Hibridisasi fluoresen in situ. Hibridisasi fluoresensi in situ (IKAN)

Dalam beberapa kasus, studi sitogenetik tidak cukup untuk memberikan kesimpulan tentang kariotipe, dalam kasus ini, metode sitogenetik molekuler digunakan, khususnya hibridisasi fluoresensi in situ (FISH).

Munculnya teknologi baru sitogenetika molekuler, yang terutama didasarkan pada hibridisasi asam nukleat in situ, telah secara signifikan memperluas kemungkinan diagnostik kromosom. Metode hibridisasi in situ dikembangkan untuk melokalisasi sekuens DNA spesifik secara langsung pada sediaan sitologi. Telah terjadi transisi dalam identifikasi kromosom dan daerah kromosom dari analisis organisasi sitologi kromosom ke analisis rangkaian DNA yang termasuk dalam komposisinya. Perbandingan efektivitas metode sitologi klasik untuk mendeteksi dan menganalisis penataan ulang kromosom, seperti pewarnaan diferensial kromosom, dengan teknologi sitogenetik molekuler modern telah menunjukkan bahwa pada kelainan hematologi, analisis sitologi kromosom mendeteksi dan mengidentifikasi dengan benar hanya sekitar sepertiga dari kromosom. penataan ulang dideteksi menggunakan spektral karyotyping (SKY). Sekitar sepertiga dari penataan ulang diidentifikasi secara salah dengan metode sitologi, dan sepertiganya tidak diketahui sama sekali. Metode klasik analisis sitogenetik hanya dapat mendeteksi sekitar 15% penataan ulang kromosom yang diidentifikasi menggunakan SKY.

Metode FISH menggunakan molekul fluoresen untuk mewarnai gen atau kromosom secara in vivo. Metode ini digunakan untuk pemetaan gen dan identifikasi penyimpangan kromosom.

Teknik ini dimulai dengan persiapan rangkaian DNA pendek, yang disebut probe, yang melengkapi rangkaian DNA yang mewakili target yang diinginkan. Probe tersebut berhibridisasi (mengikat) ke daerah DNA yang saling melengkapi dan, karena diberi label dengan label fluoresen, memungkinkan untuk melihat lokalisasi gen yang diinginkan di dalam DNA atau kromosom. Tidak seperti metode lain untuk mempelajari kromosom, yang memerlukan pembelahan sel aktif, FISH dapat dilakukan pada sel yang tidak membelah, sehingga memberikan fleksibilitas pada metode ini.

FISH dapat digunakan untuk berbagai tujuan dengan menggunakan tiga jenis probe yang berbeda:

* probe spesifik lokus yang berikatan dengan daerah kromosom tertentu. Probe ini digunakan untuk mengidentifikasi rangkaian pendek DNA terisolasi yang ada, yang digunakan untuk menyiapkan probe berlabel dan hibridisasi selanjutnya dengan satu set kromosom;
*probe pengulangan alphoid atau sentromerik adalah rangkaian pengulangan daerah sentromerik kromosom. Dengan bantuan mereka, setiap kromosom dapat dicat dengan warna berbeda, yang memungkinkan Anda dengan cepat menentukan jumlah kromosom dan penyimpangan dari jumlah normalnya;
* probe untuk seluruh kromosom adalah sekumpulan probe kecil, yang melengkapi setiap bagian kromosom, tetapi umumnya mencakup seluruh panjangnya. Dengan menggunakan perpustakaan probe semacam itu, dimungkinkan untuk “mewarnai” seluruh kromosom dan memperoleh kariotipe spektral diferensial suatu individu. Jenis analisis ini digunakan untuk menganalisis penyimpangan kromosom, seperti translokasi, ketika bagian dari satu kromosom dipindahkan ke lengan kromosom lainnya.

Hibridisasi fluoresen in situ (IKAN)

Bahan penelitiannya adalah darah, sumsum tulang, biopsi tumor, plasenta, jaringan janin atau cairan ketuban. Sampel untuk pengujian harus dikirim ke laboratorium dalam keadaan segar. Slide dibuat langsung dari sampel jaringan atau setelah dikultur. Persiapan sel metafase dan interfase dapat digunakan. Probe DNA spesifik yang diberi label fluoresen berhibridasi dengan DNA kromosom, dan beberapa probe untuk lokus berbeda dapat digunakan secara bersamaan.

FISH adalah metode analisis sitogenetik yang berguna dan sensitif untuk mendeteksi penyimpangan kromosom kuantitatif dan kualitatif, seperti penghapusan (termasuk mikrodelesi), translokasi, duplikasi, dan aneuploidi. IKAN pada kromosom interfase adalah metode cepat untuk diagnosis prenatal trisomi 21, 18, atau 13 atau penyimpangan kromosom seks. Dalam onkologi, FISH dapat mendeteksi sejumlah translokasi (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1) yang terkait dengan keganasan hematologi. Metode ini juga dapat digunakan untuk memantau sisa kanker setelah kemoterapi dan transplantasi sumsum tulang serta mengidentifikasi peningkatan onkogen (c-myc/n-myc) yang terkait dengan prognosis buruk pada beberapa tumor. IKAN juga digunakan untuk memantau kelangsungan hidup allograft sumsum tulang yang diperoleh dari lawan jenis.

FISH adalah metode sensitif untuk mengidentifikasi penyimpangan kromosom dan analisis cepat sejumlah besar (>500) sel dalam satu waktu. Metode tersebut sangat akurat dalam mengidentifikasi sifat kromosom dan fragmen DNA kromosom yang tidak diketahui.

Sitogenetika tradisional ketika mempelajari kariotipe selalu dibatasi pada tingkat resolusi pita. Bahkan ketika menggunakan metode resolusi tinggi untuk pewarnaan kromosom diferensial, kami hanya mendeteksi lebih banyak pita pada kromosom, namun kami tidak yakin bahwa kami telah mencapai resolusi tingkat molekuler. Kemajuan terkini dalam teknologi DNA dan sitogenetika telah memungkinkan penggunaan metode FISH untuk menganalisis perubahan DNA kromosom pada tingkat molekuler. Sitogenetika molekuler memberikan terobosan revolusioner dalam sitogenetika, memungkinkan:

Menganalisis struktur DNA kromosom pada kisaran 10-100 kilobase;
mendiagnosis sel interfase yang tidak membelah, yang berdampak besar pada diagnosis prenatal dan diagnosis genetik praimplantasi (PGD).

teknologi IKAN menggunakan probe DNA yang mengikat atau menganil urutan DNA tertentu dalam kromosom. Probe yang didenaturasi diinkubasi dengan DNA asli sel, yang juga didenaturasi menjadi keadaan beruntai tunggal. Probe menggantikan biotin deoxyuridine triphosphate atau digoxigenin uridine triphosphate dengan timidine. Setelah renaturasi DNA asli dengan probe, kompleks probe-DNA dapat dideteksi dengan penambahan avidin pengikat biotin berlabel fluorokrom atau anti-digoxigenin berlabel fluorokrom. Peningkatan sinyal tambahan dapat diperoleh dengan menambahkan antiavidin dan mempelajari kompleks yang dihasilkan menggunakan mikroskop fluoresensi. Dengan memberi label pada probe DNA yang berbeda dengan beberapa fluorokrom yang berbeda, dimungkinkan untuk memvisualisasikan beberapa kromosom atau segmen kromosom dalam satu sel secara bersamaan sebagai sinyal multi-warna.

Kemungkinan definisi segmen gen tertentu, ada atau tidak ada pada kromosom, memungkinkan untuk mendiagnosis sindrom urutan gen pada tingkat DNA, serta translokasi dalam inti interfase, seringkali pada sel individu.

Bahan untuk IKAN baik kromosom metafase yang diperoleh dari sel yang membelah atau inti interfase dari sel yang tidak berada pada tahap pembelahan dapat berfungsi. Bagian diberi perlakuan awal dengan RNase dan proteinase untuk menghilangkan RNA yang dapat berhibridisasi silang dengan probe dan kromatin. Mereka kemudian dipanaskan dalam formamida untuk mengubah sifat DNA dan difiksasi dengan alkohol dingin. Probe kemudian disiapkan untuk hibridisasi dengan pemanasan. Probe dan preparasi kromosom kemudian dicampur dan ditutup dengan kaca penutup pada suhu 37°C untuk hibridisasi. Dengan memvariasikan suhu inkubasi atau komposisi garam larutan hibridisasi, spesifisitas pengikatan dapat ditingkatkan dan pelabelan latar belakang dapat dikurangi.

Penerapan hibridisasi fluoresen in situ - teknologi FISH

Efisiensi teknologi IKAN pertama kali ditunjukkan dengan melokalisasi gen ke . Dengan diperkenalkannya pelabelan fluoresen, hibridisasi in situ terbukti sangat diperlukan untuk mendiagnosis kelainan kromosom yang tidak terdeteksi oleh metode pita tradisional. IKAN juga memainkan peran penting dalam salah satu penemuan paling luar biasa dalam genetika modern: pencetakan genom.

Teknologi pengembangannya IKAN diterima dalam tiga bentuk. Sentromer, atau satelit alfa, probe dicirikan oleh spesifisitas kromosom relatif dan paling sering digunakan dalam genetika sel interfase. Probe ini menghasilkan sinyal yang agak menyebar dengan kekuatan yang memadai di wilayah sentromer, tetapi tidak melakukan hibridisasi silang dengan kromosom yang memiliki urutan sentromer serupa. Saat ini, probe salinan tunggal telah dikembangkan yang memberikan sinyal diskrit dari pita kromosom tertentu dan menghindari fenomena hibridisasi silang. Pemeriksaan ini juga dapat digunakan untuk menentukan jumlah salinan dan wilayah spesifik kromosom yang diduga terkait dengan sindrom tertentu. Probe salinan tunggal dan sentromer yang dirancang untuk kromosom 13, 18, 21, X dan Y digunakan untuk diagnosis prenatal.

Dimungkinkan juga untuk “mewarnai” seluruh kromosom dengan menggunakan IKAN. Berkat teknologi kariotipe spektral, yang menggunakan campuran fluorokrom berbeda, kini dimungkinkan untuk membuat pola fluoresen unik untuk setiap kromosom individu dengan 24 warna terpisah. Teknologi ini memungkinkan untuk mendeteksi penataan ulang kromosom kompleks yang tidak terlihat menggunakan teknik sitogenetik tradisional.

metode IKAN dalam diagnosis prenatal. Bagi wanita usia reproduksi lanjut, kehamilan bukan lagi hal yang membahagiakan, melainkan kekhawatiran. Usia seorang wanita dikaitkan dengan risiko terjadinya kelainan kromosom janin. Amniosentesis, dilakukan pada usia kehamilan 16 minggu, dilanjutkan dengan analisis kariotipe, memakan waktu 10-14 hari. Penggunaan IKAN dalam pemeriksaan pendahuluan dapat mempercepat diagnosis dan mengurangi waktu tunggu. Kebanyakan ahli genetika dan laboratorium berpendapat bahwa IKAN tidak boleh digunakan secara terpisah untuk mengambil keputusan mengenai penatalaksanaan kehamilan lebih lanjut. Metode FISH harus dilengkapi dengan analisis kariotipe, dan hasilnya setidaknya harus berkorelasi dengan gambaran patologis USG atau skrining biokimia dalam darah ibu.

Sindrom gen urutan juga dikenal sebagai sindrom mikrodelesi atau aneusomia segmental. Ini adalah penghapusan fragmen kromosom yang berdekatan, biasanya melibatkan banyak gen. Sindrom urutan gen pertama kali dijelaskan pada tahun 1986 menggunakan teknik sitogenetik klasik. Sekarang, berkat FISH, penghapusan submikroskopis pada tingkat DNA dapat diidentifikasi, yang memungkinkan untuk mengidentifikasi wilayah terkecil yang terhapus terkait dengan perkembangan sindrom tertentu, yang disebut wilayah kritis. Setelah wilayah kritis untuk suatu sindrom telah diidentifikasi, seringkali dimungkinkan untuk mengidentifikasi gen spesifik yang ketidakhadirannya dianggap terkait dengan sindrom tersebut. Manual terbaru tentang sindrom urutan gen melaporkan 18 sindrom penghapusan dan mikrodelesi yang terkait dengan 14 kromosom. Beberapa sindrom urutan gen yang paling umum dan manifestasi klinisnya diberikan dalam Tabel. 5-2.

Telomer- formasi yang menutupi ujung lengan panjang dan pendek kromosom. Mereka terdiri dari pengulangan urutan TTAGGG dan mencegah fusi ujung kromosom satu sama lain. Probe telomerik memainkan peran penting dalam mengenali translokasi kompleks yang tidak dapat dideteksi dengan metode sitogenetik tradisional. Selain itu, salah satu penemuan Proyek Genom Manusia adalah fakta bahwa wilayah kromosom yang berdekatan dengan telomer kaya akan gen. Kini telah terbukti bahwa penghapusan subtelomer submikroskopik bertanggung jawab atas terjadinya banyak penyakit yang ditentukan secara genetik.

Hibridisasi asam nukleat in situ Metode ini didasarkan pada kemungkinan pembentukan hibrida beruntai ganda antara probe berlabel yang dibuat secara artifisial berdasarkan rangkaian beruntai tunggal (ribo- atau deoksiribo-, oligo- atau polinukleotida) dan rangkaian komplementernya dalam target. - molekul DNA atau RNA yang dianalisis. Untuk mengidentifikasi area hibridisasi, probe DNA (probe DNA) diberi label dengan kelompok pelapor apa pun: isotop radioaktif, fluorokrom, enzim yang menghasilkan pewarna atau produk bercahaya, hapten yang mengikat tubuh yang diberi label, dll.

Dengan mengidentifikasi hibrida karena kehadiran kelompok reporter dalam penyelidikan, dimungkinkan untuk - memperkirakan jumlah gen yang mengkode jenis RNA tertentu, - menentukan proporsi DNA yang tidak ditranskripsi dalam genom, - membangun keterkaitan gen tertentu satu sama lain - dan lokasi persisnya pada kromosom. Metode hibridisasi molekuler memiliki sensitivitas tinggi (dimungkinkan untuk mendeteksi sejumlah kecil probe berlabel (10 -15 dan 10 -19 M) dan, karenanya, urutan pelengkapnya dalam target) dan analisis cepat, yang memungkinkan untuk digunakan metode ini baik untuk kegiatan penelitian maupun untuk diagnosis penyakit keturunan dan penyakit menular dalam bidang kedokteran, kedokteran hewan dan budidaya tanaman.

Munculnya teknologi baru sitogenetika molekuler, yang terutama didasarkan pada hibridisasi asam nukleat in situ, telah secara signifikan memperluas kemungkinan diagnostik kromosom.

Sitogenetika interfase: 1. Pita kromosom multiwarna (MCB). 2. Hibridisasi fluoresensi in situ (IKAN). 3. Kombinasi IKAN dengan metode lain: -sitologi + IKAN; -histologi + IKAN; -immunophenotyping + IKAN (FIKSI); Sitogenetika metafase: 1. Lukisan keseluruhan kromosom. 2. Hibridisasi genom komparatif (CGH). 3. Kariotipe perubahan warna (CCK). 4. Kariotipe multiwarna: kariotipe spektral (SKY); IKAN beraneka warna (M - IKAN, M - BAND).

IKAN – hibridisasi fluoresensi in situ – adalah metode sitogenetik yang digunakan untuk mendeteksi dan melokalisasi rangkaian DNA spesifik pada kromosom, RNA kecil, dll. Teknik ini didasarkan pada hibridisasi probe DNA/RNA berlabel fluoresensi dengan DNA/RNA komplementer urutan. Label dideteksi menggunakan mikroskop fluoresen. Metode FISH diperkenalkan lebih dari 30 tahun yang lalu. Ini tersebar luas sebagai metode pemetaan fisik gen pada kromosom. Ini kemudian diterapkan pada bidang penelitian lain (genetika klinis, kedokteran reproduksi, toksikologi, biologi evolusi, genomik komparatif dan seluler, dan biologi kromosom). Saat ini, IKAN terutama digunakan untuk membuat peta fisik dan genetik kromosom, untuk mengidentifikasi penataan ulang struktural, translokasi, mikrodelesi, dan amplifikasi gen pada kromosom interfase dan metafase. Sebagai hasil dari kemajuan ilmiah (pemahaman yang lebih baik tentang sifat kimia dan fisik asam nukleat dan kromatin), serta perkembangan mikroskop fluoresensi dan pencitraan digital, metode ini terus ditingkatkan (sensitivitas, spesifisitas, resolusi meningkat), dan banyak variasi metode ini telah dikembangkan.

1) Sel dijatuhkan ke kaca objek yang menyebabkan kromosom menyebar. 4) Kromosom diberi pewarnaan balik menggunakan DAPI. 2) Probe berlabel fluoresensi ditempatkan pada kromosom dan disegel. 3) Probe dan kromosom didenaturasi, dihibridisasi, lalu dicuci. 5) Slide dilihat di bawah mikroskop fluoresen

Gambaran umum protokol penentuan stadium IKAN dapat disajikan sebagai berikut: 1. Pembuatan sediaan histologis atau sitologi. Persiapan spesimen histologis dilakukan sesuai dengan prosedur standar: pemotongan, penandaan, pengkabelan, pengisian, mikrotomi, penempatan potongan pada kaca objek dan dewaxing. Saat menyiapkan sediaan sitologi, larutan pengendap khusus dan sentrifugasi digunakan, yang memungkinkan diperolehnya suspensi sel pekat. 2. Pra-perawatan (bila perlu). Obat tersebut diobati dengan protease untuk menghilangkan keberadaan protein yang menghambat hibridisasi. 3. Penerapan probe DNA pada preparasi dan denaturasi selanjutnya. Untuk mengubah sifat probe dan sampel DNA, mereka diberi formamida dan dipanaskan hingga suhu sekitar 85 -900 C.

4. Hibridisasi. Setelah denaturasi, obat didinginkan hingga suhu tertentu (370 C dalam kasus uji klinis) dan diinkubasi dalam ruang lembab selama beberapa jam (durasi inkubasi ditunjukkan dalam setiap protokol spesifik). Saat ini, hibridisasi otomatis digunakan untuk denaturasi dan hibridisasi. 5. Mencuci. Setelah hibridisasi selesai, probe yang tidak terikat perlu dibersihkan, yang jika tidak maka akan menimbulkan latar belakang yang akan mempersulit evaluasi hasil analisis FISH. Larutan yang mengandung natrium sitrat dan klorida (SSC) biasanya digunakan untuk membilas. 6. Kontra-pewarnaan. Menggunakan pewarna fluoresen (DAPI - 4, 6-diamidin-2 phenylindole; propidium iodide), semua DNA inti diwarnai. 7. Analisis hasil menggunakan mikroskop fluoresensi Pengoperasian rutin (dewaxing, pra-perawatan, pencucian) dapat dilakukan secara otomatis.

Studi daerah telomer menggunakan mikroskop fluoresen. Gambar yang diperoleh pada tahap interfase (inti) dan metafase (kromosom individu) digabungkan. warna biru - DAPI.

Keunggulan metode FISH: 1. kemampuan mempelajari materi genetik pada inti interfase; 2. memperoleh hasil objektif berdasarkan prinsip “ya/tidak” - ini adalah metode kuantitatif; 3. interpretasi hasil yang relatif sederhana; resolusi tinggi. Kekurangan metode FISH: 1. pewarna fluoresen cepat “memudar”; 2. tinggi -Pewarna fluoresen berkualitas diperlukan untuk menganalisis hasil mikroskop.

Metode FISH didasarkan pada reaksi hibridisasi antara probe DNA yang dibuat menggunakan teknologi khusus, yang merupakan urutan nukleotida berukuran terbatas, dan wilayah pelengkap DNA inti dari sediaan sitogenetik yang diteliti. Penyelidikan DNA, elemen utama untuk IKAN, membawa “tag”, yaitu berisi nukleotida yang terkait langsung dengan fluorokrom atau hapten untuk visualisasi lebih lanjut oleh antibodi yang membawa fluorokrom. DNA berlabel yang tidak terikat dicuci, dan kemudian probe DNA hibridisasi dideteksi menggunakan mikroskop fluoresensi.

Pelabelan DNA dibagi menjadi langsung dan tidak langsung. Pelabelan langsung, pengenalan elemen reporter ke dalam DNA - fluorokrom (rhodamine, diethylaminocoumarin, Texas red, dll.). Metode pelabelan tidak langsung - sampel DNA telah dikonjugasikan sebelumnya dengan ligan perantara (biotin, dioksigenin, 2, 4-dinitrofenol), yang keberadaannya pada sediaan sitologi kemudian dideteksi menggunakan fluorokrom. Dalam hal ini, sensitivitas metode ini meningkat secara signifikan, karena ligan mungkin mengandung beberapa situs interaksi dengan fluorokrom. Hibridisasi in situ dengan probe berlabel 32 P pertama kali dijelaskan pada tahun 1969. Perkembangan sistem non-radioaktif untuk pelabelan dan pendeteksian probe DNA telah menjadikan metode hibridisasi in situ aman, mudah dilakukan, dan tidak memakan banyak tenaga dalam memproses hasilnya. Pewarna fluoresen ringan dan mudah digunakan, dapat disimpan tanpa batas waktu, memberikan resolusi tinggi, dan memungkinkan pemeriksaan beberapa rangkaian DNA secara bersamaan.

Probe: probe berlabel primer/sekunder DNA/RNA untai tunggal/untai ganda. Probe diberi label: 1) secara langsung: dengan memasukkan nukleotida yang ditempelkan fluorokrom (PCR atau terjemahan nick) 2) melalui molekul reporter (misalnya: digoxigenin, biotin) yang ditempelkan antibodi berlabel fluoresensi. Untuk meningkatkan sinyal, antibodi sekunder, tersier, dll. yang diberi label fluoresen dapat digunakan. DNase mencegat DNA Nick Translation DNA polimerase I menambahkan nukleotida baru ke 3’ hidroksil DNA polimerase I menghilangkan basa individu dari ujung 5’ Visualisasi kromosom: menggunakan DAPI (2 mg/ml). 4', 6 -diamidino-2 -fenilindol; pengikatan kuat pada daerah DNA kaya AT; eksitasi dengan sinar UV; emisi 461 nm (biru).

Saat ini, ada beberapa pendekatan utama yang banyak digunakan dalam sitogenetika molekuler modern: Identifikasi materi dari wilayah kromosom yang diperluas dan keseluruhan kromosom. Deteksi urutan DNA tertentu di wilayah yang diminati. Analisis ketidakseimbangan wilayah kromosom individu. Untuk mengidentifikasi materi wilayah kromosom yang diperluas dan seluruh kromosom, probe DNA spesifik kromosom dan spesifik wilayah (“probe lukisan”) banyak digunakan.

Karakteristik probe dari berbagai jenis 1. probe spesifik lokus (LSI - lokus - pengidentifikasi spesifik yang mengikat daerah kromosom tertentu.) Probe ini digunakan untuk mengidentifikasi urutan pendek (tidak berulang) dari DNA terisolasi yang ada, yang digunakan untuk menyiapkan probe berlabel dan hibridisasi selanjutnya dengan set kromosom. Mereka dimaksudkan untuk mengidentifikasi penyimpangan kromosom yang signifikan secara diagnostik dan prognostik dalam berbagai kondisi patologis (monosom dan trisomi pada kromosom individu). Sampel ini paling banyak digunakan dalam diagnostik sitogenetik prenatal, terutama dalam studi sel jaringan korionik dan inti interfase amniosit.

2. Pemeriksaan DNA untuk daerah telomer kromosom (TEL telomericprobe) dirancang untuk mendeteksi penghapusan dan penataan ulang yang mempengaruhi bagian terminal lengan kromosom. Probe semacam itu spesifik untuk lengan p atau q kromosom dan saling melengkapi pada wilayah yang panjangnya sekitar 300 kb. dari ujung kromosom. Biasanya, pemeriksaan DNA untuk lengan kromosom pendek dan panjang dikaitkan dengan fluorokrom yang berbeda, yang memungkinkan untuk mendeteksi kedua daerah telomer kromosom pada satu sediaan sitogenetik.

3. probe pengulangan sentromer, probe enumerasi alfoid atau kromosom (CEP - centromere. Enumeration. Probe) adalah probe DNA spesifik kromosom yang diwakili oleh rangkaian pengulangan satelit tandem alfa dan beta. Pengulangan ini terutama terletak di daerah heterokromatik sentromerik atau perikentromerik pada kromosom. Dengan bantuan mereka, setiap kromosom dapat dicat dengan warna berbeda, yang memungkinkan Anda dengan cepat menentukan jumlah kromosom dan penyimpangan dari jumlah normalnya, 4. probe untuk seluruh kromosom, probe kromosom utuh (WCP – Whole-Chromosome- Lukisan adalah satu set probe kecil, yang melengkapi masing-masing bagian kromosom, tetapi umumnya menutupi seluruh panjangnya. Dengan menggunakan perpustakaan probe semacam itu, dimungkinkan untuk “mewarnai” seluruh kromosom dan memperoleh kariotipe spektral diferensial suatu individu. Jenis analisis ini digunakan untuk menganalisis penyimpangan kromosom, seperti translokasi, ketika bagian dari satu kromosom dipindahkan ke lengan kromosom lainnya.

Area penerapan IKAN banyak digunakan untuk memecahkan masalah diagnostik klinis berikut: 1. Periimplantasi prenatal dan diagnosis kelainan kromosom. Digunakan di klinik fertilisasi in vitro (IVF) dan pusat perinatal. Memungkinkan tepat waktu (sebelum implantasi embrio dalam kasus IVF atau pada tahap awal perkembangan janin) untuk mengidentifikasi kelainan genetik pada anak yang belum lahir dan mengambil tindakan yang diperlukan. 2. Onkohematologi. Penyakit onkohematologi muncul sebagai akibat dari berbagai kelainan kromosom, oleh karena itu, probe CEP dan LSI yang sesuai digunakan untuk mendiagnosisnya. 3. Diagnosis tumor padat. Saat ini, semakin banyak hubungan sebab-akibat yang terjalin antara perkembangan penyakit onkologis tertentu dan perubahan genom spesifik penyakit tersebut. Oleh karena itu, dengan menggunakan probe DNA yang sesuai, diagnosis onkologis FISH dapat dilakukan.

Sitogenetika interfase: Kombinasi IKAN dengan metode lain: - FISH immunophenotyping (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping dan Interfase Cytogenetics sebagai Alat Investigasi Neoplasma) – untuk mempelajari sel tumor. Untuk analisis ini, apusan darah, sumsum tulang, atau preparat jaringan lain yang tidak diwarnai digunakan. Tahap 1 - obat diinkubasi dengan antibodi monoklonal spesifik, tahap 2 - konjugasi dengan fluorofor dilakukan untuk visualisasi selanjutnya dari kompleks antibodi antigen-monoklonal. Tahap 3 - hibridisasi in situ dengan probe DNA dilakukan. Fluorofor yang berbeda warnanya digunakan untuk mendeteksi antibodi monoklonal dan pemeriksaan DNA. Mempelajari obat di bawah mikroskop fluoresensi dengan adanya serangkaian filter yang diperlukan memungkinkan analisis simultan dari hibridisasi imunofenotipe dan sinyal dalam inti interfase.

Penghapusan kromosom TNFAIP 3 di c. HL terdeteksi oleh interphasecytogenetics. Analisis FIKSI dari. perwakilan c. Penggabungan kasus HL. Ekspresi CD 30 (merah) dan probe FISH untuk sentromer TNFAIP 3 dan kromosom 6 (biru [b]). Dalam pengujian warna ganda pada A – C dan E dan F, probe TNFAIP 3 diberi label dengan warna hijau (g); dalam pengujian tiga warna yang diterapkan di D, probe TNFAIP 3 memberikan sinyal colocalized (co) g/oranye. Dua strategi berbeda digunakan untuk menampilkan uji IKAN dua warna dan tiga warna dalam kombinasi dengan imunofluoresensi CD 30; Saya. e. , pengujian warna ganda (A–C dan E dan F) ditampilkan menggunakan tampilan tiga warna, sedangkan tampilan multiwarna palsu seperti yang diperoleh perangkat lunak Isis diterapkan untuk pengujian tiga warna (D) untuk menampilkan empat warna secara bersamaan ( yaitu CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] dan oranye, dan kromosom 6 sentromer [b]).

Perekaman digital gambar mikro telah membuka kemungkinan untuk mengubah tidak hanya kombinasi fluorofor menjadi warna semu, tetapi juga rasio intensitasnya.

Pewarnaan kromosom multiwarna (Muli. Color Banding - MCB) Metode ini tidak dimaksudkan untuk analisis lengkap seluruh kromosom, tetapi untuk analisis detail suatu kromosom individu. Probe DNA spesifik lokus diberi label dengan fluorofor berbeda atau kombinasi fluorofor sedemikian rupa sehingga tingkat sinyal setiap probe DNA bervariasi dalam intensitasnya. Profil intensitas sinyal yang tumpang tindih pada probe DNA memberikan variasi dalam rasio intensitas fluoresensi berbagai fluorofor di sepanjang kromosom. Rasio intensitas dapat diubah menjadi warna semu, dan dengan demikian, setiap titik dalam gambar, dan akibatnya, setiap lokus kromosom, akan memiliki warna semu sendiri. Versi metode IKAN multiwarna ini ternyata sangat efektif dalam analisis tidak hanya penataan ulang antarkromosom, tetapi juga penataan ulang intrakromosom pada kanker. Namun, agar penggunaannya berhasil, perlu ditentukan terlebih dahulu kromosom yang akan diperiksa. Metode sitogenetika molekuler ini cocok untuk menganalisis kelainan kariotipe yang berhubungan dengan kromosom tertentu.

Hingga saat ini, rangkaian probe DNA telah dibuat yang menyediakan MSV untuk semua kromosom manusia Pita multiwarna dari kromosom manusia kelima (ilustrasi oleh Meta. Systems Gmb. H) (hibridisasi in situ dari perpustakaan DNA spesifik wilayah pada kromosom 5; sinyal profil perpustakaan DNA spesifik wilayah pada kromosom 5; pita multiwarna pada kromosom 5; idiogram kromosom 5; fluorokrom digunakan untuk MSV).

Sitogenetika metafase, yang secara historis muncul lebih awal dari sitogenetika interfase, memungkinkan untuk mendeteksi berbagai kelainan kromosom, tetapi untuk itu sel yang diteliti harus berada pada tahap metafase meiosis.

Kariotipe multiwarna Analisis dilakukan dengan menggunakan probe DNA untuk pewarnaan terus menerus pada lengan atau seluruh kromosom (probe WCP - cat seluruh kromosom). Probe semacam itu berhibridisasi menjadi banyak rangkaian DNA pendek yang terletak di sepanjang kromosom. Jadi, ketika diperiksa di bawah mikroskop fluoresensi, kromosom tampak berwarna seragam dalam warna tertentu.

Probe DNA yang digunakan untuk analisis ini terdiri dari campuran probe warna solid untuk kelengkapan lengkap kromosom manusia, diberi label dengan kombinasi beberapa fluorokrom, yang rasionya dipilih secara individual untuk setiap pasangan kromosom. Penggunaan metode registrasi yang tepat dan program analisis gambar komputer yang mengevaluasi intensitas pendaran semua fluorokrom untuk setiap titik gambar memungkinkan dilakukannya kariotipe, di mana setiap pasangan kromosom memiliki “warna semu” yang unik.

M-FISH (multitarget multifluor multicolor atau multiplex. FISH) adalah nama generik untuk IKAN multiwarna tradisional yang menggunakan rangkaian filter khusus fluorokrom. Prinsip M-FISH terdiri dari perekaman digital terpisah dari sinyal semua fluorokrom yang digunakan, yang dicapai dengan mengubah set filter secara berurutan. Semua gambar direkam dalam file terpisah, yang memungkinkan pemrosesan efisien terkait dengan pemisahan sinyal dan latar belakang, serta penilaian kuantitatif sinyal. Pemrosesan semua informasi yang direkam menggunakan perangkat lunak khusus mengubah informasi tentang tingkat sinyal fluorokrom di setiap titik gambar menjadi warna semu. Salah satu keterbatasan utama dalam jumlah probe DNA yang digunakan adalah jumlah fluorokrom yang tersedia, dengan spektrum eksitasi dan emisi yang tidak tumpang tindih, dan ketersediaan set filter yang sesuai.

IKAN 24 warna M-FISH paling banyak digunakan sebagai IKAN 24 warna untuk identifikasi simultan materi dari semua kromosom manusia. Ini sangat efektif dalam mendeteksi translokasi kromosom, tetapi tidak dimaksudkan untuk mendeteksi penghapusan dan inversi. Namun, masalah ini sebagian dapat diselesaikan dengan pewarnaan kromosom secara simultan dengan DAPI, yang memungkinkan untuk menganalisis perbedaan pergoresan kromosom yang afiliasi kromosomnya telah diidentifikasi. Sayangnya, perlu dicatat bahwa kualitas pita kromosom DAPI setelah M-FISH secara signifikan lebih rendah daripada pewarnaan diferensial GTG dan bahkan pita DAPI setelah hibridisasi in situ konvensional.

Rx. IKAN Prinsip M-FISH digunakan untuk membuat kode batang multiwarna untuk kromosom manusia dan metode pita kromosom multiwarna berdasarkan hibridisasi in situ antarspesies. Berbeda dengan IKAN 24 warna, metode ini memungkinkan deteksi langsung beberapa penataan ulang intrakromosom. Probe DNA yang digunakan di Rx. IKAN, diberi label kombinasi 3 fluorokrom sehingga menghasilkan 7 warna semu. Mereka secara khusus menodai masing-masing bagian kromosom, menciptakan guratan berwarna. Ini adalah fitur sampel DNA untuk Rx. IKAN ditentukan oleh cara memperolehnya. Mereka adalah perpustakaan DNA spesifik kromosom dari dua spesies owa: Hylobates concolor dan Hylobates syndactylus.

Akibat penataan ulang kromosom yang intens yang terjadi selama pembentukan spesies owa modern, materi kromosomnya ternyata sangat terkocok dibandingkan dengan pengorganisasian kromosom pada manusia, yang kromosomnya terkenal konservatisme. Hubungan antara kromosom 1 manusia dan kromosom siamang ditunjukkan pada Gambar 1.

Gambar 2 menunjukkan gambaran umum kromosom manusia yang diperoleh dari hasil Rx. IKAN. a) Pelat metafase b) Tata letak kromosom.

Namun, RXFISH memiliki keterbatasan yang cukup serius - penataan ulang kromosom yang terjadi dalam satu pita RX warna tidak dapat dideteksi menggunakan metode ini kecuali jika hal tersebut menyebabkan perubahan yang signifikan dan mudah terlihat pada ukuran pita tersebut. - probe mewarnai beberapa daerah kromosom dari kromosom yang berbeda dalam satu warna semu. Namun, dengan peningkatan jumlah fluorokrom yang digunakan, RXFISH pasti akan lebih informatif dibandingkan IKAN 24 warna biasa.

Keunggulan RXFISH saat ini mencakup hal-hal berikut: Metode ini memungkinkan analisis seluruh genom manusia dalam satu eksperimen IKAN multiwarna. Kit probe berlabel DNA yang tersedia secara komersial dan sistem deteksi yang diperlukan juga tersedia. Metode ini memungkinkan identifikasi cepat sebagian besar penataan ulang intra dan antarkromosom. Identifikasi otomatis kromosom “pita warna” metafase dimungkinkan. Untuk setiap kromosom manusia terdapat kode batang warna yang unik. RXFISH diintegrasikan ke dalam stasiun kerja Cyto. Penglihatan dan sistem mikroskop fluoresensi standar.

Kariotipe spektral (SKY-spectralkaryotyping) Prinsip dasar analisis gambar mikroskopis untuk kariotipe spektral secara praktis sama dengan yang digunakan untuk M-FISH. Perbedaannya terkait dengan cara pendaftaran gambar. Teknologi SKY memungkinkan Anda memperoleh kurva spektral untuk semua titik gambar dalam satu pengukuran, terlepas dari apakah itu terkait dengan epifluoresensi atau mikroskop cahaya tradisional. Untuk kariotipe spektral semua kromosom manusia, lima fluorokrom digunakan, satu dalam spektrum hijau, dua dalam spektrum merah dan dua dalam inframerah. Eksitasi dan emisi semua fluorokrom yang digunakan dalam pelabelan probe DNA terjadi dengan satu set filter, yang menghindari perubahan berurutan, pemfokusan antara, dan, akibatnya, masalah terkait seperti pergeseran gambar spasial, penentuan nilai ambang batas, dan topeng segmentasi. Berdasarkan analisis kurva spektral, ditentukan ada tidaknya fluorokrom spesifik pada suatu titik tertentu.

Langkah selanjutnya adalah prosedur klasifikasi, yang memungkinkan seseorang untuk secara langsung dan jelas menentukan identitas kromosom dari bahan yang dianalisis. Hal ini memastikan identifikasi yang andal (dalam keakuratan kromosom) dari bahan kromosom penanda, serta turunan kromosom yang dihasilkan dari berbagai penataan ulang. Keuntungan besar SKY adalah warna DAPI direkam sejajar dengan gambar spektral. Peningkatan perangkat lunak pada pita DAPI memungkinkan tercapainya coretan diferensial dalam kualitas yang mendekati pita GTG. Kemungkinan analisis paralel dari gambar spektral dan pewarnaan diferensial kromosom berkualitas tinggi sangat menyederhanakan interpretasi hasil SKY dan memungkinkan penentuan titik kerusakan kromosom dengan lebih akurat. Keunggulan SKY yang tidak diragukan lagi termasuk kemampuan untuk menggunakan fluorokrom dengan spektrum eksitasi dan emisi yang tumpang tindih, yang secara signifikan memperluas daftar fluorokrom yang cocok untuk digunakan, dan juga meningkatkan jumlah fluorokrom yang dapat digunakan secara bersamaan. Dimasukkannya fluorochrome baru dalam daftar tidak memerlukan pembelian satu set filter baru, karena satu bank filter untuk spektral IKAN dan satu bank filter untuk DAPI sudah cukup untuk SKY.

Kekurangan SKY meliputi: - waktu pemaparan yang lama, diperlukan untuk merekam gambar mikroskopis. - SKY agak kurang efektif dibandingkan M-FISH, jika diperlukan penelitian dengan probe DNA yang relatif kecil.

Kariotipe perubahan warna (CCKc Kariotipe perubahan warna) Metode ini didasarkan pada analisis perbedaan panjang sinyal antara sampel DNA yang dihibridisasi dengan probe DNA yang terkait dengan fluorokrom dan dengan probe DNA yang membawa antibodi. Metode ini dapat dilakukan hanya dengan 3 filter dan tidak memerlukan kamera atau perangkat lunak khusus. Untuk mengidentifikasi kromosom, dilakukan satu hibridisasi dan diperoleh dua gambar. Metode ini didasarkan pada perbedaan panjang sinyal fluoresen, karena waktu pemaparan sampel DNA yang terkait dengan antibodi adalah 80 - 90% lebih sedikit dibandingkan dengan sampel yang terkait dengan fluorokrom. Setelah reaksi hibridisasi, apusan dipaparkan pada antibodi primer yang sesuai dan kemudian dicitrakan untuk mendapatkan gambar pertama. Slide tersebut kemudian dipaparkan pada antibodi sekunder dan avidin yang digabungkan dengan fluorokrom yang sama. Noda dapat diimbangi dengan menggunakan DAPI.

Selanjutnya gambar sediaan diperoleh kembali dengan menggunakan 3 filter secara bergantian. Gambar-gambar ini dibandingkan menggunakan perangkat lunak khusus untuk menghasilkan gambar kedua di mana hanya kromosom yang terkait dengan antibodi tertentu yang akan terlihat. Jadi, beberapa kromosom hanya akan berpendar pada gambar pertama atau kedua, sementara kromosom lainnya akan berubah warna pada gambar yang berbeda.

Hibridisasi genom komparatif (CGH) Metode ini diciptakan untuk mendeteksi kelainan kuantitatif pada genom. Hal ini didasarkan pada reaksi hibridisasi in situ menggunakan seluruh genom sebagai probe DNA. DNA donor yang terisolasi dan normal diberi label dengan fluorokrom dengan warna berbeda, sehingga mengubahnya menjadi probe DNA. Probe ini dalam jumlah yang setara dicampur dan digunakan dalam hibridisasi dengan sediaan sitogenetik kontrol. Setelah FISH, metafase dianalisis pada mikroskop fluoresensi, menggunakan program analisis gambar komputer khusus untuk menentukan intensitas fluoresensi dua fluorokrom di sepanjang setiap kromosom.

Dengan tidak adanya perubahan kuantitatif pada kariotipe sampel yang diteliti, rasio intensitas pendaran kedua fluorokrom tertentu akan diamati. Dalam kasus amplifikasi gen, intensitas sinyal fluorokrom yang sesuai akan meningkat, dan jika sebagian materi genetik hilang, sebaliknya, akan melemah. Dengan demikian, CGH dapat mendeteksi ketidakseimbangan genom, namun metode ini tidak dapat digunakan untuk mendeteksi translokasi dan inversi seimbang, dan trisomi serta penghapusan hanya dapat dideteksi jika ukuran wilayah yang tidak seimbang setidaknya 10 juta pasangan basa.

Ketidakseimbangan kromosom dalam sampel uji dinilai berdasarkan perbedaan intensitas fluoresensi dua fluorokrom yang berbeda dengan menghitung rasio fluoresen (FR).

Metode CGH memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan metode analisis perubahan genom lainnya: Pertama, tidak bergantung pada sumber bahan yang dipelajari, dan dapat berhasil dilakukan dengan sejumlah kecil DNA yang diuji, termasuk bahan arsip. . Kedua, ini memungkinkan kita memperoleh informasi rinci tentang hilangnya atau peningkatan jumlah salinan materi genetik di seluruh genom dalam satu percobaan. Ketiga, metode CGH tidak memerlukan preparasi kromosom metafase dari jaringan yang diteliti, yaitu tidak bergantung pada proses kultur sel dan artefak terkait.

Hibridisasi situ genom (hibridisasi genomik situ dalam, GISH) adalah varian dari metode hibridisasi situ, yang terdiri dari fakta bahwa untuk hibridisasi dengan sampel tetap, total DNA genom dari satu spesies organisme digunakan sebagai probe berlabel fluoresensi, dengan dimana total DNA genom spesies organisme lain bersaing; digunakan untuk menentukan perbedaan interspesifik dan intraspesifik dalam genom, penataan ulang kromosom, penghapusan dan substitusi.

Variasi IKAN 1) Q-FISH – IKAN kuantitatif: Dikembangkan oleh Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward, dan P. M. Lansdorp. 1998. Telomer pendek pada kromosom manusia 17 hal. Nat. Genet. 18:76-80. Metode kuantitatif. Dirancang untuk digunakan dengan flow cytometry. Awalnya digunakan untuk mengukur panjang kromosom (resolusi: 200 bp) dengan menghitung jumlah pengulangan telomer. Probe terkonjugasi PNA digunakan. Awalnya dipelajari kromosom metafase (QFISH sendiri), sekarang metode ini juga berlaku untuk kromosom interfase (IQ-FISH). Q-FISH dilakukan pada kultur sel dan bagian jaringan (keduanya pada kaca). Saat ini, Q-FISH merupakan alat penting dalam mempelajari peran telomer dalam proses penuaan dan pembentukan kanker.

PNA-FISH - Asam nukleat peptida IKAN: Asam nukleat peptida (PNA) adalah analog sintetik DNA di mana tulang punggung gula deoksiribosa fosfat yang mendukung basa nitrogen digantikan oleh tulang punggung peptida yang tidak bermuatan. Akibat dari struktur ini: ketika probe oligomer PNA berhibridisasi dengan DNA/RNA komplementer, tidak terjadi tolakan elektrostatis. Dupleks PNA-DNA (PNA-RNA) jauh lebih stabil dibandingkan homo/heterodupleks alami. Spesifisitas pengikatan PNA-DNA yang tinggi: Hibridisasi PNA-DNA jauh lebih sensitif terhadap ketidakcocokan pasangan basa dibandingkan hibridisasi DNA-DNA. Jadi, dengan menggunakan probe PNA, dimungkinkan untuk membedakan dua pengulangan sentromer yang berbeda hanya dalam satu pasangan basa. PNA relatif hidrofobik (dibandingkan dengan DNA), sehingga PNA berdifusi lebih baik melalui dinding sel => digunakan secara luas dalam mikrobiologi. Berdasarkan spesifisitas pengikatan yang tinggi, teknologi PNA diyakini akan segera menjadi dasar pengembangan probe spesifik alel untuk hibridisasi in situ. Digunakan dalam genetika, sitogenetika, epigenetika, mikrobiologi, dll.

3) Flow-FISH – FISH untuk flow cytometry: Diusulkan pada tahun 1998: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Dinamika panjang telomer dalam subpopulasi limfosit manusia diukur dengan flow cytometry. Bioteknologi Alam. 16, 743–747 (1998). Kombinasi Q-FISH dan flow cytometry yang memungkinkan analisis sinyal (pengukuran) dan penyortiran. Flow-FISH menggunakan suspensi sel (untuk mengukur panjang telomer kromosom), penyebaran kromosom dan isolasi kromosom (untuk pemetaan lebih lanjut). Seperti pada Q-FISH, probe telomer berlabel PNA digunakan (misalnya, untuk memvisualisasikan dan mengukur panjang pengulangan telomer). Keuntungan utamanya adalah metode yang lebih cepat (analisis/penyortiran sejumlah besar sel/kromosom). Banyak digunakan untuk mempelajari berbagai masalah: penuaan, pelestarian telomer, studi tentang suspensi sel induk hematopoietik ex vivo, studi tentang bakteri.

Analisis multiparametrik memungkinkan diferensiasi jenis sel dalam satu sampel, memungkinkan pengendalian internal, dan analisis subtipe leukosit.

Keuntungan flow-FISH: Hasil yang mudah direproduksi Kemampuan menganalisis subset sel dalam suatu populasi menggunakan imunofluoresensi fisik dan penanda Kinerja lebih baik daripada Q-FISH Kemampuan memperoleh data fluoresensi kuantitatif dari ribuan sel.

STUDI KROMOSOM TERISOLASI menggunakan metode flow cytometry 1. Penyortiran kromosom menggunakan flow cytometry - Karyotyping menggunakan flow cytometry digunakan untuk pemetaan gen lebih lanjut dan konstruksi perpustakaan kromosom. - Identifikasi dan lokalisasi gen pada kromosom yang telah diurutkan dilakukan dengan selanjutnya menggunakan metode FISH/PRINS (prima in situ labeling) atau variasinya dan PCR spesifik kromosom. - Pada tahun 2011, hanya kromosom dari 17 spesies tanaman budidaya yang berhasil disortir. - Penyortiran kromosom metafase atau pachytene dengan indeks pembelahan tinggi.

Pelabelan fluoresen: - Kromosom diberi label dengan fluorokrom spesifik asam nukleat. - Fluorokrom dipilih sesuai dengan 1) spesifisitas basa nitrogen, 2) kondisi eksperimental (termasuk memperhitungkan panjang gelombang laser yang tersedia). 1. Untuk analisis monovarian, digunakan cat yang tidak spesifik untuk pasangan A-T atau G-C: propidium iodida (puncak eksitasi: 535 nm, puncak emisi: 617 nm, diperlukan laser: laser argon 488 nm atau lampu + filter long-pass) etidium bromida (puncak eksitasi : 300 dan 520 nm, emisi: 600 nm, diperlukan laser: laser argon 488 nm atau lampu + filter jarak jauh) Tag ini mewarnai DNA terlepas dari kandungan A, G, T atau basa nitrogen. 2. Untuk analisis bivariat gunakan: chromomycin (khusus untuk pasangan basa G-C), puncak eksitasi A 3: 458 nm, emisi 580 nm. Laser: , 458 nm minimum 400 m Daya V. Hoechst 33258 (khusus untuk pasangan basa A-T), eksitasi: 351 -364 nm, emisi: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (kuat). Laser harus dipisahkan dalam ruang dan waktu karena tumpang tindih sebagian spektrum fluorokrom.

2. Mempelajari urutan kromosom/nukleotida setelah disortir (untuk membuat peta fisik dan genetik, dll.) IKAN BAC-FISH PRINS C-PRINS Mempelajari genom besar dengan kromosom panjang. Pemetaan barisan dengan jumlah pengulangan yang banyak (misal: daerah telomer dan sentromer). Penggunaan probe pendek. Berkat banyaknya pengulangan, sinyalnya kuat. Ukuran probe standar: 15 – 30 nukleotida. IKAN

Tantangan IKAN: Urutan DNA lokus tunggal (yaitu, urutan DNA unik yang tidak berulang) sulit dilokalisasi karena sinyalnya akan sangat lemah jika menggunakan probe pendek standar. Meningkatkan panjang probe hingga beberapa kilobase untuk meningkatkan sinyal akan menyebabkan penurunan sensitivitas dan => pengikatan nonspesifik. Solusi: BAC-FISH -BAC-FISH adalah kombinasi FISH dan penggunaan klon DNA genom yang tertanam dalam kromosom buatan bakteri (BAC), memungkinkan penyisipan rangkaian DNA besar. -Metode yang efisien untuk mengidentifikasi dan memetakan kromosom individu organisme dengan genom kecil. Probe yang digunakan adalah probe BAC, overgos (oligonukleotida tumpang tindih).

Alternatif untuk IKAN: PRINS PRINS (pelabelan prima in situ) adalah metode pelabelan kromosom menggunakan anil primer DNA oligonukleotida dengan urutan homolog DNA kromosom terdenaturasi dan selanjutnya ekstensi enzimatik primer in situ dengan nukleotida berlabel. Pertama kali dijelaskan oleh Koch dkk. pada tahun 1989 (Koch, J.E., Kølvraa, S., Petersen, K.B., Gregersen, N., dan Bolund, I. (1989) Metode priming oligonukleotida untuk pelabelan spesifik kromosom pada DNA satelit alfa in situ. Kromosom 98, 259 –265). PRINS adalah alternatif dari IKAN. Ini digunakan untuk melokalisasi urutan nukleotida, mengenali dan menghitung kromosom metafase atau interfase atau pasangan kromosom (termasuk aneuploidi kromosom). anil primer tak berlabel (primer - primer) dengan DNA yang diteliti; pemanjangan primer menggunakan DNA polimerase termostabil dan nukleotida berlabel; menghentikan reaksi (melekatnya molekul penghambat pada ujung 3') Primer: fragmen restriksi produk PCR oligonukleotida Pelabelan nukleotida: - langsung (fluorokrom) - tidak langsung (biotin/ dig fluorochrome terkonjugasi avidin/ anti-dig) - Pada hasil setiap reaksi PRINS, hanya satu pasang kromosom homolog yang dapat diidentifikasi (satu kromosom). Reaksi PRINS berikutnya pada kaca yang sama hanya dapat dilakukan setelah kaca sebelumnya diblokir. - Digunakan untuk urutan DNA dengan jumlah pengulangan yang banyak.

Keunggulan PRINS: 1. Informasi sekuens minimal yang diperlukan untuk sintesis primer oligonukleotida. 2. Metode tercepat dan termudah untuk mendeteksi urutan yang kita minati pada kromosom (dibandingkan dengan penggunaan probe berat untuk IKAN, yang berhibridisasi dalam jangka waktu yang sangat lama). 3. Penghapusan tahap pelabelan probe. 4. Kemampuan untuk memanjangkan primer dengan nukleotida berlabel untuk meningkatkan sinyal c-PRINS ketika mendeteksi rangkaian pendek yang unik. Untuk mendeteksi pengulangan salinan rendah atau urutan unik pendek, metode yang lebih sensitif digunakan - cycle PRINS (c -PRINS). C-PRINS diusulkan oleh Gosden dkk. pada tahun 1991, protokol yang lebih baik dan banyak digunakan – Kubaláková dkk. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Lokalisasi sekuens DNA pada kromosom tumbuhan menggunakan PRINS dan C-PRINS. Metode dalam Ilmu Sel 23: 71 -82). C-PRINS melibatkan serangkaian siklus termal yang mirip dengan PCR.

Cairan selubung untuk IKAN: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry dan FISH untuk mengukur rata-rata panjang telomer (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Aliran penyortiran kromosom mitosis pada gandum biasa (Triticum aestivum L.). Genetika. 2000; 156(4): 2033 -41) -Mg . Jadi 4 buffer tanpa dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Kromosom yang diurutkan aliran: bahan yang bagus untuk pemetaan fisik gen tanaman. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99 -103 ) -diautoklaf 0,1% (berat/vol) Na. Cl -50m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Penyortiran Kromosom pada Gandum Tetraploid dan Potensinya untuk Analisis Genom. Genetika. 2005, 170(2): 823– 829) -Buffer poliamina penstabil kromosom (cairan selubung yang mengandung protein) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2 nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Hibridisasi fluoresensi in situ

Hibridisasi fluoresensi di situ , atau metode IKAN (eng. Fluoresensi di situ hibridisasi - IKAN ) - metode sitogenetik yang digunakan untuk mendeteksi dan menentukan posisi urutan DNA tertentu pada kromosom metafase atau inti interfase di situ. Selain itu, FISH digunakan untuk mendeteksi mRNA spesifik dalam sampel jaringan. Dalam kasus terakhir, metode FISH memungkinkan untuk menetapkan ciri-ciri spatiotemporal dari ekspresi gen dalam sel dan jaringan.

Penyelidikan

Dengan hibridisasi fluoresen di situ menggunakan probe DNA (probe DNA) yang mengikat target komplementer dalam sampel. Probe DNA mengandung nukleosida yang diberi label dengan fluorofor (pelabelan langsung) atau konjugat seperti biotin atau digoxigenin (pelabelan tidak langsung). Dengan pelabelan langsung, probe DNA yang terikat pada target dapat diamati menggunakan mikroskop fluoresensi segera setelah hibridisasi selesai. Dalam kasus pelabelan tidak langsung, prosedur pewarnaan tambahan diperlukan, di mana biotin dideteksi menggunakan avidin atau steptavidin berlabel fluoresensi, dan digoxigenin dideteksi menggunakan antibodi berlabel fluoresen. Meskipun versi tidak langsung dari pelabelan probe DNA memerlukan reagen dan waktu tambahan, metode ini biasanya memungkinkan seseorang mencapai tingkat sinyal yang lebih tinggi karena adanya 3-4 molekul fluorokrom pada antibodi atau molekul avidin. Selain itu, dalam kasus pelabelan tidak langsung, amplifikasi sinyal berjenjang dimungkinkan.

Untuk membuat sampel DNA, digunakan rangkaian DNA kloning, DNA genom, produk reaksi PCR, oligonukleotida berlabel, dan DNA yang diperoleh melalui mikrodiseksi.

Pelabelan probe dapat dilakukan dengan berbagai cara, misalnya dengan translasi nick atau PCR dengan nukleotida berlabel.

Prosedur hibridisasi

Skema percobaan hibridisasi fluoresensi di situ untuk melokalisasi posisi gen dalam nukleus

Tahap pertama melibatkan pembangunan probe. Ukuran probe harus cukup besar agar hibridisasi dapat terjadi pada lokasi tertentu, namun tidak terlalu besar (tidak lebih dari 1.000 bp) agar tidak mengganggu proses hibridisasi. Saat mengidentifikasi lokus tertentu atau saat mewarnai seluruh kromosom, hibridisasi probe DNA dengan rangkaian DNA berulang yang tidak unik perlu diblokir dengan menambahkan pengulangan DNA tanpa label ke dalam campuran hibridisasi (misalnya, DNA Cot-1). Jika probe DNA adalah DNA beruntai ganda, maka harus didenaturasi sebelum hibridisasi.

Pada tahap selanjutnya dilakukan persiapan inti interfase atau kromosom metafase. Sel difiksasi pada substrat, biasanya pada kaca objek, dan kemudian DNA didenaturasi. Untuk menjaga morfologi kromosom atau inti, denaturasi dilakukan dengan adanya formamida, yang memungkinkan suhu denaturasi diturunkan hingga 70°.

Visualisasi probe DNA yang terikat dilakukan dengan menggunakan mikroskop fluoresensi. Intensitas sinyal fluoresen bergantung pada banyak faktor - efisiensi pelabelan dengan probe, jenis probe, dan jenis pewarna fluoresen.

literatur

Rubtsov N.B. Metode bekerja dengan kromosom mamalia: Buku Teks. tunjangan / Novosibirsk. negara universitas. Novosibirsk, 2006.152 hal.

Rubtsov N.B. Hibridisasi asam nukleat di situ dalam analisis kelainan kromosom. Bab dalam buku “Pengantar Diagnostik Molekuler” Vol.2. “Metode genetik molekuler dalam diagnosis penyakit keturunan dan onkologis” / Ed. MA. Paltseva, D.V. Zaletaeva. Literatur pendidikan untuk mahasiswa kedokteran. M.: Kedokteran, 2011. T. 2. P. 100–136.

Catatan

Yayasan Wikimedia. 2010.

Lihat apa yang dimaksud dengan “Hibridisasi fluoresen in situ” di kamus lain:

Istilah ini memiliki arti lain, lihat hibridisasi. Hibridisasi DNA, hibridisasi asam nukleat, kombinasi in vitro asam nukleat untai tunggal komplementer menjadi satu molekul. Dengan saling melengkapi... ... Wikipedia

Metode penentuan hibridisasi fluoresensi in situ.

Materi yang sedang dipelajari Lihat deskripsi

Kunjungan rumah tersedia

Penelitian ini digunakan untuk memilih kemoterapi adjuvan individu untuk kanker payudara atau kanker perut.

Kanker payudara (BC) menempati urutan pertama penyakit kanker pada wanita. Sel tumor payudara mungkin mengandung berbagai jenis reseptor yang sensitif terhadap zat tertentu (hormon atau molekul aktif biologis lainnya). Tergantung pada keberadaan reseptor hormon (estrogen dan progesteron) atau reseptor faktor pertumbuhan epidermal manusia tipe 2 (HER2) dalam sel tumor, kanker payudara reseptor hormon positif, HER2 positif, dan triple negatif dibedakan. Hal ini penting untuk dipertimbangkan ketika memilih terapi secara individual dan memperkirakan keberhasilan pengobatan.

HER2 adalah reseptor yang ada di jaringan dan biasanya berpartisipasi dalam regulasi pembelahan dan diferensiasi sel. Kelebihannya pada permukaan sel tumor (ekspresi berlebih) menyebabkan pertumbuhan tumor yang cepat dan tidak terkendali, risiko metastasis yang tinggi, dan rendahnya efektivitas jenis pengobatan tertentu. Ekspresi HER2 yang berlebihan pada beberapa subtipe kanker payudara menyebabkan peningkatan proliferasi dan angiogenesis, serta disregulasi apoptosis (penghancuran sel yang diprogram secara genetik). Saat ini sudah ada obat yang menargetkan reseptor HER2. Ini khususnya adalah Herceptin (trastuzumab), yang merupakan antibodi monoklonal terhadap reseptor HER2/neu.

Amplifikasi dan ekspresi berlebih dari onkogen HER2 (ErbB-2) merupakan kejadian yang relatif spesifik untuk karsinoma payudara dan praktis tidak ditemukan pada tumor di lokasi lain. Kanker lambung (GC) adalah salah satu dari sedikit pengecualian: aktivasi HER2 diamati pada sekitar 10-15% kasus neoplasma ganas organ ini dan berkorelasi dengan perjalanan penyakit yang agresif. Pada kanker payudara HER2-positif, kelebihan reseptor HER2 mungkin terdapat pada permukaan sel tumor (disebut status HER2-positif atau Hercept-positif). Fenomena ini diamati pada 15-20% wanita yang menderita kanker payudara. Menilai status HER2 penting untuk menentukan taktik pengobatan.

Metode standar utama untuk mendeteksi ekspresi berlebih HER2/neu dan/atau amplifikasi gen HER2/neu adalah imunohistokimia (IHC) dan hibridisasi fluoresen in situ (FISH). Kedua penelitian tersebut dilakukan pada sediaan histologis (bagian bahan tumor yang tertanam dalam parafin) menggunakan antibodi poliklonal (IHC), probe fluoresen (FISH) dan berbagai sistem pencitraan.

Saat menilai hasil reaksi IHC, ekspresi hanya pada komponen invasif tumor diperhitungkan. Hasil reaksi dinilai menggunakan skala penilaian: 0, 1+, 2+, 3+, yang dikembangkan oleh produsen tes dan disetujui oleh para ahli. Status hercept, dinilai sebagai 0 dan 1+, harus dianggap negatif - tidak ada ekspresi protein yang berlebihan, yang berkorelasi dengan tidak adanya amplifikasi gennya. Status Hercept yang diberi skor 3+ adalah positif, yaitu terdapat ekspresi berlebih protein, yang berkorelasi dengan adanya amplifikasi gen. Status hercept 2+ dianggap tidak pasti, yaitu ekspresi protein yang ditentukan berdasarkan reaksi imunohistokimia tidak dapat menilai amplifikasi gen secara pasti, sehingga diperlukan penelitian yang secara langsung mengungkap ada tidaknya amplifikasi. Metode FISH digunakan pada bagian dari sampel (blok) yang sama di mana studi imunohistokimia dilakukan. Selama hibridisasi IKAN, keberadaan amplifikasi gen HER2 dinilai dengan menghitung rasio sinyal fluoresen merah (sesuai dengan gen HER2 yang ditandai) dan sinyal fluoresen hijau yang menandai wilayah sentromerik kromosom ke-17. Rasio yang lebih besar dari 2 menunjukkan adanya amplifikasi HER2. FISH lebih sensitif dibandingkan IHC karena memungkinkan penilaian langsung terhadap ada atau tidaknya amplifikasi.

Bahan penelitian: blok parafin dengan biopsi tumor.

Perhatian! PERLU:

slide dengan pewarnaan IHC dengan antibodi terhadap HER2/neu
rujukan dari dokter atau ekstrak dengan hasil pemeriksaan histologis dan IHC dengan antibodi terhadap Her-2/neu

literatur

Zavalishina L.E., Frank G.A. Studi morfologi status HER2. Metodologi dan atlas. - M.: Penerbitan. Media Medika. 2006:98.
Penyakit ganas di Rusia pada tahun 2011 (morbiditas dan mortalitas). Ed. DALAM DAN. Chissova, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. - M.: FSBI “MNIOI im. P.A. Herzen" dari Kementerian Kesehatan Rusia. 2013:289.
Onkologi. Rekomendasi klinis. Asosiasi Ahli Onkologi Rusia. Ed. DALAM DAN. Chissova, S.L. Daryalova. - M.: Penerbitan. "GEOTAR-Media". 2008:702.
Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H.C., Shen L., Sawaki A. dkk. Trastuzumab dalam kombinasi dengan kemoterapi versus kemoterapi saja untuk pengobatan kanker lambung atau gastro-esofagus stadium lanjut (ToGA) positif HER2: uji coba terkontrol acak fase 3, label terbuka, dan terkontrol. Lanset. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Imunohistokimia Diagnostik: Aplikasi Theranostik dan Genomik. Elsevier, Edisi ke-4. 2013:960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin DM. GLOBOCAN 2008, Insiden dan Kematian Kanker di Seluruh Dunia: IARC Cancer Base No. 10. Lyon, Perancis: Badan Internasional untuk Penelitian Kanker; 2010. Tersedia dari: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. Sorotan Pertemuan: Konsensus Pakar Internasional tentang Terapi Primer Kanker Payudara Dini 2005. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. Klasifikasi Tumor Organ Reproduksi Wanita WHO. WHO Press, Edisi ke-4. 2014;4:316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. dkk. Amplifikasi Her2/neu merupakan faktor prognostik independen pada kanker lambung. Penyakit dan Ilmu Pencernaan. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D.dkk. Trastuzumab Adjuvan pada Kanker Payudara Positif HER2. Jurnal Kedokteran New England. 2011;365:1273-1283.