 3, um dos efetores distais da apoptose, e a perforina causa dano primário à membrana plasmática (necrose), espera-se que a AP seja eficaz se os mecanismos de morte proximal forem bloqueados; desencadeamento de apoptose distal em combinação com necrose
leva à morte de células resistentes a drogas anticâncer - indutoras de morte celular programada.
Formulação do problema
A MDR é um fenômeno clinicamente desfavorável, cuja superação requer conhecimento dos mecanismos de seu desenvolvimento e das formas de realizar a morte celular, devendo investigar ambos os aspectos do problema. Primeiramente, é necessário estudar os mecanismos de formação de MDR em MD /? Em células humanas negativas para Pgp, o estudo desses mecanogomos servirá para prevenir o desenvolvimento de resistência nas células primárias sensíveis. Em segundo lugar, a análise dos processos de morte que funcionam em células MDR criará a base para superar a resistência em situações em que se formou MDR secundário.
O objetivo do estudo é estabelecer os mecanismos de formação de urgência [LN em células tumorais humanas e desenvolver abordagens para superar essa resistência їda.
Otimizar os modelos de formação de MDR em culturas de células tumorais humanas em resposta à exposição a drogas quimioterápicas e agonistas e antagonistas experimentais de mecanismos de sinalização.
Determine o principal! mecanismo de desenvolvimento urgente de MDR quando as células são tratadas com agentes anticâncer: amplificação do gene MDRI, seleção de células Pgp-positivas ou de novo gaschuking MDR.
Investigar as vias de transmissão de sinais intracelulares que regulam a ativação de MDR - proteína quinase C, fosfolipase C, células gástricas Ca +, proteína quinases ativadas por mitogênio, NFkB).
Identificar o papel da ativação transcricional e da regulação pós-transcricional (estabilidade do mRNA) da expressão gênica IADM em tratamento MDR urgente em resposta aos efeitos da quimioterapia.
Desenvolver maneiras de prevenir o desenvolvimento de MDR em células tumorais ao combinar drogas quimioterápicas com bloqueadores MDR \\ -ativação de vias de sinalização e inibidores de transcrição de genes
Investigar a cinética de ativação das cúspides brilhantes e efetoras, alterações no potencial transmembrana da mitocôndria, clivagem proteolítica da poli (ADP) ribose polimerase, fragmentação internucleossômica do DNA e a integridade da membrana plasmática nas células parentais e variantes com MDR após o tratamento com uma droga não transportada pela glicoproteína P.
Use a vacinação com células tumorais que expressam citocinas para gerar uma resposta imune contra células MDR.
Provisões para Defesa.
A formação de MDR mediada por Pgp - uma resposta celular urgente a muitos estímulos - é mediada pela ativação do gene epigenético MDRI. Essa ativação se deve a inúmeros mecanismos de sinalização intracelular, indução de um promotor gênico e estabilização do mRNA e pode ser prevenida por inibidores desses sinais.
A superação da MDR mediada por Pgp pode estar associada a um efeito direcionado na membrana plasmática de células resistentes. A Pgp não protege as células de danos à integridade da membrana plasmática - necrose.
Pesquisa científica Pela primeira vez, o conceito de desenvolvimento MDR como uma resposta urgente de uma célula a um estímulo exógeno foi comprovado;
Pela primeira vez, o mecanismo de formação de um fenótipo específico de resistência a medicamentos - MDR mediado por Pgp: ativação epigenética do gene que codifica essa proteína - foi estudado em detalhes MDRI.
3. Pela primeira vez, um modelo de ativação gênica urgente foi desenvolvido MDRI,
acompanhado pela aquisição de um fenótipo estável de MDR mediado por Pgp na cultura de células tumorais humanas; \. Vias de transdução de sinal, mecanismos de ativação da transcrição e regulação pós-transcricional do gene foram identificados MDRX em células expostas a drogas anticâncer. 5. Pela primeira vez, as classes de substâncias farmacológicas - bloqueadores da transmissão do sinal intracelular - foram caracterizadas para prevenir a formação de MDR mediada por Pgp em células tumorais. 5. Pela primeira vez, os mecanismos de morte, funcionando em células com MDR mediada por Pgp, foram investigados, e uma abordagem para superar a resistência foi desenvolvida, que consiste no dano primário à integridade da membrana plasmática.
Valor prático.
Desenvolvimento de métodos para prevenir a formação urgente de MDR mediada por Pgp em cultura de células tumorais sob a influência de drogas quimioterápicas.
Ensaios pré-clínicos de vacinas geneticamente modificadas para superar a MDR.
Aprovação do trabalho.
A dissertação foi discutida em 30 de junho de 2003 em conferência conjunta sobre o laboratório de genética de células tumorais, citogenética com o grupo de genética molecular, oncogenes virais e celulares, endocrinologia molecular, imunidade antitumoral, farmacologia bioquímica, ciências médicas, diagnóstico experimental e bioterapia de tumores; Departamentos de Shmunology, Hematology, Chemotherapy, Clinical Pharmacology, “Shredded Methods of Treatment do Russian Cancer Research Center. N.N.Blokhin RAMS.
Os principais materiais da dissertação foram apresentados nas seguintes conferências: 2º Simpósio Internacional "Cytostatic Drug Resistance" (South Germany, 1991); Gordon Conference "Advances in Chemotherapy" (NYC London, USA, 1994); Molecular Toxicology (Copler Mountain, EUA, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Stevenson, EUA, 1996); Nucleic Acids - Integrating Molecular Diagnostics and Therapy (San Diego, EUA, 1996); Conferência Anual da American Association of Cancer Research (1994-2001): 6ª e 7º Congresso "Advances in Oncology", (Hersonissos, Grécia, 2001,2002); "Structures and functions of the cell nucleus" (St. Petersburg, 2002), bem como em seminários na Oncotech, Inc. (Irvine, EUA, 1996), Salk Institute (LaHoya, EUA, 1997), Lee Moffit Cancer Center (Tampa, EUA, 1997), The Jackson LaboraU (Bar Harbor, EUA, 1997), Sloan-Kettering Cancer Center, Novo Yo] EUA, 1999), universidades de Copenhagen (2002), Innsbruck (2002) e Groningei (2003), Moscow State University. MV Lomonosov (2002), Instituto de Pesquisa de Patologia Experimental de Oncologia e Radiobiologia em homenagem a V.I. R.E. Kavetsky (Kiev, 2002).
Publicações.
A estrutura e âmbito da tese.
Estudos de morte celular programada - apoptose (do grego. αποπτωσις
- folhas que caem) - na última década levaram a várias descobertas científicas importantes: foi descoberto um sistema integral para a realização deste fenômeno - foram identificados genes que o regulam, bem como receptores de células de superfície e seus ligantes mediando a morte celular.
Em vários experimentos, os cientistas provaram que a morte programada é uma propriedade obrigatória e integral de qualquer célula em qualquer sistema multicelular. (Todos os dias, cerca de 5% das células do corpo sofrem apoptose e novas tomam seu lugar. Para desaparecer sem deixar vestígios, uma célula leva de 15 minutos a 2 horas).
Em 2002, os biólogos moleculares Sidney Brenner ( Sydney Brenner) , Robert Horwitz ( H. Robert Horvitz) e John Sulston ( John Edward Sulston) para descobertas no campo da “regulação genética do desenvolvimento do organismo e morte celular programada” recebeu o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina.
Os especialistas acreditam que novas pesquisas sobre apoptose podem ajudar a desenvolver drogas contra doenças perigosas como câncer, derrame, ataque cardíaco, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e algumas outras.
ALEXANDER ALBERTOVICH SHTIL - Doutor em Ciências Médicas, Chefe do Laboratório de Mecanismos da Morte de Células Tumorais, Instituto de Pesquisa de Carcinogênese, Centro Russo de Pesquisa do Câncer. N.N. Blokhin Academia Russa de Ciências Médicas.
Especialista na área de oncologia celular e molecular.
Interesses científicos: mecanismos de morte celular programada (bactérias e eucariotos, em particular, células tumorais).
Perguntas_Elena Vetrova
Março abril
Moscou, 2009
Alexander Albertovich, a apoptose é um dos principais processos biológicos que ocorrem no corpo ao longo de sua vida. Desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário do organismo (morfogênese), e na manutenção do equilíbrio dinâmico em órgãos e tecidos (homeostase), e no processo de nucleação e desenvolvimento de tumores.(carcinogênese).
Em que outros casos o corpo ativa o programa de suicídio celular? E como esse programa "sabe" o que é bom e o que é ruim para o corpo?
Na fig. apoptose. O processo começa quando a funcionalidade da célula se esgota. Os genes que garantem a divisão celular são bloqueados, e os genes que fornecem a síntese de lítica (do grego.lytikos - livrar , dissolver ) as enzimas são estimuladas. Essas enzimas entram no núcleo e lisam (destroem) a cromatinacromossomos- um complexo de DNA, RNA e proteínas. Os cromossomos se desintegram, a síntese na célula é interrompida.
Alguns sinais externos de apoptose na célula:
picnose (encolhimento do núcleo);
cromatólise (diminuição da coloração do núcleo);
cariorexia (desintegração do núcleo em partes);
destruição do citoplasma, etc.
Os restos são fagocitados (absorvidos) por macrófagos.
A morte programada é acionada durante processos fisiológicos - nos organismos mais simples, por exemplo, bactérias, para manter a população de células ideal para as condições ambientais dadas (nutrientes, temperatura). Este efeito é observado em biofilmes - comunidades bacterianas auto-reguladoras.
No desenvolvimento embrionário de tecidos e órgãos de organismos superiores e no organismo adulto, a morte programada serve para transformar as populações de células - envelhecendo e perdendo funções - em jovens.
O programa não sabe o que é bom e o que é mau para o corpo, é apenas a forma como a vida é organizada - a morte é um lado da vida ...
Ou seja, um efeito colateral da evolução ésobre o que é August Weismann, Zoólogo e evolucionista alemão, escreveu no final do século XIX ...
... Portanto, a morte de células não tumorais durante a quimioterapia é ruim: a apoptose de células normais é indesejável aqui, mas o programa não se distribui entre o "bom e o ruim", mas permite que sobrevivam, destruindo os mais vulneráveis, mais sensíveis ... Justiça no entendimento humano não funciona aqui, e esse desespero e "falta de princípio" precisam ser pagos.
Os cientistas aprenderam sobre a existência da apoptose não há muito tempo, cerca de meio século atrás. Como essa descoberta afetou o desenvolvimento da ciência?
Na fig. ativação do programa genético de apoptose na célula sob a influência de fatores externos (sinais)
(Fig. Aumenta quando você clica nele com o cursor)
Esta descoberta permitiu em pouco tempo - cerca de 15 anos - formar ideias sobre os processos biológicos mais importantes - a transmissão de sinais intracelulares, regulação da proteólise - o processo de desdobramento de proteínas e péptidos no corpo, regulação da forma do núcleo, organelas e membranas.
O estudo do papel das proteínas da cromatina na expressão gênica se intensificou.
O conceito do mecanismo de ação dos agentes citostáticos, principalmente drogas anticâncer e radiação ionizante, em células tumorais e normais foi fundamentado.
A descoberta dos mecanismos de morte celular hoje tem focado muitas áreas científicas - da biologia e química ao tratamento de doenças em humanos, animais e plantas.
Sim, essa área é considerada uma das mais promissoras da biologia molecular. Ele está otimisticamente associado ao desenvolvimento de medicamentos fundamentalmente novos para o tratamento de doenças degenerativas ainda incuráveis, do câncer e até da possibilidade de vencer a velhice.
Segundo alguns relatos, mais de quatrocentos laboratórios no mundo hoje estão de alguma forma envolvidos neste assunto.
A perspectiva de estudar a apoptose para a biologia molecular se deve ao fato de que esse fenômeno (e, mais amplamente, a morte celular) abarca a totalidade de muitas idéias e orientações científicas. Uma célula - tanto a mais simples quanto a mais complexa - é sempre um sistema complexo, e a morte é uma propriedade integral dos seres vivos. Portanto, o estudo da morte é geralmente promissor para a compreensão da essência da vida.
E, de fato, em termos práticos, o estudo dos mecanismos de morte permitirá concretizar a ação de muitas drogas.
Recentemente, o fenômeno efeito espectador (« efeito espectador"): Quando as células morrem por qualquer motivo, enviam um determinado sinal às células saudáveis \u200b\u200bvizinhas e essas células se autodestruem. O que os move? Existem hipóteses sobre esta pontuação?
Este é um exemplo de regulação biológica em um sistema complexo: dessa forma, as células matam umas às outras enviando sinais aos vizinhos. O sinal (geralmente uma proteína solúvel em água) não é prejudicial para si mesmo, mas para células de outra origem, localizadas na mesma população, é destrutivo - essa diferença de sensibilidade é a base do jogo.
Qual é o papel do oxigênio e do peróxido de hidrogênio no processo de apoptose?
Muito importante - os radicais de oxigênio são muito ativos quimicamente. Eles desencadeiam reações que danificam proteínas, ácidos nucléicos e lipídios.
Figura: aumenta quando você clica nele com o cursor.
O efeito terapêutico da radiação ionizante e dos antibióticos antraciclínicos baseia-se nesta propriedade. A excitação pela luz de compostos químicos especiais - fotossensibilizadores - causa uma explosão de oxigênio e danos graves às células. Se tal fotossensibilizador se acumular em um tumor e este for iluminado, ocorre a morte das células tumorais. Essa terapia em oncologia é chamada de terapia fotodinâmica e é amplamente utilizada, entretanto, para tumores que são acessíveis à luz e não são muito grandes.
O princípio da apoptose é observado tanto em nível celular quanto subcelular, em tecidos e órgãos. O acadêmico da RAS Vladimir Skulachev sugeriu chamar esse fenômeno de fenoptose. Por que na natureza algumas plantas e animais (bambu após a floração, salmão após a desova) ativam o programa de autodestruição no início? É improvável que isso seja devido a mutações genéticas irreversíveis.
Provavelmente não conectado, mas este é o mecanismo da natureza - a linguagem na qual é relatado que o bambu desbotado morrerá ... O mecanismo é epigenético - não há mutações, mas há mudanças rápidas nas propriedades físico-químicas da cromatina, e um importante gene (genes) de funcionar fica silencioso ... Para tal linguagem, nenhuma destruição é necessária - basta anexar ou separar um grupo químico - metil, fosfato, acetil - de uma proteína para outra.
Chega de dica ...
Existe a hipótese de que o câncer é também a morte programada de um organismo geneticamente instável contendo danos irreparáveis \u200b\u200b(e, portanto, perigoso para a evolução). Cada vez mais, pode-se ouvir de oncologistas a opinião de que o aparecimento de uma célula completamente transformada é apenas uma questão de tempo. Se for assim, o câncer não é uma doença, como a velhice, mas um certo resultado do desenvolvimento de um sistema vivo. Mas os cientistas presumem, e os futurólogos prevêem uma vitória sobre o câncer no futuro. Afinal, o homem não espera mais misericórdia da evolução por muito tempo. É possível derrotar o câncer?
Talvez seja impossível derrotar - o câncer é um dos mecanismos de remoção de um indivíduo inviável, junto com outros processos patológicos típicos - inflamação, alergia. A vida orgânica é construída sobre a mutabilidade dos organismos - a morte é inevitável e os mecanismos para sua implementação são necessários. O câncer é um desses mecanismos. A tarefa dos cientistas é adiar a morte, não evitá-la.
Se existe uma ligação pronunciada entre o envelhecimento e o desenvolvimento do câncer, e aparentemente ninguém duvida disso, talvez seja necessário expandir a frente do combate à escala da luta contra o envelhecimento?
O combate ao envelhecimento é necessário tanto na luta contra os tumores quanto em outros aspectos - isso está fora de dúvida.
A defesa anticâncer do corpo é baseada na apoptose. Por que a apoptose para de funcionar após uma série de mutações? Por que, em algum momento, o corpo para de resistir e começa a ajudar o tumor (por exemplo, o sistema imunológico)?
Porque a apoptose, como qualquer processo biológico, é interrompida por mutações e também porque a apoptose pode ser facilmente interrompida sem mutações.
Qual é o papel do grupo de enzimas do citocromo P450 no processo de carcinogênese?
3.Sir John Sulston- Biólogo britânico, membro da Royal Society of Great Britain. Seu laboratório compilou uma descrição completa da ordem de divisão das células embrionárias do nematóide Caenorhabditis elegans e traçou o destino de absolutamente todas as suas 959 células em processo de desenvolvimento.
Sem dúvida. A existência de tais proteínas confirma a importância essencial da apoptose na biologia - os mecanismos desse fenômeno não são acidentais, são codificados no DNA da célula e entram em ação quando um sinal correspondente é dado. Não há morte sem eles.
Recentemente, pesquisadores americanos do Instituto de Medicina Albert Einstein descobriram que um pequeno fragmento da proteína intracelular p115 ativa a apoptose.
Antes da apoptose, o p115 se divide em dois fragmentos, o menor dos quais consiste em 205 aminoácidos. Segundo os cientistas, é ele quem desempenha papel importante no processo de morte celular, já que sua expressão leva à liberação do citocromo C da mitocôndria para o citoplasma das células, o que leva à sua morte. Os cientistas esperam que esta descoberta possa levar ao surgimento de novos medicamentos para combater o câncer e outras patologias, que são caracterizadas pela proliferação celular excessiva.
Na sua opinião, quais das mais novas descobertas no campo da apoptose são fundamentais para a medicina e a biologia?
Na fig. a expressão de um pequeno fragmento da proteína p115 (mostrado em verde) leva à liberação do citocromo C (vermelho) da mitocôndria para o citoplasma das células, o que leva à sua morte.
http://www.cbio.ru/article.php?storyid\u003d3319
Novas abordagens para a terapia de doenças proliferativas são baseadas nesse fenômeno - para criar condições nas quais as próprias proteínas das células funcionassem como assassinas. Assim, a clivagem proteolítica da proteína poli (ADP-ribose) polimerase, que ocorre durante a indução da apoptose, forma seu fragmento que se liga ao DNA e impede o reparo de seus danos. A proteína poli (ADP-ribose) polimerase normal, necessária para a cura de danos no DNA, torna-se fatal para a célula.
Entre as últimas descobertas, que agora recebem importantes aplicações práticas para a regulação da morte celular, deve ser atribuída a comprovação da possibilidade de suprimir um gene específico na célula e em todo o organismo pela introdução dos chamados RNAs antisense em gancho curto.
Tecnologia de gene silencioso ( silenciando genes), quando a ligação de moléculas curtas de RNA de fita dupla à sequência regulatória do gene alvo permite interromper o processo de síntese nesse gene.
Terapia genética de vetor (viral) promissora.
Essas ferramentas - o produto de muitos anos de colaboração entre químicos e biólogos - podem alcançar o desligamento do gene a longo prazo. Se os produtos de tais genes são importantes para a viabilidade celular, induzimos a morte com efeitos colaterais mínimos. Este último é especialmente importante em uma clínica oncológica - muitas vezes o tratamento de quimiorradiação é mais tolerado pelos pacientes do que a própria doença ... Os medicamentos convencionais ainda são pouco conhecidos, quais células destruir e de que maneiras. A terapia genética pode ser mais eficaz e os efeitos colaterais do tratamento podem ser reduzidos.
Sem dúvida, frutífero, embora encontre uma série de dificuldades, é o conceito de direcionado ao alvo - direcionado - (do inglês ao alvo - alvo, alvo) terapia de tumor.
Na fig.
d o efeito do medicamento Herceptin - (fabricado pela Roshe / Suíça). Criado com base em anticorpos capazes de bloquear as proteínas receptoras HER2.
Inibe o desenvolvimento do tumor.
Estabiliza a condição do paciente.
Encurta o período de quimioterapia.
(Fig. Aumenta quando você clica nele com o cursor)
Certos medicamentos destinados a inativar um alvo específico (proteína) em uma célula tumoral são altamente eficazes e bem tolerados durante longos cursos de tratamento (exemplos são Gleevec, Iressa).
Seu laboratório está empenhado em pesquisar estratégias para direcionar as vias de iniciação e realização da morte de células tumorais. Até onde você conseguiu avançar na solução desses problemas?
Os especialistas do nosso laboratório estabeleceram os mecanismos de morte das células tumorais sob a ação de novos medicamentos criados na Rússia. Em particular, foi identificado um mecanismo pelo qual é possível contornar a resistência às drogas das células tumorais: novos compostos químicos superam a barreira que em outras situações impede que as drogas entrem na célula.
Além de investigar o papel dos compostos químicos na reprogramação de células em células cancerosas e na morte de células cancerosas, você também está investigando os mecanismos moleculares da morte celular. O que ainda não está claro sobre esses mecanismos? Que perguntas os cientistas ainda precisam responder?
É importante descobrir como não induzir apoptose em células não tumorais. Matar uma célula não é problema, o problema é como proteger uma saudável ...
O seu laboratório desenvolve trabalhos de estudo dos mecanismos da função assassina de uma célula cancerosa? É possível, em princípio, bloquear a atividade fatal de uma célula cancerosa e seu efeito nos tecidos normais?
Talvez e necessário. Existem meios de inativação do fator de necrose tumoral - uma toxina secretada por uma célula cancerosa e que causa a destruição de células normais, uma espécie de efeito espectador. Esses fundos estão em testes clínicos iniciais.
Você trabalhou nos Estados Unidos por oito anos. Qual é a diferença entre as abordagens russa e ocidental para combater o câncer? Sabe-se que os Estados Unidos destinam recursos significativos para combatê-la, para prevenir o câncer. E o resultado mais importante dessas medidas é que as mortes por câncer estão diminuindo gradualmente.
Na Rússia, a situação da morbidade por câncer continua difícil. Que medidas podem reverter uma situação desfavorável?
O estilo científico ocidental é caracterizado pelo desejo de um estudo aprofundado dos mecanismos, e não apenas dos fenômenos, da integralidade da representação, devido às amplas conexões interdisciplinares, da alta competição pela criação de importantes informações científicas.
A mortalidade por câncer continua a ser um problema global, mas a situação melhorou em alguns locais. Por exemplo, há menos casos de câncer de estômago - as condições nutricionais mudaram, o armazenamento de alimentos a longo prazo tornou-se seguro com o desenvolvimento da indústria de refrigeração, a propaganda antitabaco foi organizada - essas medidas públicas estão de fato trazendo resultados positivos.
Na inovação em cuidados de saúde (principalmente no campo do tratamento do câncer) planejado 10 bilhões de dólares - o dobro do previsto para o exercício em curso.
E a situação na Rússia pode ser melhorada combinando os esforços conjuntos de muitos estratos sociais e, é claro, com recursos adequados para tarefas tão complexas e importantes.
