Теории образования антител. Теория антиген-антитело

Антитело - это молекула, без которой невозможно представить современную науку и медицину. Она играет ключевую роль как во многих методиках экспериментальной науки, так и при диагностике различных заболеваний. Лекарства на основе антител изменили облик фарминдустрии и продолжают будоражить мир всё новыми и новыми перспективами. Между тем, эта область знаний проделала сложный и увлекательный путь, в котором рука об руку шли фундаментальная и прикладная науки, над которой работали гениальные исследователи и где совершались воистину великие открытия. Мы расскажем об основных вехах изучения антител, а также об их применении в медицине и науке. Данная статья открывает цикл работ, посвященных моноклональным антителам.

Спецпроект об антителах, истории их изучения, методах работы с ними, а также о применении антител в современной медицине и биотехнологии.

Партнер спецпроекта - Департамент вычислительной биологии одной из крупнейших российских биотехнологических компаний - . BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.

Глава 1. Краткая история открытия антител: от XIX века до наших дней

Начало: история разработки сыворотки против дифтерии

Ко второй половине XIX века в зарождающейся науке иммунологии накопилось достаточно данных об иммунизации - способности организма противостоять возбудителю заболевания при повторной встрече с ним. Знаковую роль здесь сыграла разработка Эдвардом Дженнером и широкое распространение первой эффективной вакцины против натуральной оспы в конце XVIII - начале XIX веков. Дженнер использовал содержимое пустул больных коровьей оспой, неопасной для людей, для получения иммунитета против натуральной оспы (рис. 1). Вкратце с этой историей можно познакомиться на сайте «История медицины ».

Со временем пришло понимание, что вещества иммунизированного организма, помогающие ему не заболеть при повторном контакте с возбудителем заболевания, содержатся в жидкой части крови - сыворотке . Сыворотку можно вводить в организм, никогда с возбудителем не контактировавший, и добиваться его защиты на некоторое время, а также вылечить уже больной организм!

В 1888 году Эмиль Ру и Александр Йерсен открыли растворимый токсин дифтерийной палочки . Иммунизация лабораторных животных данным токсином приводила к образованию вещества, обезвреживающего его - так называемого антитоксина, который составлял действующую основу сыворотки. Важным моментом стало понимание того, что иммунный ответ направлен не на микроорганизм в целом, а на его часть - будь то растворимое секретируемое вещество или элемент структуры. Позднее термин «токсин» сменился на более широкий термин «антиген », а «антитоксин» - на «антитело ».

В 1890 году вышел в свет совместный труд немецкого врача-исследователя Эмиля Адольфа фон Беринга (рис. 2) и японского исследователя-микробиолога Китасато Сибасабуро «О развитии иммунитета против дифтерии и столбняка у животных », в котором они показали, что сыворотка крови кроликов, инфицированных столбнячной палочкой , способна защитить мышей от живых столбнячных бацилл и столбнячного токсина. Через неделю Беринг опубликовал об аналогичных защитных свойствах сыворотки крови морских свинок, иммунизированных инактивированными возбудителями дифтерии и дифтерийным токсином. Свою работу Беринг завершил довольно громким заявлением: «Таким образом, возможность лечения даже самых тяжелых заболеваний больше не может быть проигнорирована» .

Приведенные выводы вызвали общественный резонанс. Столбняк - заболевание с контактным путем передачи и высокой летальностью - являлся в то время частой причиной смерти детей и военнослужащих (к слову, бóльшую обеспокоенность вызывало последнее, несмотря на факты и статистику). Вопрос дифтерии также стоял достаточно остро. Отсутствие эффективных методов ее лечения приводило к тому, что практически каждый двадцатый ребенок в Европе и США умирал от этой болезни.

В январе 1892 года Беринг начал первое исследование антидифтерийной сыворотки на людях. Старт был дан в рождественскую ночь 1891 года, когда маленькой умирающей девочке в хирургическом отделении Берлинского детского госпиталя Бергманна произвели первую инъекцию спасительной сыворотки.

Технология, однако, имела ограниченный потенциал для проведения больших исследований, повысить который Берингу удалось в сотрудничестве с Паулем Эрлихом . Для получения сыворотки ученые начали использовать вместо кроликов более крупных животных (лошадей), благодаря чему удавалось получать бóльшее количество сыворотки. Кроме того, методика иммунизации стандартизовали и, соответственно, она стала пригодной для проведения клинических исследований.

В первых крупных наблюдениях, опубликованных в 1894 году, приведены результаты по лечению «чудо-сывороткой» 220 детей, из которых выжили целых 77% - невиданная для тех лет цифра. Если лечение начиналось в первые два дня, то выживаемость стремилась к 100%, если же на шестой день - успех ожидался лишь в 50% случаев. Совершенствуя сыворотку, Берингу удалось снизить смертность до 1–5% в случае своевременной диагностики заболевания.

Беринг считал свою сыворотку абсолютно безвредной, но, к сожалению, это было не совсем так. В 1896 году здоровому ребенку, который имел контакт с домработницей, заболевшей дифтерией, с профилактической целью была введена сыворотка. В ответ на это у мальчика развился анафилактический шок , и ребенка спасти не удалось. Волей судьбы, отец мальчика оказался известным патологоанатомом, который позднее задокументировал этот первый летальный случай, связанный с введением сыворотки.

Для Беринга это самое начало пути - он будет трудиться не только над проблемой лечения дифтерии, но также достигнет значительных успехов в вопросах вакцинации. Проведя колоссальную работу по разработке препарата фактически «от идеи к пациенту», Беринг заложил основы проведения доклинических и клинических исследований препаратов такого рода (про то, как устроены современные клинические исследования, можно почитать в посвященном этому спецпроекте). Яркую и плодотворную деятельность Беринга в 1901 году отметили Нобелевской премией с формулировкой «за работу по сывороточной терапии, главным образом за её применение при лечении дифтерии, что открыло новые пути в медицинской науке и дало в руки врачей победоносное оружие против болезни и смерти » .

Середина: селективная теория «боковых цепей» Пауля Эрлиха

В 1896 г. Грубер и Дархэм открыли феномен агглютинации бактерий , а в 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации (образования комплекса) между антигеном и антителом, что дало возможность качественно и количественно изучать реакцию «антиген-антитело». Этим занялся Пауль Эрлих , выдающийся немецкий ученый, врач, микробиолог, один из основоположников иммунологии и химиотерапии (рис. 3). Эрлих разработал принцип количественного определения антител и антигенов методом титрования, что сейчас является необходимым условием стандартизации, а также заложил основы понимания специфичности взаимодействия антиген-антитело. Кроме того, в своей работе 1897 года «Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы» Пауль Эрлих впервые озвучил гипотезу образования антител, получившую название теории «боковых цепей» (рис. 4) .

Эрлих полагал, что антитело - это особый вид молекул, расположенных в виде рецепторов («боковых цепей») на поверхности клеток. Боковые цепи благодаря своей особой конфигурации, комплементарной (то есть полностью соответствующей ей) молекуле антигена, способны взаимодействовать с ней по принципу «ключ-замок», причем необратимым способом. Это взаимодействие специфическое, а на поверхности клеток исходно существует некий репертуар таких «боковых цепей». Антиген же способен отбирать специфичные ему рецепторы, которые далее открепляются от поверхности клетки, циркулируют в крови в поиске «своего» антигена и в конечном счете инактивируют его.

Простая и лаконичная теория Эрлиха быстро была подхвачена научными кругами, надолго определив вектор иммунологической мысли. Тем не менее через пару десятилетий в ней обнаружили бреши. Неразрешенные вопросы в первую очередь касались специфичности образующихся антител, так как со временем обнаружили, что антитела вырабатываются не только против возбудителей заболеваний, но и против безвредных веществ, в том числе собственных молекул организма и даже небольших химических соединений.

Рисунок 4. Теория «боковых цепей». На иммунной клетке присутствует репертуар боковых цепей, с которыми взаимодействует токсин по принципу «ключ-замок». Данное взаимодействие приводит к синтезу большого количества боковых цепей определенной специфичности, которые открепляются от поверхности в виде растворимых боковых цепей, циркулируют по кровотоку и нейтрализуют токсин.

Большой вклад в изучение репертуара антигенов внес Карл Ландштейнер . В начале ХХ века он показал существование антител к собственным антигенам организма - белкам на поверхности эритроцитов - и таким образом открыл существование групп крови , за что был удостоен Нобелевской премии (1930) . А в 1923 году Карл Ландштейнер открыл гаптены - класс низкомолекулярных соединений, иммунный ответ на которые не вырабатывается. Если же такое соединение связывалось с собственными белками организма (например, альбумином в крови или рецепторами на поверхности клеток), то на подобный комплекс начинали образовываться антитела.

Выработки антител можно было достичь и к откровенно «искусственным» соединениям, встреча с которым в природе полностью исключена - так, Ландштейнер получил антитела к динитрофенилу. Стало понятно, что о предсуществовании хоть и разнообразного, но заведомо ограниченного репертуара антител не могло идти и речи. Интуитивно понятным становилось предположение, что живой организм способен каким-то образом «прочитывать» структуру антигена и далее синтезировать комплементарные ему антитела. Заметим, что структуру молекулы ДНК расшифровали лишь в 1953 году, а центральную догму молекулярной биологии «ДНК → РНК → белок» Фрэнсис Крик предложил только в 1958 году, поэтому развитие иммунологии до этого времени было заторможено незнанием принципа синтеза белковой молекулы. Считалось, что белки синтезируются на белковой матрице (что, конечно, оказалось совсем не так), и что уникальность матрицы определяет уникальность первичной структуры синтезируемого белка. Сходным образом должен был происходить и синтез антител, в процессе которого в качестве матрицы выступал антиген: антитела синтезировались прямо на его поверхности - аминокислоты сшивались в цепочку, комплементарную конформации антигена. Подобные представления о происхождении специфичности антител носили название матричных теорий .

Позднее получили данные, свидетельствующие в пользу того, что антитела имеют довольно схожую белковую природу. Компромисс был достигнут в теории Лайнуса Полинга и Дэна Кемпбелла. Они полагали, что до встречи с антигеном в организме синтезируются «протоантитела» в виде коротких белковых цепочек. После контакта с антигеном эти цепочки приобретают специфичность и далее сшиваются с помощью дисульфидных связей в двухвалентное антитело.

Конец: клонально-селекционная теория

Матричные теории ничего не говорили о продукции антител. Тем временем науке стали известны некоторые фенóмены, которые трудно объяснялись матричными теориями, такие как иммунологическая память (способность при повторном контакте с антигеном отвечать более быстрым, сильным и специфичным образованием антител) и иммунологическая толерантность (способности не реагировать на собственные антигены). Все эти феномены предполагали наличие более тонкого механизма, чем логичные и механистические матричные теории.

В 1948 году шведская исследовательница Астрид Фагреус показала, что источником антител являются активированные В-лимфоциты - плазматические клетки , а спустя год, в 1949 году, австралийский вирусолог Фрэнк Бёрнет (рис. 5) совместно с Фрэнком Феннером издал монографию «Продукция антител», где впервые выдвинул гипотезу непрямой матрицы . Согласно ей, антигены способны изменять структуру РНК (наиболее вероятную матрицу для синтеза белка) в антиген-продуцирующих клетках, что приводит к синтезу специфических антител. В теории было немало «белых пятен» - например, оставался абсолютно неясен механизм изменения структуры РНК.

Рисунок 7. Общая схема получения гибридомы. Из селезенки иммунизированной мыши выделяют антитело-продуцирующие клетки, которые сливают с клетками миеломы. В результате слияния образуются гибридомы, которые культивируют в специальной среде для селекции клеток гибридом, продуцирующих антитела.

Технологию производства гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, разработали Сезар Мильштейн и Жорж Келер (рис. 8) в 1970-х годах. О том, как это происходит, можно прочитать в статье Гарри Израилевича Абелева «Моноклональные антитела» .

Технология получения гибридом не была запатентована, и метод беспрепятственно и быстро распространился по многим лабораториям мира, катализировав развитие иммунологической отрасли. Метод гибридом положил начало целому семейству иммунологических технологий, о которых мы рассказывали в статье «Иммунологические технологии » спецпроекта « » . К слову, это был не просто отказ от патентования, а оплошность, причем с довольно громкими, в том числе и политическими, последствиями.

В то время в Великобритании поиском потенциальных биомедицинских продуктов для патентования занималась организация Medical Research Council (MRC ), при этом не имеющая права патентовать сама; патентованием заведовала другая организация - National Research Development Corporation (NRDC ).

В июле 1975 года Тони Викерс, агент MRC, приметил крайне заманчивую для коммерциализации технологию Мильштейна и попросил последнего отправить ему неопубликованный вариант статьи с описанием метода, в это время ожидавшей рецензии в журнале Nature . Викерс немедленно передал заявку в NRDC с вопросом о возможности получения патента, однако организация ничего не ответила. В августе 1975 г. в Nature вышла статья Мильштейна и Келера , и лишь в октябре 1976 года NRDC удостоила авторов ответом, в котором говорилось, что методика получения гибридом не может быть запатентована, так как была ранее опубликована в научном журнале.

Неспособность NRDC запатентовать технику Келера и Мильштейна стала предметом крупных споров в конце 1970-х годов. Подлила масла в огонь непростая экономико-политическая обстановка в Великобритании. Одним из самых яростных критиков отказа патентной организации стала Маргарет Тэтчер , химик по образованию, избранная премьер-министром в 1979 году. Гнев «железной леди» был многократно усилен известием о патентовании Хилари Копровски (главы американской компании «Вистар»), Карло Кроче и Вальтером Герхардом моноклональных антител против опухолевых антигенов, а позднее - антител против антигенов вируса гриппа. Это были первые патенты на технологию получения моноклональных антител. Не радовал английское правительство и тот факт, что в патентах компании «Вистар» моноклональные антитела были созданы с использованием линии клеток миеломы X63, которую в сентябре 1976 года Хилари Копровски предоставил сам Мильштейн.

Предоставление линии клеток соответствовало традиции многих ученых того времени. Немногочисленные требования к адресатам заключались лишь в том, чтобы они указывали в публикациях источник культур, спрашивали разрешение в том случае, если собирались передавать культуру третьим лицам, и отказывались патентовать какие-либо продукты, получаемые из культур этих клеток. И, как показала практика, в особенности последнее требование оказалось трудно выполнимо потому, что не было оформлено юридически.

Так или иначе, Мильштейн не испытывал горьких разочарований и однажды сказал докучавшему его журналисту: «Нет, я не был несчастен, Маргарет Тэтчер - была» . Как и многие ученые того времени, Мильштейн рассматривал патентование со здоровой долей брезгливости и считал, что исполнил свой долг, отправив неопубликованную статью Викерсу в июле 1975 года. Позднее Мильштейн признался, что отсутствие патента было благословением, которое помогло ему плодотворно и свободно трудиться и делиться своими научными результатами. Как настоящий ученый, Мильштейн предпочитал не думать о том, что наличие патента сделало бы его миллионером. А в 1984 году труды Келера и Мильштейна отметили Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом » .

Глава 3. Антитела на страже здоровья: применение в лабораторной и медицинской диагностике

Более века врачи и ученые работали над тем, чтобы сделать из антител «магическую пулю» - высокочувствительный, точный и эффективный препарат для лечения пациентов. Осуществлению этой мечты способствовало открытие и получение моноклональных антител, которые точечно взаимодействуют с заданным антигеном. Некоторые препараты на основе моноклональных антител смогли стать настоящим золотым стандартом лечения.

Однако лечение - не единственное, для чего моноклональные антитела могут использоваться на практике. Сегодня существует множество биодиагностических методов, использующих в качестве инструмента моноклональные антитела.

Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитометрия - важная методика, которая позволяет получать комплексную информацию о множестве клеток за раз. С помощью этого метода можно узнать размер клетки, содержание ДНК или РНК и многие другие параметры. И если в прошлом проточные цитометры себе могли позволить только крупные академические центры, то сейчас такое оборудование есть уже во многих больницах общего профиля. Современные проточные цитометры стали намного меньше, дешевле и удобнее в использовании. «Биомолекула» подробно рассказывала об этой технологии в статье «Проточная цитофлуориметрия » спецпроекта «12 биологических методов в картинках » .

Немного объясним суть методики. Суспензия клеток предварительно метится моноклональными антителами, сшитыми со светящейся меткой, и помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку. Исследуемые клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке пересекают пучок световых (обычно лазерных) лучей, служащих для анализа каждой отдельно взятой клетки. Исходящий свет фокусируют при помощи оптической системы, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы преобразуют в электрические импульсы и анализируют при помощи специального программного обеспечения. Таким образом, результат цитометрического анализа - определение состояния каждой клетки в образце с возможностью разделить образец на популяции клеток.

Спектр применения данной методики необычайно широк: ее используют в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии, сельском хозяйстве. В 1990-х годах, благодаря этому методу, осуществили сортировку индивидуальных хромосом, тетраном (гибридных гибридом, которые производят бифункциональные антитела) и др. Огромный толчок развитию проточной цитометрии дало открытие гибридомной технологии и, как следствие, получение моноклональных антител к большому количеству антигенов как на поверхности клеток, так и в цитоплазме. Большинство клинических применений проточной цитометрии осуществляется именно с помощью моноклональных антител. Так, получены коммерчески доступные антитела, которые позволяют определять поверхностные антигены лейкоцитов человека. Такие моноклональные антитела применяют для определения опухолей, лейкемий, диагностирования различных аутоиммунных заболеваний, исследования активации клеток иммунной системы: лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов и др. .

Также важным шагом для изучения клеток стало получение моноклональных антител к различным фосфоэпитопам, поскольку информация о фосфорилировании белка нередко позволяет установить его функцию. Впервые фосфорилин-зависимые поликлональные антитела получили в 1981 году. Сейчас же наличие аналогичных, но моноклональных антител обеспечивает более эффективное изучение функционирования клеток. Также сейчас коммерчески доступны антитела, меченные различными флуоресцентными белками. Это позволяет исследователю использовать их таким образом, чтобы на меньшем объёме образцов получать о них максимальную информацию.

Иммуногистохимия

Еще одним важным диагностическим методом, в котором используются моноклональные антитела, является иммуногистохимия. На всех тканях, в том числе и опухолевых, содержатся молекулы, служащие мáркерами той или иной ткани или популяции клеток. Окрашивание среза ткани моноклональными антителами позволяет определить тип опухоли и подобрать необходимое лечение. Так же, как и в случае проточной цитометрии, метод гибридом позволил исследователям получить моноклональные антитела к различным тканевым и опухолеассоциированным антигенам, что способствовало широкому распространению метода иммуногистохимии. В XX веке иммуногистохимический анализ стали применять в диагностике онкологических заболеваний. Сегодня такой анализ зачастую является обязательным для подтверждения первичного диагноза, особенно если лечение требует использования дорогостоящих лекарств. И хотя иммуногистохимия существует около 50 лет, до сих пор данную процедуру довольно сложно стандартизировать. Поэтому крайне важным в этой методике является использование моноклональных антител, которые обладают низкой вероятностью перекрестного взаимодействия с другими белками и возникновения неспецифических сигналов.

Глава 4. Фармацевтическая «аллея славы»: как антитела заняли лидирующие позиции на рынке лекарственных препаратов

В 1985 году, спустя всего лишь год после вручения Келеру и Мильштейну Нобелевской премии за разработку методики получения моноклональных антител, FDA одобрило самое первое лекарство на основе мышиного моноклонального антитела - муромонаб , или OKT3 . Свое название оно получило от сокращения его изначального длинного названия - MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3 , что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3». Антитело взаимодействовало с особой молекулой CD3 на поверхности T-лимфоцитов, которая важна в том числе и для развития реакции отторжения трансплантированного органа (например, почки). Соответственно, блокируя CD3, можно добиться лучшего приживания органа в организме реципиента. Однако впоследствие у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, которые были вызваны ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом . Поэтому следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного материала в препарате.

Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных или гуманизированных антителах. В химерных антителах участки, которые непосредственно распознают антиген, имеют мышиное происхождение, а остальная (и бóльшая) часть антитела - человеческое. А в гуманизированных антителах доля мышиного материала еще меньше, и поэтому они еще реже вызывают негативные реакции со стороны организма пациента.

Помимо моноклональных, существуют также и другие типы антител . Рассмотрим их поподробнее.

Лидирующие позиции на рынке пока остаются за классическими моноклональными антителами . По данным 2014 года, из 47 препаратов на основе моноклональных антител, одобренных и продаваемых на тот момент в США и Европе, 31 является полноразмерным моноклональным антителом . Один препарат - это биспецифическое антитело, три - конъюгированные антитела, три - Fab-антитела и девять - Fc-слитые белки (табл. 1). Скорее всего, связано это с тем, что оптимизировать получение и функционирование генетически инженерных конструктов довольно сложно, хотя с каждым годом количество таких препаратов продолжает увеличиваться.

В последние годы темпы развития рынка моноклональных антител непрерывно растут. В 2015 году глобальный доход от продаж таких препаратов составил чуть менее $90 млрд - это почти 60% от общего объема продаж всех биофармацевтических продуктов. При этом шесть из десяти самых продаваемых биофармацевтических продуктов в 2015 году оказались моноклональными антителами .

Известно, что по состоянию на 31 октября 2016 года на рынках США и Европы существует уже 71 препарат на основе моноклональных антител . Также в 2010 году одобрили 10 новых препаратов для использования на территориях США и Европы. По состоянию на 1 декабря 2017 года девять терапевтических моноклональных антител проходят регуляционные тестирования, и сведения об их использовании станут известны в конце 2018 года. Также в конце 2018 года представят заявки на получение торговой лицензии еще 12 новых препаратов, из которых четыре предназначаются для лечения онкологических заболеваний.

Humira , Remicade , Enbrel , Rituxan , Avastin и Herceptin являются шестью самыми продаваемыми препаратами на основе моноклональных антител (рис. 9). Расскажем поподробнее про каждый из них.

Рисунок 9. Динамика продаж коммерческих препаратов моноклональных антител. Сравнение уровня продаж препаратов шести моноклональных антител по сравнению с препаратами рекомбинантных белков Avonex и Rebif в период с 2006 по 2015 год. В 2016 году доход от продажи каждого из шести препаратов превышал $6,5 млрд.

«Хумира» (адалимумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой фактора некроза опухолей (TNF) и таким образом уменьшает воспаление. Препарат используют для лечения ревматоидного артрита , псориаза , болезни Крона и других аутоиммунных заболеваний. В 2015 году объемы продаж этого препарата составили $14 млрд, что сделало его самым продаваемым лекарством. «Ремикейд» (инфликсимаб) и «Энбрель» (этанерцепт ) - также препараты на основе антител, связывающихся с молекулой TNFα. Ввиду того, что эти препараты вышли на рынок несколько позже Humira, их объемы продаж несколько меньше: около $8 млрд каждого. «Ритуксан» (ритуксимаб) - антитело, связывающееся с белком CD20, который экспрессируется только на поверхности В-клеток. Кроме того, более 90% В-клеточных неходжкинских лимфом также экспрессируют CD20. Препарат буквально убивает бóльшую часть В-лимфоцитов. Казалось бы, это чрезвычайно вредно для организма, ведь В-лимфоциты - важные игроки иммунной защиты. Однако не стоит забывать, что бóльшая часть В-клеток в крови пациентов - это опухолевые клетки. Избавляясь от них, мы даем организму шанс начать производить новые здоровые клетки, и уже через 12 месяцев уровень В-лимфоцитов полностью восстанавливается.

Классические методы лечения неходжкинской лимфомы, такие как химиотерапия и радиационная терапия, обладают высокой токсичностью, а также низкопецифичны в отношении опухоли, так как уничтожают большое количество здоровых клеток. Тогда как терапия антителами более избирательна и менее разрушительна для организма . Получение ритуксимаба, менее агрессивного и более щадящего препарата, стало важной вехой развития медицины и позволило вывести лечение онкологических пациентов на качественно новый уровень. Именно поэтому в 1997 году ритуксимаб одобрили для лечения B-клеточной неходжкинской лимфомы, а в 2010 - в качестве поддерживающей терапии после первичного лечения фолликулярной лимфомы. Ритуксимаб находится в перечне основных лекарственных средств ВОЗ, в списке наиболее важных лекарств, необходимых в базовой системе здравоохранения. Для некоторых заболеваний (таких как гранулематоз с полиангитом и микроскопический полиангит) лечение ритуксимабом является единственным одобренным FDA. Ритуксимаб также активно используется в лечении ревматоидного артрита в комбинации с метотрексатом, что у половины пациентов приводит к улучшению симптомов в течение полугода. Если же пациенты принимают только метотрексат, то улучшение наблюдается лишь у 18%. «Авастин» (бевацизумаб) - моноклональное антитело, блокирующее работу эндотелиального фактора роста A (VEGF-A). В 1989 году Наполеон Феррара, молекулярный биолог, работавший в лаборатории корпорации Genentech, обнаружил молекулу VEGF (Vascular endothelial growth factor ) - белок, который способствует росту сети кровеносных сосудов (ангиогенезу ). В 1993 году Феррара показал, что блокирование работы VEGF специфическими моноклональными антителами приводит к резкому замедлению роста различных опухолей. Его исследования подтверждали ранее предложенную гипотезу Иуды Фолькмана, в которой говорилось, что остановка ангиогенеза может быть эффективным путем борьбы с опухолями, поскольку они начинают получать меньше питательных веществ и погибают. Стало понятно, что необходимо получить препарат, который будет блокировать молекулу VEGF. Это привело бы к ингибированию разрастания сети кровеносных сосудов вокруг опухоли, и та, не получая достаточного кровоснабжения, перестанет расти и метастазировать.

И вот, интенсивная работа исследователей принесла свои плоды - было получено несколько моноклональных антител, распознающих фактор VEGF-A. Каждое из этих антител связывалось с различными участками, или, говоря научным языком, эпитопами, молекулы VEGF-A , . Но лишь одно антитело оказалось способным распознавать и нейтрализовывать все изоформы этой молекулы. На его основе и был разработан препарат бевацизумаб - первый клинически используемый ингибитор роста кровеносных сосудов. Важность и революционность данного препарата заключается в том, что до его получения не существовало лекарств, нацеленных на прямую борьбу с ангиогенезом. В 1997 году начали проводить первые клинические испытания «Авастина» (торговое название бевацизумаба), а в 2004 году в США было получено одобрение для использования этого препарата в комбинированной терапии по лечению метастатического рака толстой кишки.

Позже «Авастин» стали использовать для лечения и других опухолей. Добавление его к стандартной химиотерапии 5-фторурацилом увеличивает продолжительность жизни пациентов. Также применение «Авастина» совместно с 5-фторурацилом существенно удлиняет промежуток времени, в течение которого опухоль увеличивается до первоначальных размеров. И, самое главное, «Авастин» совместно со стандартной химиотерапией уменьшает размеры самой опухоли: 45% против 35%. «Герцептин» (трастузумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой Her2/neu и блокирует ее. Если Her2/neu присутствует на клетках в избыточном количестве, это зачастую приводит к развитию рака молочной железы.

Возникает закономерный вопрос - почему рынок моноклональных антител столь популярен и быстро развивается? Дело в том, что сейчас антитела - одни из самых удобных и эффективных инструментов для решения различных биомедицинских проблем. Антитела, как правило, хорошо переносятся организмом человека и обладают высокой специфичностью к антигену, что снижает риск неожиданных осложнений в клинических испытаниях. Зачастую для многих фармацевтических задач моноклональные антитела являются первыми кандидатами на получение продукта, который можно относительно быстро проверить в клинических испытаниях. Если предварительные исследования клинической эффективности успешны, то такой инновационный препарат можно быстро коммерциализировать и вывести на рынок.

Также в целом происходит глобальный рост фармацевтического рынка, глобальный рост населения, а в странах с развитой экономикой наблюдается повышение уровня жизни - все эти факторы обеспечивают повышенный спрос на новые биопрепараты. В современных условиях существует запрос на получение большого количества относительно недорогих в производстве противоревматоидных и противоастматических средств, и с этой задачей как нельзя лучше могут справиться моноклональные антитела. С каждым годом биофармацевтическая промышленность растет и развивается, при этом появляется всё больше возможностей для облегчения и корректировки течения многих заболеваний, в том числе при помощи моноклональных антител.

В России самой успешной компанией, занимающейся производством и выпуском препаратов на основе моноклональных антител, является . Уже сейчас компания выпускает около 20 лекарственных препаратов , предназначенных для лечения различных злокачественных опухолей, среди которых есть аналоги трастузумаба и бевацизумаба. Более 40 препаратов находится на стадии разработки, два из них планируют зарегистрировать в 2018 году (один из препаратов будет биоаналогом самого продаваемого aдалимумаба). BIOCAD первой из российских компаний стал лидером продаж препаратов, предназначенных для терапии онкологических заболеваний. По данным аудита фармацевтического рынка России, проводимого аналитической компанией IMS Health за январь–декабрь 2017 года, биотехнологическая компания BIOCAD второй год подряд удерживает лидерство в сегменте бюджетных закупок в рублях в конечных ценах (учитывались сведения по всем препаратам), а также впервые возглавила рейтинг поставщиков в сегменте государственных закупок противоопухолевых препаратов как в рамках программы 7ВЗН, так и вне ее.

7ВЗН - это программа «Семь высокозатратных нозологий», которая обеспечивает лекарствами людей с редкими заболеваниям. Доля BIOCAD в госзакупках лекарственных средств в 2017 году составила 4,2% при выручке 15,66 млрд рублей. В тройку лидеров вошли также NOVARTIS и Sanofi-Aventis с показателями 3,5% и 3,2%, соответственно. Список замыкает АО «Генериум» , вторая российская компания, попавшая в топ-10 фармацевтических компаний, поставщиков лекарственных средств в государственные лечебные учреждения. В сегменте противоопухолевых препаратов BIOCAD удерживает 14,2% без учета 7ВЗН и 18,9% с учетом программы.

Итак, теперь мы знаем, что моноклональные антитела - это настоящая «магия» во флаконе. Без них было бы сложно, а иногда и невозможно, вылечить или улучшить течение множества заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных. Прошло примерно 50 лет с момента разработки технологии гибридом, и за это время было получено большое количество жизненно важных препаратов. Огромный спрос на моноклональные антитела показывает, насколько востребованными и эффективными являются эти лекарства. В последующих статьях цикла будет рассказано, как биотехнологи «улучшают» работу моноклональных антител, какие из современных препаратов созданы на их основе и как работает BIOCAD - успешная отечественная компания по разработке и производству моноклональных антител.

Департамент вычислительной биологии компании BIOCAD - спонсор спецпроекта

Одна из крупных международных биотехнологических компаний в России, объединившая научно-исследовательские центры мирового уровня, современное фармацевтическое и биотехнологическое производство, проведение доклинических и клинических исследований препаратов, соответствующих международным стандартам. В компании реализован полный цикл выпуска лекарственных препаратов: от поиска лекарственной молекулы до массового производства и маркетинговой поддержки. Разрабатываемые препараты применяют в лечении таких сложных заболеваний как рак, рассеянный склероз, ВИЧ и т.д.

В компании верят в предиктивную силу биологии и считают математическое моделирование основой для развития биотехнологий сегодня. То, что раньше было возможно осуществить исключительно in vitro в стенах лабораторий, сегодня может быть воплощено in silico силой чистого разума. Здесь собрали одну из лучших команд биоинформатиков в стране, которая занимается научными исследованиями, разрабатывает и внедряет новейшие методы интеллектуального анализа данных. В ее распоряжении один из мощнейших вычислительных кластеров, и если еще 2–3 года назад можно было только мечтать о решении задач направленного дизайна белковых молекул, то сейчас это одно из направлений работ Департамента вычислительной биологии.

Нам кажется, что в рамках совместного с «Биомолекулой» спецпроекта читателям будет интересно познакомиться с нюансами гуманизации антител и процессом поиска мишеней под конкретную нозологию.

Вполне возможно, вы уже знаете, что на основании ретроспективного анализа большинства известных моноклональных препаратов наша компания сформулировала современные требования к непатентуемым коммерческим наименованиям, которые были рассмотрены и приняты на заседании ВОЗ.

Раскрывая эту тему, постараемся описать различные виды антител и их уникальных vhh-представителей, коснуться вопроса иммуногенности и уже через него выйти к теме необходимости/желательности гуманизации. А также рассказать о пространственной структуре антител и о том, какие сложности с сохранением структуры поджидают исследователей при внесении мутаций.

Материал предоставлен партнёром - Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD

Литература

1. Первый «медицинский нобель» ;
2. Zielinska E. (2013). Side-chain theory, circa 1900 ;. . ;
3. Dotan E., Aggarwal C., Smith M.R. (2010). Impact of Rituximab (Rituxan) on the treatment of B-cell non-Hodgkin"s lymphoma . P. T. 35 , 148–157;
4. Domenico Ribatti. (2011). From the discovery of Vascular Endothelial Growth Factor to the introduction of Avastin in clinical trials - an interview with Napoleone Ferrara . Int. J. Dev. Biol. . 55 , 383-388.

Работы Ландштайнера, Полинга

Инструктивная теория – механизм образования специфических антител обусловлен инструктивным действием антигенов. Развивались с 1900 по 1940 годы. Сложилось убеждение, что именно антиген управляет образованием специфических антител, направляя механизмы белкового синтеза на изготовление тех уникальных молекулярных конфигурации, которые определяют иммунологическую специфичность. Тем или иным способом антиген должен передать новообразованной молекуле белка информацию о своей специфичности, чтобы придать этой молекуле функции антитела.

Работа Ф. Брейнлема

Наиболее известная из этих инструктивных теорий, созданная в 1930 г. Ф. Брейнлем и Ф. Гауровицем (F. Breinl, F. Haurowitz), утверждала, что антиген играет роль матрицы, которая обеспечивает сборку уникальных аминокислотных последовательностей полипептидной цепи антител. Позднее инструктивная теория была развита Лайнусом Полингом (Linus Pauling), поддержавшим ее всем авторитетом, которым он пользовался в области физической химии. Утверждалось, что антиген может служить тем шаблоном, на котором происходит свертывание предобразованной полипептидной цепи с возникновением соответствующей третичной конфигурации, заключающей в себе стереохимическую специфичность. В течение нескольких десятилетий подобные теории прямой матрицы пользовались большой популярностью, так как казалось, что они предлагают единственное разумное объяснение тому многообразию антител, которое, как показали Ландштейнер (Landsteiner) и другие, может образовываться в организме позвоночных.

Не будь антитела, не сформируются вариации к нему. В течение нескольких десятилетии подобные теории пользовались популярностью, так как казалось, что они предлагают 1 разумное объяснение тому разнообразию антител, которое, как показал Ландштейнер, может образовываться в организме позвоночных. Но биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигенов и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный ответ. Эти теории совсем не могли объяснить, почему при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к снижению специфичности, а в других – к значительному расширению. С точки зрения биологии, теории матрицы обладали недостатками, что и привело вирусолога Бернета к созданию в 1941 году другого варианта инструктивной теории. Он предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые не обходимо для синтеза глобулина, вызывая в результате образования уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов объясняла не только широту иммунологического репертуара, но длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела.

Однако, исходя из этих химических теорий, биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигена, и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный (бустерный) ответ. Более того, эти теории совсем не могли объяснить последних данных о том, что при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к сужению специфичности, а в других - к значительному расширению диапазона перекрестных серологических реакций.

С развитием представлений о возможной генетической роли НК Бернет и Феннер в 1949 году предложили модификацию этой теории: антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном. Это приводит затем к образованию не прямой матрицы для специфических антител. Новая копию гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.

С точки зрения биолога, теории матрицы обладали значительными недостатками, и именно это привело вирусолога Макфарлейна Бернета (Macfarlane Burnet) к созданию в 1941 г. другого варианта инструкционистской теории. В условиях растущего признания той роли, которую ферменты играют в процессах синтеза и расщепления, Бернет предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые необходимы для синтеза глобулина, вызывая в результате образование уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов имела то преимущество, что с позиций первичной инструктивной роли антигена она объясняла не только широту иммунологического репертуара, но и длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела. Этот последний момент имеет особое значение, поскольку Бернет (Burnet) является, по-видимому, первым, кто подчеркнул важную роль длительного функционирования клеток и клеточной пролиферации в процессе образования антител.

С развитием представлений о возможной генетической роли нуклеиновых кислот Бернет и Франк Феннер (Burnet, Frank Fenner) в 1949 г. предложили модификацию этой теории, по-прежнему исходя из биологических соображений. На этот раз они предположили, что антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном (РНК). Это приводит затем к образованию непрямой матрицы для специфических антител. Новая копия гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.

Эмиль фон Беринг

Антиген - вещества, способные вызывать иммунный ответ, выработку антител.

Классификация по происхождению: естественные АГ, искусственные АГ; АГ, полученные в результате ГМ естественных АГ; синтетические АГ.

По химическому составу – это 1)белки. Минимум, 8 АК. Но всё, что меньше 20 АК вызывает иммунную реакцию с очень низкой вероятностью. 2)углеводы. 3)НК. 4) некоторые липиды – стероиды НП, холестерин, а вот триглицериды (сильно биполярные) – оч плохие АГ, к ним АТ не вырабатываются.

По отношениям пары донор-реципиент: 1) ауто-АГ (своего организма), 2)изо-АГ (от генетически-идентичной особи: клон или близнец), 3)алло-АГ (того же вида)вероятность такого контакта у взрослого человека в природных условиях крайне мала, встречается, например, при переливании крови. У колониальных асцидий – легко4)ксено-АГ(другого вида) – всё остальное! – мыши, коровы, вирусы, бактерии. Итого, самое интересно – это ауто- и ксено-АГ.

Антигенность – мера антигенного качества, способность вызывать большую или меньшую продукцию АТ.

Иммуногенность – это способность создавать состояние иммунитет, т.е.е невосприимчивости организма при повторном контакте с антигеном.

Самый яркий пример, когд а2 эти свойства не совпадают – это сальмонелла. Продукция АТ огромна, а вот иммунитет против неё не вырабатывается. +ИППП (инф, передающиеся половым путем).

Иммуногенность связана с наличием на поверхности АГ т.н. антигенных детерминант (=эпитопов).

Г-н Карл Ландштейнер (NP1930г). Опыт:

МАБС – метааминобензолсулфонат – вводили мышам – не было никакого эффекта.

МАБС сшили с белком овальбумуном – ввели мышам – получили два типа антител: к овальбумину и к МАБС.

Термины: «гаптен» и «носитель». Гаптен – маленькая группировка, с которой происходит связывание АТ, тут и возникло понятие эпитопа. Итак, чем больше размер и чем большую гетерогенность имеет молекула АГ, тем сильнее будет ответ. Т.е иммунный ответ вызывается не всей молекулой, а определенными группировкам на её поверхности.

Другой опыт Ландштейнера:

Пришивал боковые группировки в разные позиции МАБС (орто/мета/пара)

Мышь иимунизировали конъюгатом овальбумин-МАБС. А проявлял АТ, вводя разные вещества (см.таблицу). Самое сильное связывание – в мета-положении.

Показано, что АТ специфичны к очень маленькой группировке, которая достаточно точно соответствует структуре паратопа (АГ-распознающего участка). Так, размер этой группировки (эпитопа) оч небольшой. Разные участки одной молекулы могут выполнять функции и носителя, и гаптена.

Пространственные (или криптальные) АГ.

Молекулы Антител состоят из двух белковых цепей: тяжелой и легкой. Они относятся к фракции γ-глобулинов сыворотки крови.

Портер и Эдельман, 1960е. Определили АК, нуклеотидную последовательности. Построили модели с помощью рентгено-структурного анализа. Показали, что ИГ состоит из двух тяжелый Н и двух легкий цепей L. Цепи состоят из ИГ-доменов, внутри каждого домена альфа-спиральные бета-складчатые участки, и в каждом домене есть как минимум одна дисульфидная связь. Тяж и легкие цепи связаны двумя дисульфидными связями, а тяжелые цепи между собой связаны переменным числом дисульфидных связей. Место соединения Л и Т цепей – шарнирный участок.

Изменениям подвержены только вариабельные участки VHиVL.

Типы тяжелых цепей: (в порядке открытия)

γ-цепь – IgG(4 домена)

μ – IgM(5доменов)

α – IgA(4 домена)

δ – IgD(4 домена)

ε – IgE (5 домена)

Связывание компонентов С’ происходит между 2 и 3м доменами. С С2-доменом IgGсвязаны сайты гликозилирования – эта зона шарнирного участка прикрывается. Наличие углеводного компонента приводит к вариабельности массы различных антител с разницей до 30кДа.

Несколько конформаций структуры паратопа.

Pocket– распознавание пептидов, длиной максимум 7 АК, обычно = 3-5АК.

• Расширенная поверхность (например, распознавание лизоцима)

  Исходно все эти три модели были выведены математически – а позже подтверждены экспериментально.

(картинка)

CDR–Complementarydeterminedregion– участки, определяющие комплементарность – термин касается зоны соприкосновения с АГ. В пределахCDRмогут меняться разные кусочки. Так, на тяжелой цепи триCDR, на легкой – два. Т.е. меняется не весь антиген, а только эти участки (на уровне гена - гипермутации).

Теория боковых цепей Эрлиха. Эрлих полагал, что антитела представляют собой макромолекулы, специфичность которых для антигена зависит от присутствия определенных стереохимических конфигураций, обладающих комплементарностью к аналогичным структурам антигена, что обеспечивает специфическое взаимодействие между ними. По его мнению, антитела - это естественный компонент организма, играющий роль специфического рецептора поверхностной мембраны клеток, где они выполняют в норме такие же физиологические функции, как гипотетические рецепторы для питательных веществ или как рецепторы для лекарственных препаратов, существование которых утверждал Эрлих в своих более поздних теориях химиотерапии. Один из постулатов Эрлиха заключался в том, что антиген специфически отбирает соответствующие антительные рецепторы, отрывающиеся затем от поверхности клеток. Это приводит к конденсаторной гиперпродукции рецепторов, которые накапливаются в крови в виде циркулирующих антител.

Но затем в иммунологии произошли два события, бросившие тень сомнения на теорию Эрлиха. Первым из них был целый поток исследований, показавших, что антитела можно получить против огромного количества разнообразных вполне безвредных природных веществ. Кроме того, в двадцатые годы появились, данные Ф. Обермайера и Е.П. Пика, значительно развитые затем К. Ландштейнером, согласно которым антитела могут образовываться против почти любого искусственного химического соединения, если его присоединить в качестве гаптена к белку-носителю. После этого стало казаться невероятным, чтобы организм мог вырабатывать специфические антитела против такого огромного количества чужеродных и даже искусственно созданных структур.

^ Инструктивные теории образования антител . Вполне естественно, что в тот период времени, когда так мало было известно о структуре белков и еще меньше о пути их образования, все были под впечатлением широты иммунологического репертуара и разнообразия химических структур, способных вызвать их образование. Именно это и привлекало внимание к антигену как носителю иммунологической информации. Сложилось убеждение, что именно антиген управляет образованием специфических антител, направляя механизмы белкового синтеза на изготовление тех уникальных молекулярных конфигураций, которые определяют иммунологическую специфичность. Тем или иным способом антиген должен передать новообразованной молекуле белка информацию о своей специфичности, чтобы придать этой молекуле функции антитела. Наиболее известная из этих инструктивных теории, созданная в 1930 году Ф. Брейнлем и Ф. Гауровицем, утверждала, что антиген играет роль матрицы, которая обеспечивает сборку уникальных аминокислотных последовательностей полипептидной цепи антител. Позднее инструктивная теория была развита Л. Полингом, поддержавшим ее всем авторитетом, которым он пользовался в области физической химии. Утверждалось, что антиген может служить тем шаблоном, на котором происходит свертывание преобразованной полипептидной цепи с возникновением соответствующей третичной конфигурации, заключающей в себе стереохимическую специфичность. В течение нескольких десятилетий подобные теории прямой матрицы пользовались большой популярностью, так как казалось, что они предлагают единственное разумное объяснение тому многообразию антител, которое, как показали Ландштейнер и другие, может образовываться в организме позвоночных.

С точки зрения биолога, теории матрицы обладали значительными недостатками, и именно это привело вирусолога Макфарлейна Бернета к созданию в 1941 г. другого варианта инструкционистской теории. В условиях растущего признания той роли, которую ферменты играют в процессах синтеза и расщепления, Вернет предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые необходимы для синтеза глобулина, вызывая в результате образование уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов имела то преимущество, что с позиций первичной инструктивной роли антигена она объясняла не только широту иммунологического репертуара, но и длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ.

С развитием представлений о возможной генетической роли нуклеиновых кислот М. Бернет и Ф. Феннер в 1949 году модифицировали эту теорию. Они предположили, что антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном. Это приводит затем к образованию непрямой матрицы для специфических антител.

Селективные теории образования антител. Первую чисто биологическую селективную теорию образования антител сформулировал в 1955 году Нильс Ерне, который назвал ее теорией «естественного отбора». Ерне, как и раньше Пауль Эрлих, предположил, что в организме действительно синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде «естественных антител». Функция этих антител должна состоять в том, чтобы избирательно связываться с антигеном и таким способом доставлять этот антиген неким клеткам организма, для которых антитела служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, то есть к образованию большого количества специфических антител. Теория естественного отбора, предложенная Ерне, привлекла на свою сторону лишь немного приверженцев инструктивных теорий, однако она имела большое историческое значение, так как дала стимул для теоретиков биологического направления. Действие этого стимула проявилось очень скоро, когда на протяжении трех лет М. Бернет, Д. Толмедж и Дж. Ледерберг создали клонально-селекционную теорию образования антител. Основа этой концепции в том, что антитела представляют собой естественный продукт, присутствующий на поверхности клеток в качестве рецептора, с которым антиген может вступать в избирательное (селективное) взаимодействие. Это взаимодействие служит сигналом для клональной пролиферации популяции клеток, которые фенотипически отличаются от остальных тем, что специфичны именно к данному антигену. Среди дочерних клеток клона часть дифференцируется в сторону антителообразующих клеток, а остальные сохраняются в качестве клеток иммунологической памяти, которые могут в последующем обеспечить усиленный вторичный ответ.

В дальнейшем Ж. Борде при исследовании механизмов иммунных реакций обнаружил, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит к лизису бактерий: термостабильный фактор, идентифицированный как сывороточные антитела, и термолабильный фактор, названный комплементом или алексином (от греч. aleksein - защищать). Комплемент состоит из целого комплекса белков, каждый из которых включается в комплекс «антиген-антитело» на определенной стадии иммунного ответа.

Очень часто бывает, что периоды наиболее значительного прогресса в какой-либо области отмечены дискуссией между двумя противостоящими школами, каждая из которых стремится провести эксперименты, подтверждающие ее собственную точку зрения и опровергающие противоположный взгляд. Так, в ранний период развития иммунологии такие споры возникали вокруг природы взаимодействия антиген-антитело и способа действия комплемента, и именно в этом был заключен важный стимул для быстрого развития иммунологических знаний. Но, пожалуй, ни один спор не был таким долгим и не имел таких важных последствий для дальнейшего развития иммунологии, как спор между приверженцами клеточной теории иммунитета и теми, кто считал гуморальные факторы единственной основой иммунологических процессов. Вместе с тем этот иммунологический диспут не был изолированным явлением; его следует рассматривать скорее как часть более широкой революции идей, которая происходила в медицине XIX века и затронула самые основы понимания физиологических и патологических процессов. Более двух тысячелетий в медицине господствовали представления древнегреческих гуморалистов, видевших в болезни результат количественных и качественных нарушений равновесия главных жидкостей организма. Только в XIX веке было признано значение клеток, из которых состоят различные органы и которые образуют различные жидкости тела.

Клеточной патологии Рудольфа Вирхова (утверждающей, что в основе болезней лежит нарушение функции клеток) едва исполнилось 30 лет, когда иммунологам пришлось выбирать, чью сторону они займут в их собственном варианте этого большого конфликта. Зоолог Илья Мечников был первым, кто четко сформулировал представление о важной роли лейкоцитов в защите организма от инфекционных заболеваний, которая реализуется благодаря их способности к фагоцитозу (1884 год). Это свое положение Мечников аргументировал тем, что даже у морских беспозвоночных имеются макрофаги, способные поглощать и разрушать чужеродные вещества или внедрившиеся бактерии или, по крайней мере, изолировать их с помощью гранулематозных реакций или образования гигантских клеток. Мечников полагал, что такую же защитную функцию несут фагоцитирующие клетки позвоночных, являющиеся наиболее важными участниками и естественного, и приобретенного иммунитета. Эта работа произвела глубокое впечатление на Пастера, и он пригласил Мечникова в свой недавно образованный Пастеровский институт в Париже, где Мечников с целым рядом выдающихся учеников провел следующие 28 лет в плодотворной и полной творческого воображения работе, стремясь подтвердить и расширить клеточную (фагоцитарную) теорию иммунитета .

Клеточная теория Мечникова сразу наткнулась на сопротивление. Прежде всего, она была предложена в то время, когда большинство патологов видели в воспалительной реакции, а также в связанных с ней микрофагах и макрофагах не защитную, а вредоносную реакцию. В то время считали даже, что, хотя фагоцитирующие клетки действительно способны поглощать болезнетворные микроорганизмы, это приводит не к разрушению возбудителя, а к переносу его в другие части тела и распространению болезни. Сильный удар по клеточной теории иммунитета был нанесен открытиями Беринга, Эрлиха, Борде.

Тем не менее в этот период времени было сделано две попытки примирить противоречия между гуморальным и клеточным направлениями. В 1908 году Шведская академия удостоила Нобелевской премии по медицине совместно Мечникова - основателя клеточного направления и Эрлиха - олицетворявшего гуморалистские идеи того времени. Несколько ранее в Англии Э.Райт и СР. Дуглас попытались примирить различия между этими двумя школами в своих капитальных исследованиях процесса опсонизации (от греч. opsonein - делать съедобным). Эти ученые утверждали, что клеточный и гуморальный факторы являются одинаково важными и взаимозависимыми в том отношении, что гуморальные антитела, специфически реагируя со своей мишенью - микроорганизмом, подготавливают его к фагоцитозу макрофагами.

Приверженность Райта этой идее была в Англии настолько известна, что его друг Бернард Шоу использовал это в качестве сюжета для своей пьесы «Врач перед дилеммой». Этой едкой насмешке над деятелями медицинской профессии Шоу предпослал «Предисловие о докторах», в котором выразил взгляды Райта следующим образом: «Следуя одной из самых плодотворных биологических фантазий Мечникова, сэр Элмрот Райт обнаружил, что белые кровяные шарики, или фагоциты, которые атакуют и пожирают возбудителей наших болезней, делают это лишь в том случае, если мы для аппетита намажем этих возбудителей естественным соусом, который сэр Элмрот назвал опсонином».

Период с 1910 по 1940 гг. в иммунологии был периодом серологии. В это время было сформулировано положение о специфичности и о том, что антитела являются естественными, высоковариабельными глобулинами. Большую роль здесь сыграли работы Ландштейнера, который пришел к выводу, что специфичность антител не является абсолютной. В 1900 году К. Ландштейнер разработал учение о группах крови человека, различающихся по изоантигенам эритроцитов (система АВО) и антителам к ним. С 1905 начали появляться работы Карела и Гутрие по трансплантации органов. Неудачи в трансплантологии получили объяснение в 1945 году, когда П. Медавар показал, что в основе отторжения генетически чужеродных тканей лежат те же механизмы, что и в противоинфекционном иммунитете. Произошло новое осмысление функций иммунной системы: иммунная система предстала как некий «страж порядка», несущий ответственность за генетическое постоянство организма. Возникла трансплантационная иммунология.

Во второй половине XX века началось исследование иммунологических феноменов на молекулярном уровне. На протяжении этого периода была получена точная и детальная информация о классах антител, структуре этих белков, зависимости специфичности антител от аминокислотной последовательности.

Гейдельбергер показал, что антитела являются белками и, следовательно, их можно подвергнуть молекулярному анализу.

Ландштейнер, Эвери и Гейдельбергер охарактеризовали антигенные детерминанты.

Р. Портер и Д. Эдельман расшифровали структуру антител (1972).

Б. Бенацерраф, Ж. Доссе и Д. Снелл открыли антигены системы HLA (1980).

В середине XX века успешно развивается иммунология злокачественных опухолей. Используются иммунохимические методы для диагностики первичных онкологических заболеваний. Изучаются клеточные и гуморальные факторы и механизмы противоопухолевого иммунитета, изыскиваются иммунологические методы профилактики и терапии злокачественных образований.

Период развития иммунологии XX века Ерне охарактеризовал как клеточный. В начале 50-х годов было доказано, что в организме имеются воспроизводимые антителосекретирующие единицы (КОЕ - колониеобразующие единицы - плазматические клетки) и антителообразование является формой биологической адаптации. Кроме того, было показано, что иммунокомпетентные клетки в процессе иммунного ответа дифференцируются, иммунологическая память имеет клеточную основу.

В это время осуществлены:

Идентификация циркулирующих лимфоцитов как клеток, ответственных за иммунологические феномены. В 60-70-е годы были выделены две независимые, но совместно функционирующие популяции лимфоцитов тимического и костномозгового происхождения, названные соответственно T- и B-лимфоцитами.

Идентификация Фагреус и Кунсом плазматических клеток как клеток, которые образуют и секретируют антитела. Оказалось, что синтез антител подчиняется тем же законам, что и синтез менее разнообразных белков.

Открытие субпопуляций T-лимфоцитов Митчисоном, Раевским и Гершоном. Идентификация регуляторных функций T-лимфоцитов (в иммунном ответе и гомеостазе).

Открытие антиидиотипических антител. Разработка теории иммунологической сети Ерне.

Идентификация и клонирование Тонегавой генов, кодирующих вариабельные и константные сегменты иммуноглобулинов.

В 1969 году одновременно несколькими авторами (В. Петеров, М. Беренбаум, И. Ройт) была предложена трехклеточная схема кооперации иммуноцитов в иммунном ответе (T-, B-лимфоцитов и макрофагов), определившая на многие годы изучение механизмов иммунного ответа, субпопуляционной организации клеток иммунной системы.

В конце 50-х годов независимо Ф. Бернет и Т. Давид сформулировали концепцию клеточного отбора. В 1971 году Бернет создал клонально-селекционную теорию специфического иммунитета, которая впоследствии была подтверждена многими учеными. Бернет предположил, что иммунная система контролирует генетическое постоянство внутренней среды организма. Согласно концепции Бернета в эмбриогенезе происходит уничтожение клонов клеток, способных реагировать на собственные ткани. Иммунитет включается не только на поступающие извне чужеродные агенты, но и на собственные структуры с измененным генотипом. Защита от собственных изменившихся клеток является главной задачей иммунитета, тогда как защита от микроорганизмов, чужеродных белков и клеток - производная функция иммунологического надзора.

XX век и особенно его вторую половину можно по праву считать эпохой расцвета иммунологии. Иммунитет, еще недавно понимавшийся как способ защиты организма от инфекции, оказался одним из центральных механизмов поддержания постоянства внутренней среды организма. Интенсивные исследования показали, что иммунная система представляет собой сложную высокоорганизованную структуру, включающую иммунокомпетентные клетки разной степени специализации и огромное количество регуляторных молекул. Уже не у кого не вызывает сомнения, что нормальное функционирование системы является одним из определяющих условий здоровья человека.

В настоящее время в качестве активно развивающихся направлений в фундаментальной иммунологии можно отметить исследования рецепторного аппарата клеток иммунной системы, механизмов апоптоза, путей активации клеток, исследование различных цитокинов и других гуморальных факторов.

На современном этапе огромный вклад в развитие иммунологической науки вносит биотехнология. Ведутся активные работы по созданию различных иммунопрофилактических средств - генно-инженерных, синтетических вакцин, аллерговакцин. Уделяется большое внимание созданию современных диагностических средств для выявления различных инфекций, онкозаболеваний, аутоиммунных патологий и других.

^ 17. НОБЕЛЕВСКИЕ ЛАУРЕАТЫ В ИММУНОЛОГИИ

Первой Нобелевской премии по медицине был удостоен Эмиль фон Беринг (1854-1917, Германия) «за его исследования по сывороточной терапии и, в частности, за применение ее против дифтерии». Свои исследования он проводил у Роберта Коха в Коховском институте в Берлине. Беринг со своими сотрудниками Китасато и Вернике в 90-92 гг. XIX века показали, что иммунитет к дифтерии и столбняку зависит от образования антитоксинов, циркулирующих в крови. Он показал, что пассивное введение антитоксической сыворотки может обеспечить выздоровление больных, и этим положил начало сывороточной иммунотерапии разнообразных болезней. В результате он открыл новый путь в области медицинской науки и дал в руки врача победоносное оружие против болезни и смерти.

Премия присуждена Роберту Коху (1843-1910, Германия) «за его исследования и открытия, связанные с туберкулезом». Иммунодиагностика с помощью туберкулинового теста и «феномен Коха», который состоит в повышенной кожной реакции на туберкулезные бациллы при введении их в кожу сенсибилизированных животных, сыграли решающую роль в изучении механизмов клеточного иммунитета.

Премию этого года разделили Илья Ильич Мечников (1845-1916, Россия) и Пауль Эрлих (1854-1915, Германия), получившие ее в качестве «признания их работ по иммунитету». И.И. Мечников - первый ученый, который сознательно и целеустремленно, посредством экспериментов, исследовал вопрос столь фундаментальный для иммунитета - какими средствами организм побеждает болезнетворных микроорганизмов. Сначала его эксперименты были ограничены низшими животными. Однако эти исследования открыли путь для теории фагоцитоза. Согласно ей, микроорганизмы разрушаются за счет деятельности некоторых клеток организма. Некоторые виды клеток в организмах людей и животных, а именно фагоциты имеют, в дополнение к другим функциям, задачи удаления болезнетворных микроорганизмов.

Однако, как полагали в начале XX века, кроме уничтожающего бактерии иммунитета имеется также защита другого вида, которая действует против продуктов бактерий. Повреждение, наносимое микроорганизмами, обусловлено ядами, которые эти организмы производят и которые затем распространяются по жидкостям организма. Другой вид иммунитета направлен против именно этой опасности. Лучший пример этого - использование антидифтерийной сыворотки, содержащей определенные вещества, которые действуют как антитоксины против дифтерии. Эти вещества были названы антителами. После того, как иммунитет был достигнут, антитела остаются в тканевых жидкостях организма. Многочисленные вопросы, касающиеся источника антител, их характера и строения, воздействия на токсины и многие другие, поднял в своих экспериментальных и теоретических изысканиях ученый Пауль Эрлих.

Премия присуждена Шарлю Рише (1850-1935, Франция) «за исследования по анафилаксии». Вместе со своим коллегой Полем Портье он открыл феномен анафилаксии, обусловленный не токсическими свойствами вводимых веществ, а их действием как антигенов в предварительно сенсибилизированном организме. Тем самым он открыл новое и в то время весьма неожиданное направление в медицине, показав, что «защитные» механизмы иммунитета могут также вызывать развитие болезни.

Премия присуждена Жюлю Борде (1870-1961, Бельгия) «за его исследования по иммунитету». В 1898 году он открыл феномен специфического гемолиза. Спустя некоторое время, работая вместе со своим помощником Октавом Жангу, Борде описал феномен фиксации комплемента и диагностические возможности этой реакции.

Премии удостоен Карл Ландштейнер (1868-1943, Австрия) «за открытие групп крови у человека». В своих исследованиях по антиэритроцитарным антителам он описал в 1901 году ряд изогемагглютининов человека, которые в наше время составляют систему групп крови AB0. Ландштейнер внес весьма значительный вклад в понимание химических основ взаимодействия между антителами и антигеном, обобщив наблюдения в своей знаменитой книге «Специфичность серологических реакций». Отдавая должное значение своему открытию групп крови, Ландштейнер заметил, что, с его точки зрения, премию 1930 году следовало бы скорее присудить за его исследования по взаимодействию гаптен-антитело.

Премия присуждена Максу Тейлеру (1899-1972, Южная Африка) «за разработку вакцины против желтой лихорадки». Тейлер родился в Южной Африке, изучал медицину в Англии и затем в 1922 году переехал в Соединенные Штаты. Именно он показал, что возбудителем желтой лихорадки является фильтрующийся вирус, и описанный им тест защиты мышей (при котором сывороточные антитела в смеси с вирусом защищают мышь от гибели при внутримозговом заражении) стал весьма приемлемым инструментом в эпидемиологических и других исследованиях желтой лихорадки. В конце 30-х годов ему удалось получить аттенуированные штаммы, которые сохраняли свою иммуногенность, но были лишены патогенности и составили основу современных эффективных вакцин против желтой лихорадки.

Премия присуждена Даниэлю Бове (1907-1992, Швейцария) «за разработку антигистаминных препаратов для лечения аллергии». Открытие феномена Шульца-Дейла (сокращение кусочка матки под влиянием антигена) позволило моделировать in vitro аллергические реакции и изучать участвующие в них физиологические механизмы. В результате этого было обнаружено, что среди факторов, которые освобождаются при анафилаксии, наиболее важными являются гистамин, серотонин и другие биологически активные вещества. Бове, по-видимому, познакомился с иммунологией и аллергией в период своей работы в Пастеровском институте в Париже, когда он опубликовал много работ о действии различных химических соединений на вегетативную нервную систему. Эти исследования привели его к поиску веществ, способных подавлять действие гистамина; в результате появились лекарственные препараты, оказавшиеся эффективным средством лечения астмы и сенной лихорадки.

Премия присуждена Франку Макфарлейну Бернету (1899-1985, Австралия) и Питеру Медавару (1915-1987, Великобритания) «за открытие приобретенной иммунологической толерантности». Медавар показал, что отторжение чужеродного кожного трансплантата подчиняется всем правилам иммунологической специфичности и в основе его лежат такие же механизмы, как и при защите от бактериальных и вирусных инфекций. Последующая работа, которую он провел вместе с рядом учеников, заложила прочную основу для развития трансплантационной иммунобиологии, которая стала важной научной дисциплиной и в дальнейшем обеспечила многие достижения в области клинической трансплантации органов. Бернет опубликовал книгу «Образование антител» (1941 г.). Он утверждал, что способность к иммунологическим реакциям возникает на сравнительно поздних стадиях эмбрионального развития и при этом происходит запоминание существующих маркеров «своего» у антигенов, присутствующих в данный момент. Организм в последующем приобретает к ним толерантность и не способен отвечать на них иммунологической реакцией. Все антигены, которые не запомнились, будут восприниматься как «не свои» и смогут в дальнейшем вызывать иммунный ответ. Было высказано предположение, что любой антиген, введенный в течение этого критического периода развития, будет затем восприниматься как свой и вызывать толерантность, в результате чего не сможет в дальнейшем активировать иммунную систему. Эти идеи были далее развиты Бернетом в его клонально-селекционной теории образования антител. Предположения Бернета были подвергнуты экспериментальной проверке в исследованиях Медавара, который в 1953 году на мышах чистых линий получил четкое подтверждение гипотезы Бернета, описав феномен, которому Медавар дал название приобретенной иммунологической толерантности.

Премия присуждена Джералду М. Эдельману (1929, США) и Роднёю Р. Портеру (1917-1985, Великобритания) «за их исследования по химической структуре антител». Данные А. Тизелиуса и Э.А. Кэбета о том, что антитела являются гамма-глобулинами с большой молекулярной массой, показали, насколько трудным будет установить химическую основу для их первичной иммунологической специфичности и их вторичных биологических свойств. Расщепляя молекулу антитела ферментами, Портер стремился получить более мелкие активные фрагменты, ив 1958 году он добился успеха. При расщеплении папаином из молекулы антитела удалось выделить три составляющие ее фрагмента: два идентичных Fab-фрагмента и третий Fc-фрагмент. Fab-фрагмент содержит антительные участки связывания антигена, а Fc обеспечивает вторичную биологическую активность антитела. Затем Эдельман показал, что, восстанавливая гомогенный белок, можно выделить составляющие его полипептидные цепи - легкие (L) и тяжелые (Н). Далее Портер показал, что молекула иммуноглобулина образована двумя легкими и двумя тяжелыми цепями. На основе этих данных была создана теперь уже общепризнанная модель строения IgG. Выделение из иммуноглобулина цепей и фрагментов открыло возможность изучения их аминокислотной последовательности; такие исследования стали проводиться с большой интенсивностью в лабораториях Портера, Эдельмана и многих других исследователей. В результате этих работ было установлено, что в L- и Н-цепях существуют как вариабельные, так и константные области, и появилась возможность сравнивать первичную структуру антител разной специфичности и даже разных видов животных. Наконец в 1969 г. Эдельман и его сотрудники сумели полностью расшифровать первичную структуру одной молекулы иммуноглобулина, что позволило не только установить положение антигенсвязывающего участка, но также локализовать те «домены», которые обеспечивают вторичные биологические функции антител.

Премия по медицине присуждена Розалине Ялоу (1921, США) «за разработку метода радиоиммунологического анализа пептидных гормонов». Гормоны - химические вещества с очень большим диапазоном различного действия при концентрациях, которые в течение долгого времени казались настолько низкими, что считались следовыми. Розалина Ялоу работала над методологией измерения содержания гормонов в крови при очень низких концентрациях. Розалина Ялоу и ее коллега Соломон Берсон обнаружили случайно, что белковый гормон инсулин после введения в кровь человека, больного сахарным диабетом, способствует образованию антител против инсулина. Через пару лет интенсивной работы они представили в 1960 году метод для определения белковых гормонов в крови, принцип которого был основан на способности этих гормонов вызывать продукцию антител. В результате смешивания в пробирке известного количества радиоактивного инсулина с известным количеством антител против инсулина образуются комплексы инсулин-антитело с частью радиоактивного инсулина. Впоследствии, если добавить к этой смеси небольшое количество крови, которая содержит инсулин, инсулин крови замещает некоторую часть радиоактивного инсулина в комплексах с антителами. Чем выше концентрация инсулина находится в пробе крови, тем большее количество радиоактивного инсулина будет отделено от антител. Количество радиоактивного инсулина, удаленного из комплексов, может легко быть установлено, тем самым указывая точную величину содержания исследуемого инсулина в пробе крови. Таким образом метод Розалины Ялоу и его последующие модификации позволили применять его далеко за рамками ее собственной области исследования.

Премия по медицине присуждена Баруху Бенацеррафу (1920, Венесуэла), Жану Доссе (1916, Франция) и Джорджу Д. Снеллу (1903-1996, США) «за их работу по генетически детерминированным структурам клеточной поверхности, регулирующим иммунологические реакции». В 1965 году Доссе и его сотрудники описали систему примерно из 10 антигенов человека, закодированных в главном комплексе гистосовместимости, который включает «сублокусы», определяющие ограниченное число антигенных аллелей.

Нобелевская премия по медицине присуждена Нильсу К. Ерне (1911-1994, Дания), Джорджу Г.Ф. Кёлеру (1946- 1995, Германия) и Цезарю Мильштейну (1927-2002, Аргентина) «за теории, касающиеся специфичности в иммунной системе, и открытие принципов получения моноклональных антител». Ерне - известный теоретик в области иммунологии - выдвинул предложение, что способность иммунной системы идентифицировать несметное число антигенов была как-то предопределена еще до первого поступления антигена. А при поступлении антигена происходит некий выбор в пользу нужных антител и увеличивается их наработка. Теория Ерне сильно контрастировала с преобладающими в то время теориями, но она быстро была поддержана и расширена.

Отправной точкой для следующей важной теории Ерне в 1971 году явилась особенность иммунной системы одного индивидуума отторгать ткань другого. Ерне предполагал, что за эти реакции ответственны молекулы, названные им антигенами трансплантации. По его предположению, они должны иметь определенные функции в здоровом организме, не подвергшемуся трансплантации. Одной из функций этих молекул могла быть активация и запуск сигналов об увеличении количества клеток иммунной системы, участвующих в защите тканей организма. Специальные органы, например тимус, могли были приняты в качестве «оранжереи» и «университета» для этих клеток. В этой теории Ерне предсказывал феномен образования специфичности для клеточного звена иммунитета.

В третьей теории в 1974 году Нильс Ерне представил предполагаемую картину устройства иммунной системы. Иммунная система уподобляется гигантскому компьютеру, где осуществляется постоянная связь и регулирование между различными ее компонентами. Количество клеток в такой системе в организме взрослого человека превышает 10 12 млн.; кроме того, система имеет способность производить миллиарды различных антител с огромным структурным разнообразием. Некоторые антитела, согласно теории, подражают антигенам, против которых нарабатываются другие антитела. И тогда в ответ на проникновение антигена в организм иммунитет срабатывал бы быстрее. Это стало, по сути, предсказанием существования иммунологической памяти. Таким образом, умозрительные теории Ерне позволили современной иммунологии сделать важные шаги по пути новых открытий.

Джордж Келер и Цезарь Мильштейн открыли и развили принципы производства так называемых моноклональных антител с помощью гибридомной технологии. Мильштейн, работал с опухолевыми плазматическими клетками, способными производить антитела. Однако антигенов, с которыми они могли бы связываться, не было найдено. В то же самое время молодой исследователь Келер пытался вырастить нормальные плазматические клетки в условиях in vitro. Только немногие плазматические клетки могли существовать в культуре, и то недолгое время. Тогда Келер, узнав об опытах Мильштейна, обратился к нему с предложением создать гибриды опухолевых клеток с нормальными плазматическими клетками, продуцирующими антитела. Свойства опухолевых клеток позволили бы этим гибридам приобрести большую жизнеспособность для выращивания в культуре.

Ученые смогли решить эту задачу за два года. К этому времени они отработали технику, позволяющую им по желанию получить гибридные клетки, производящие нужные антитела. Эти клетки имели высокую жизнеспособность, чтобы произвести антитела в высоком количестве. Ученые назвали эти гибридные клетки гибридомами, а поскольку все клетки в гибридомной культуре происходят от одной гибридной клетки, антитела были названы моноклональными.

Премия по медицине присуждена Сусумо Тонегава (1939, Япония) «за открытие генетических принципов генерации антител». Благодаря исследованиям Тонегавы стали ясны молекулярно-биологические механизмы формирования огромного разнообразия активных центров антител, а позднее и T-клеточных рецепторов.

Премия по медицине и физиологии присуждена Жозефу Е. Марри (1919, США) и Е. Донналлу Томасу (1920, США) «за открытия в области трансплантологии органов и клеток». Они создали основы техники пересадки клеток костного мозга при лейкозах и при пересадке таких органов, как почка, используя подбор донора и реципиента по антигенам гистосовместимости и применяя созданные ими цитотоксические препараты.

Премия по медицине присуждена Питеру К. Догерти (1940, Австралия) и Рольфу М. Зинкернагелю (1944, Швейцария) «за их открытия в области специфичности клеточного иммунного ответа». Оба работают в США. Основная заслуга лауреатов заключается в расшифровке механизмов узнавания антигенов T- и B-лимфоцитами. Этот механизм был назван когнатным, или сцепленным, распознаванием.

Премия по медицине и физиологии присуждена Лиланду Г. Хартвеллу (1939, США), Р. Тимоти Ханту (1943, Великобритания) и Полю М. Нёрсу (1949, Великобритания) «за открытие ключевых регуляторов клеточного цикла». Лауреаты обнаружили ключевые регуляторы клеточного цикла - циклин-зависимые киназы (CDK) и циклины. Вместе эти два компонента образуют фермент, в котором CDK является как бы «молекулярным двигателем», проводящим клетку через клеточный цикл, изменяя структуру и функцию других белков в клетке. Циклин - это главный «переключатель», который запускает и останавливает «CDK-двигатель». Были обнаружены гены, ответственные за деление клетки, названные CDC-гены. Один из этих генов, CDC28, контролирует инициацию клеточного цикла. Ими была также сформулирована концепция «сверочных точек», которые гарантируют, что события клеточного цикла идут правильно. Дефекты сверочных точек рассматривается в качестве одной из причин преобразования нормальных клеток в раковые.

Премия по медицине и физиологии присуждена Сиднею Бреннеру (1927, Великобритания), г. Роберту Хорвитцу (1947, США) и Джону Е. Сулстону (1942, Великобритания) «за открытие генетической регуляции развития органов и программированной клеточной смерти». Эти исследования были выполнены на нематоде Caenorhabditis elegans . Ученые идентифицировали несколько генов, ответственных за программированную гибель клеток. Кроме того, они показали, что в человеческих клетках имеются гомологи этих генов.

Первую «селекционную» теорию образования антител предложил в 1900 г. Пауль Эрлих (Ehrlich). Согласно его теории, существуют клетки (по-видимому, В-лимфоциты), на поверхностной мембране которых расположено много разных молекул антител. Эти клетки способны синтезировать любое из них. После того как происходит связывание чужеродного антигена с каким-то одним антителом, клетка начинает производить антитела только этой специфичности. Поскольку этот «селективный» процесс происходит одновременно в большом числе клеток, образуется много антител, специфичных к данному антигену. Сейчас известно, что идея Эрлиха не верна. Современные селекционные теории, основанные на представлениях о том, что одна клетка может продуцировать только антитела одного типа (а не многих), начали появляться только в 1950-х гг.

Первой среди них была теория, предложенная Нильсом Ерне (Jerne) в 1955 г. Его теория переместила интересы иммунологов с инструктивных теорий, по которым антитела принимают любую форму в зависимости от формы антигена, на селекционные. В 1957 г.Макфарлейн Бернет предположил, что основной единицей отбора антигеном является клетка, и что одна клетка отвечает за образование антител только одного типа. Именно Бернет придумал термин «клональная селекция». В основе этой теории лежит представление о том, что «одна клетка производит только одно антитело» (точнее, антитела одной специфичности). Существует много разных клеток (лимфоцитов), образующих и несущих на поверхности разные антитела. Клетка «отбирается» антигеном, форма которого соответствует антителам, производимым данной клеткой. Именно она начинает размножаться и дает клон идентичных клеток, причем все клетки клона продуцируют антитела одной специфичности. Согласно этой теории, должен существовать механизм, который обеспечивает проявление на поверхности клетки антител только одной специфичности и исключает все другие антитела. Теперь мы знаем, что «решение», какое антитело будет синтезироваться в В-клетке, принимается на ранних стадиях развития лимфоцита. Бернет не только нашел экспериментальные свидетельства в пользу этой теории, но и сформулировал ее следствия для проблемы различения «своего» и «не-своего».

Далее клонально-селекционная теория развивалась усилиями таких исследователей, как Мелвил Кон и Элистэр Каннингем (Cunningham). До сих пор основные представления этой теории объясняют, как иммунная система приспосабливается к разнообразным и постоянно меняющимся антигенам внешней среды. Основные положения клонально-селекционной теории подтверждены экспериментально.

Привлекательность этой теории состояла в том, что она давала разумные объяснения механизма аутотолерантности. Если рецептор на поверхности развивающегося незрелого лимфоцита связывается с собственным антигеном, клетка получает «отрицательный» сигнал и уничтожается. Так как собственные антигены - это первые молекулы, которые встречаются незрелым лимфоцитам, этот процесс должен происходить в местах развития лимфоцитов. Бернет назвал его уничтожением «запрещенных» клонов. Только лимфоциты, прошедшие этот селекционный фильтр (уничтожение запрещенных клонов), достигают зрелости и приобретают способность связываться с чужеродными антигенами.

Мелвин Кон, а затем Элистэр Каннингем привели доводы в пользу того, что иммунная система имеет способность генерировать соматические мутации генов антител в ответ на внедрение чужеродных антигенов. По их мнению, по-видимому, выгодно, чтобы с ДНК зародышевой линии наследовалось только небольшое число необходимых Ig генов, а новые могли бы возникать в течение жизни животного в виде соматических мутаций, вызванных антигеном.

Сузуму Тонегава (Япония) открыл генетической основы образования вариационного богатства антител. В стрессовой ситуации, которую создает вторжение антигена, включается механизм перестройки генов иммуноглобулинов: генетическая система по каким-то не вполне еще понятным правилам режет и сшивает фрагменты генов до тех пор, пока не найдет приемлемый вариант – тот, что синтезирует антитело, которое реагирует с вторгшимся антигеном. Найденный вариант клонируется (т.е. размножается из единственного родоначального экземпляра).

За открытие этого механизма иммунолог из Японии Сусуму Тонегава получил в 1987 г. Нобелевскую премию (работа начата в Швейцарии, а завершена в США). Суть открытия в том, что ген может быть переделан в цитоплазме.

Указанный механизм рекомбинаций поставляет антитела, связывающие антигены довольно слабо. Для улучшения их «качества», для тонкой подстройки, осуществляется следующий этап, соматический (т.е. не связанный с размножением), –гипермутагенез . Гипермутагенез заключается в том, что при клонировании гены «болванки» (первично найденного варианта) мутируют с огромной частотой (каждый тысячный нуклеотид заменяется, тогда как обычно точковый мутагенез в 100 миллионов раз менее интенсивен), а потом с их копий синтезируется масса чуть отличных друг от друга белковых цепей антител, какое-то из которых оказывается подогнанным к антигену наилучшим образом. Этот окончательный вариант снова клонируется и запоминается клетками иммунной памяти, т.е.наследуется на время жизни особи (возникаетприобретенный иммунитет ).

В этом, грубо говоря, состоит генетический принцип обеспечения разнообразия антител (термин Тонегавы): возникшие при перестройках фрагменты сшиваются (механизм Тонегавы), причем с нематричными вставками (механизм Альта–Балтимора, п.4), затем успешный вариант точно подгоняется к антигену (механизм гипермутагенеза), клонируется и запоминается (соматическое наследование).

Словом, гены антител образуются не за счет случайных мутаций, как думали прежде, а путем многостадийного процесса, в котором лишь одну ступень можно назвать мутагенезом и то в особом смысле: он направлен – в том смысле, что происходит только в нужных участках нужных генов, зато с неимоверной частотой.

Первичный и вторичный иммунный ответ.

При попадании антигенов в организм в первые сутки наблюдается антигенемия (циркуляция антигенов в крови). Основное количество антигена исчезает из крови через сутки и накапливается в лимфоузлах. В случаях бактериемии или вирусемии количество антигена может снова увеличиваться.

П е р в и ч н ы й и м м у н н ы й ответ развивается после латентного периода (3-5 дней), во время которого происходит распознание АГ и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза , соответствующая поступлению АТ в кровь. Продолжительность 7-15 суток. Постепенно титры АТ достигают пика и наступает стационарная фаза , продолжительность которой 15-30 суток. Ее сменяет фаза затухания , характеризующаяся снижением титров АТ, длящаяся 1-6 месяцев.

Первыми синтезируются IgM, а затем IgG (они могут сохраняться в течение всей жизни). Позже всех и не всегда появляются в небольших количествах IgA, E, D. Одновременно нарастает количество уровень иммунных Т-лимфоцитов, образуются комплексы антиген-антитело. В зависимости от вида антигена преобладают или иммунные Т-лимфоциты, или антитела.

Особенность первичного иммунного ответа – низкая скорость антителообразования и появление сравнительно невысоких титров АТ.

В т о р и ч н ы й и м м у н н ы й о т в е т.

Как мы уже отмечали , после антигенной стимуляции часть клетов В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности вторичного имунного ответа:

латентный период очень непродолжительный – несколько часов;

за счет клеток памяти стимуляция синтеза антител и иммунных Т-клеток наступает быстро (через 1-3 дня);

образование АТ стимулируется значительно меньшими дозами АГ;

высокая скорость антителообразования;

титры АТ достигают максимального значение (кривая скорости синтеза антител значительно круче, чем при первичном иммунном ответе;

синтезируются сразу антитела, относящиеся к классу IgG;

часть антител связывается с Fc-рецепторами лейкоцитов;

образующиеся антитела циркулируют в организме длительное время.

Чем больше контактов с антигенами, тем выше уровень антител. Это явление используют при иммунизации (многократном введении антигена животным) с целью получения антисывороток, которые применяют для диагностики и лечения.

11. Иммунологическая память

Иммунологическая, или иммунная, память – способность иммунной системы отвечать на вторичное проникновение АГ быстрым развитием специфических реакций по типу вторичного иммунного ответа. Иммунная память проявляется как в отношении выработки антител, так и в отношении других имунных реакций (гиперчувствительности замедленного типа, трансплантационный иммунитет и проч.).

Реализацию этого эффекта обеспечивают стимулированные Т- и В-лимфоциты, не выполняющие эффекторные функции. Не все индуцированные антигеном В-лимфоциты подвергаются дифференцировке до конца. Часть из них после нескольких циклов деления перестает размножаться и образует субклон клеток памяти (из одной В-клетки образуется около 1000 клеток памяти, таким же образом образуются клетки памяти и из Т-лимфоцитов). Клетки памяти определяют продолжительность приобретенного иммунитета. При повторном контакте с данным антигеном они быстро превращаются в клетки-эффекторы.

Феномен интенсивного развития иммунного ответа на вторичное попадание АГ – бустер-эффект [от англ. to boost, усиливать] используют для получения лечебных и диагностических сывороток с высоким титром антител (гипериммунные сыворотки) от иммунизированных животных. Бустер-эффект также применяют для быстрого создания невосприимчивости при повторных вакцинациях (например, для профилактики туберкулеза).

Эффект иммунной памяти составляет основу вакцинопрофилактики многих инфекционных заболеваний.

Кооперации ИКК в регуляции иммунного ответа