Методы определения микотоксинов и контроль за загрязнением пищевых продуктов. Действие микотоксинов на организм человека

Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Отбирают полученные экстракты в микрофлаконы, производят выпаривание растворителя и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана. В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Продолжительность определения микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к пищевой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано при определении содержания микотоксинов в пищевых продуктах, зерновых культурах, комбикормах и мясе с целью оценки их безопасности.

Методик определения всех нормируемых микотоксинов из одной навески в настоящее время не предложено. Известны способы определения отдельных микотоксинов или отдельных классов.

Так, для определения зеараленона, Т-2, охратоксина А применяют тонкослойную хроматографию для каждого токсина отдельно (ГОСТ 28001-88. Методы определения микотоксинов Т-2, зеараленона и охратоксина А. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма). Метод чрезвычайно сложный, длительный и позволяет полуколичественно определить указанные микотоксины каждого из отдельной навески.

Известен способ определения афлатоксинов (B1, B2, G1, G2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ГОСТ Р 53162-2008. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1, G2). Афлатоксины экстрагируют метанолом, экстракт очищают и концентрируют на иммуноаффинной колонке, элюируют метанолом, упаривают до малого объема и хроматографируют. Методика длительна, дорогостояща и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ определения дезоксиниваленола (ГОСТ Р 51116-97. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола), основанный на извлечении микотоксина из пробы ацетонитрилом, очистке экстракта на двух последовательных колонках с углем, элюировании дезоксиниваленола ацетонитрилом, упаривании экстракта до малого объема и анализ методом жидкостной хроматографии с УФ-детектором. Однако предлагаемый способ длителен, трудоемок и не позволяют одновременно определить все микотоксины.

Известен способ определения патулина (Патент РФ № 2056044, G01N 33/02. Способ количественного определения патулина в пищевых продуктах), основанный на извлечении патулина из пробы этилацетатом, очистке экстракта на адсорбенте, концентрировании экстракта и анализе методом жидкостной хроматографии. Методика длительна и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ одновременного определения трихотоценовых микотоксинов и зеараленона в зерне методом газовой хромато-масс-спектрометрии (Toshitsuga Tanaka at al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry / J.Chromatogr. A. 2000. 882. P.23-28). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 10 г навески 100 мл ацетонитрила в течение 30 мин, удалении жира экстракцией 20 мл гексана, упаривании ацетонитрильного экстракта досуха, растворении сухого остатка в смеси метанола с хлороформом, очистки экстракта на колонке с флорисилом, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в 2 мл метанола, дериватизации тетраметилсиланом и затем хроматографировании. Способ длителен, трудоемок и дорогостоящ.

Известен способ одновременного определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона в зерне методом высокоэффективной хроматографии с флуориметрическим детектором (Gobel R., Lusky К. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquit chromatography / Food Chemical Contaminants. 2004. V.87. № 2. P.411-418). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора ацетонитрила, очистки экстракта на иммуноаффинной колонке, извлечении из колонки микотоксинов 2 мл метанола, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в гексане, дериватизации трифторуксусной кислотой 15 мин, упаривании досуха, растворении остатка в метаноле и определении микотоксинов при разных длинах волн (афлатоксины - 360-440 нм, зеараленон - 276-466 нм и охратоксин А - 330-460 нм). Способ длителен и трудоемок, требует большого количества растворителей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ одновременного определения афлатоксинов в зерновых продуктах (Campone L., Piccinelli A.L., Cetano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in cereal products / J.Chromatogr. A.2011. 1248. P.7548-7554). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора метанола, удалении жира экстракцией 6 мл гексана, очистки 1 мл экстракта с использованием дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции хлороформом (220 мкл), удалении хлороформа, растворении остатка в 0,1 мл метанола и определении афлатоксинов методом ФЭЖХ с флуориметрическим детектором. Коэффициент концентрирования микотоксинов составляет 2,0-2,5. Однако метод длителен, требует большого количества растворителей, мал коэффициент концентрирования и не дает возможности определения других микотоксинов из этого же экстракта. Продолжительность анализа только для афлатоксинов составляет 1,5-2 часа.

Цель изобретения - сокращение продолжительности анализа, увеличение воспроизводимости и надежности результатов анализа, сокращение расхода органических растворителей и обеспечение безопасности оператора.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения микотоксинов, включающему отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck F.J. // J. AOAC Int. 2003. V.86. № 2. P.412), центрифугирование и определение хроматографическими методами. В предлагаемом способе экстракцию проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13- и 15-ацетилдезоксиниваленол, патулин, зеараленон, охратоксин А) методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.

Пример определения микотоксинов. В пробирку вместимостью 50 мл помещают 2,000 г измельченного продукта (зерно, комбикорм, мясо), добавляют 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды, энергично встряхивают 5 мин, высыпают смесь солей (4 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 1 г цитрата натрия одноводного и 0,5 г цитрата натрия 1,5-водного), закрывают и энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают 8 мл полученного экстракта в пробирку вместимостью 15 мл, содержащую 0,9 г сульфата магния, по 0,2 г сорбентов Bondesil PSA и С18, энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.

В три пробирки отбирают по 2 мл полученного экстракта. В первую вносят 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, во вторую - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, в третью - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси каждую отдельно впрыскивают с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в конических центрифужных пробирках, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне и центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстрактов в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана.

В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Условия хроматографирования: колонка «Kromasil С18», 150 мм, подвижная фаза ацетонитрил/вода (30/70), объем пробы 10 мкл, длина волны возбуждения 340 нм, детектирования 450 нм для афлатоксинов, 330-460 нм для охратоксина А и 276-460 для зеараленона.

Во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпетол, 13-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдезоксиниваленол), зеараленон, патулин, охратоксин А методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов. Условия хроматографирования: капиллярная колонка «OPTIMA ® - 5 - Accent» (Macherey - Nagel, Германия, 30 м), температура термостата колонки 120°С, температура испарителя 200°С, детектора 300°С. Температура термостата колонки 120-310°С (скорость нагрева 15 град./мин), газ-носитель - азот, объем вводимой пробы 1 мкл без деления потока.

В третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Условия хроматографирования: колонка хроматографическая «XTerra RP18», 150 мм, подвижная фаза - ацетонитрил/вода (градиент 4-80% ацетонитрила), скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, детектирование при аналитических длинах волн 236 и 270 нм.

Основные метрологические характеристики определения микотоксинов в оптимальных условиях по данной методике при введенных добавках стандартов микотоксинов в зерно, мясо и комбикорма на трех уровнях концентраций указаны в таблице.

Продолжительность определения для указанных в таблице микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Коэффициент концентрирования примерно в 3 раза выше по сравнению с прототипом, что приводит к более чувствительному определению указанных микотоксинов. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения, включающий отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS), центрифугирование и определение хроматографическими методами, отличающийся тем, что извлечение микотоксинов проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, зеараленона и охратоксина А) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.

Методы определения микотоксинов. Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.

Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный метод определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы) для одновременного определения до 30 различных микотоксинов, флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами, и некоторые другие.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. Химические методы являются в настоящее время наиболее распространенными и состоят из двух стадий: стадии выделения и стадии количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов, таких как газовая (ГХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия. Количественную оценку содержания микотоксинов проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции при ТСХ в ультрафиолетовой области спектра со стандартами. Для подтверждения достоверности полученных результатов применяют различные тесты, основанные на получении производных микотоксинов с иными хроматографическими, колориметрическими или флюорометрическими характеристиками.

Высокочувствительные и высокоспецифичные радиоиммуно-химические и иммуноферментные методы обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов находят все более широкое применение и пользуются повышенным вниманием со стороны исследователей. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Основным преимуществом этих методов является их исключительная чувствительность.

Биологические методы обычно не отличаются высокой специфичностью и чувствительностью и применяются, главным образом, в тех

случаях, когда отсутствуют химические методы выявления микотоксинов или в дополнение к ним в качестве подтверждающих тестов. В качестве тест-объектов используют различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, различные лабораторные животные, культуры клеток и тканей.

Контроль за загрязнением микотоксинами. В настоящее время вопросы контроля за загрязнением продовольственного сырья, пищевых продуктов и кормов микотоксинами решаются не только в рамках отдельных государств, но и на международном уровне, под эгидой ВОЗ и ФАО.

В системе организации контроля за загрязнением продовольственного сырья и пищевых продуктов можно выделить два уровня: инспектирование и мониторинг, которые включают регулярные количественные анализы продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Мониторинг позволяет установить уровень загрязнения, оценить степень реальной нагрузки и опасности, выявить пищевые продукты, являющиеся наиболее благоприятным субстратом для микроскопических грибов - продуцентов микотоксинов, а также подтвердить эффективность проводимых мероприятий по снижению загрязнения микотоксинами. Особое значение имеет контроль за загрязнением микотоксинами при характеристике качества сырья и продуктов, импортируемых из других стран.

С целью профилактики алиментарных токсикозов основное внимание следует уделять зерновым культурам. В связи с этим необходимо соблюдать следующие меры по предупреждению загрязнения зерновых культур и зернопродуктов.

1. Своевременная уборка урожая с полей, его правильная агротехническая обработка и хранение.

2. Санитарно-гигиеническая обработка помещений и емкостей для хранения.

3. Закладка на хранение только кондиционного сырья.

4. Определение степени загрязнения сырья и готовых продуктов.

5. Выбор способа технологической обработки в зависимости от вида и степени загрязнения сырья.

Основные пути загрязнения продовольственного сырья и пищевых продуктов токсичными штаммами микромицетов приведены на рис. 11.7.

536:: 537:: Содержание

537:: 538:: 539:: 540:: 541:: 542:: 543:: 544:: 545:: 546:: 547:: 548:: 549:: 550:: Содержание

Микотоксины и методы их определения

Микотоксины (от греч. mykes - гриб и toxikon - яд) - это вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами. Высокая опасность микотоксинов выражается в том, что они обладают токсическим эффектом в чрезвычайно малых количествах и способны весьма интенсивно диффундировать в глубь продукта.

Афлатоксины являются представителями наиболее опасной группы мико­токсинов, обладающих сильными гепатотоксилескими и канцерогенными свойст­вами. Продуцентами афлатоксинов являются различные штаммы только двух видов аспергилл (Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus), которые широко распространены во всем мире. Следует отметить, что токсигенные грибы могут поражать растительные субстраты не только во время хранения, но и в процессе их роста, сбора урожая, транспортирования и переработки.

Семейство афлатоксинов включает четыре основных представителя (афла­токсины В 1 , В 2 , G 1 , G 2), а также более 10 соединений, являющихся производными или метаболитами основной группы (М 1 , М 2 , В 2а, G 2а, GM 1 , Р 1 , Q 1 и др.).

В природных условиях чаще и в наибольших количествах афлатоксины обнаруживаются в арахисе, кукурузе, семенах хлопчатника. Кроме того, в зна­чительных количествах они могут накапливаться в различных орехах, семенах масличных культур, пшенице, ячмене, зернах какао и кофе, а также в кормах для сельскохозяйственных животных.

Следует отметить возможность появления афлатоксинов в продуктах жи­вотного происхождения: в молоке, тканях и органах животных, получавших корм, загрязненный афлатоксинами в высоких концентрациях.

Доказано, что коровы экскретируют с молоком от 0,35 до 2-3 % получен­ного с кормом афлатоксина В 1 в виде высокотоксичного метаболита - афлатоксина М 1 При этом пастеризация молока и процесс высушивания не оказывают существенного влияния на содержание в нем афлатоксина М 1 . Афлатоксин М 1 был обнаружен как в цельном, так и в сухом молоке и даже в молочных продуктах, подвергшихся технологической обработке (пастеризация, стерилизация, приготовление творога, йогурта, сыров и т. п.). Так, в процессе получения сыра из контаминированного молока 50 % афлатоксина М 1 определяется в творожной массе. При получении масла 10 % афлатоксина М 1 переходит в сливки, 75 % ос­тается в снятом молоке.

Афлатоксины слабо растворимы в воде, нерастворимы в неполярных рас­творителях, но легко растворимы в растворителях средней полярности, таких как хлороформ, метанол и диметилсульфоксид. Они достаточно нестабильны в химически чистом виде и чувствительны к воздействию воздуха и света.

Афлатоксины практически не разрушаются при ооычнои кулинарной оораоотке кон-таминированных пищевых продуктов.

Трихотеценовые микотоксины являются вторичными метаболитами мик­роскопических грибов рода Fusarium, которые поражают корма и пищевые про­дукты, вследствие чего у животных и человека возникает алиментарный токси­коз. Чаще всего они обнаруживаются в зерне кукурузы, пшеницы и ячменя. Ми­котоксины этой группы отличаются повсеместным распространением, особенно в странах с умеренным континентальным климатом. Нередко в одном и том же продукте обнаруживают два или более микотоксинов. При проведении обяза­тельной сертификации предусмотрен контроль за содержанием двух представи­телей этой грутпты, а именно нормируются дезоксиниваленол и Т-2 токсин.

Дезоксиниваленол (ДОН) - один из распространенных фузариотоксинов - подавляет синтез белка, снижает концентрацию итгуногаобулинов в сыворотке крови, может подавлять ре1фодуктивную систему. Особенно опасным является загрязнение кормов для сельскохозяйственных животных. Так, ДОН вызывает у животных рвоту, снижает потребление корма у поросят. Т-2 токсин распростра­нен менее широко, но более токсичен, чем ДОН. Т-2 токсин вызывает раздраже­ние, кровоизлияния и некроз в пищеварительном тракте. Острая интоксикация трихотеценами сопровождается поражением органов кроветворения и иммуно-компетентных органов. Характерны развитие геморрагического синдрома, отказ от корма, рвота.

Зеараленон и его производные также продуцируются микроскопическими грибами рода Fusarium. Основным природным субстратом, в котором наиболее часто обнаруживается зеараленон, является кукуруза. Грибы рода Fusariurn gra-minearum часто поражают кукурузу в поле на корню и являются причиной гнили початков и стеблей. Контаминация кукурузы зеараленоном может происходить и при хранении. Высока частота обнаружения зеараленона в комбикормах, а так­же в пшенице, ячмене и овсе. Среди пищевых продуктов этот токсин был обна­ружен в кукурузной муке, хлопьях и кукурузном пиве.

Зеараленон обладает выраженным эстрогенным и тератогенным действи­ем и представляет серьезную проблему для животноводства во многих странах, а способность этого микотоксина накапливаться в тканях сельскохозяйственных животных делает его потенциально опасным для здоровья человека. Загрязне­ние кормов зеараленоном вызывает снижение плодовитости, аборты, бесплодие и воспалительные заболевания у свиней, коров, до­машней птицы и кроликов. Несмотря на это, неко­торые производные зеараленона до последнего вре­мени использовались в качестве стимуляторов роста животных и достаточно широко производились про­мышленностью.

Патулин - особо опасный микотоксин, обладающий канце­рогенными и мутагенными свойствами. Основными продуцентами патулина являются микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium expansum. Продуценты патулина поражают в основном фрукты и некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах, абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике, облепихе, айве, томатах. Наиболее часто патулином поражаются яблоки, где содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг. Следует отметить, что патулин обнаруживают не только в подгнив­шей части фруктов и овощей, но и в нормальной. Например, в томатах патулин распределяется равномерно по всей ткани.

Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах переработ­ки фруктов и овощей: соках, компотах, mope и джемах. Особенно часто его находят в яблочном соке (0,02-0,4 мг/л). Содержание патулина в других видах соков: груше­вом, айвовом, виноградном, сливовом, манго - колеблется от 0,005 до 4,5 мг/л.

Контроль за содержанием микотоксинов является обязательным при прове­дении сертификации продовольственного сырья и пищевых продуктов. В России приняты санитарно-гигиенические нормативы по содержанию микотоксинов в продуктах питания, приведенные в табл. 12.

Система мер профилактики микотоксикозов включает санитарно-микологический анализ пищевых продуктов (рис. 13).

Таблица 12. Допустимые уровни содержания микотоксинов в отдельных группах пищевых продуктов

Кроме того, большое внимание уделяется изысканию способов деконтаминации и детоксикации сырья и пищевых продуктов, загрязнешгых микотоксинами. С этой целью используют механические, физические и химические методы:

1) механические - отделение загрязненного материала вручную или с по­мощью электронно-калориметрических сортировщиков;

2) физические термическая обработка, облучение ультрафиолетовой ра­диацией;

3) химические - обработка растворами окислителей, сильных кислот и ос­нований.

Однако применение механических и физических методов очистки не дает высокого эффекта, химические методы приводят к разрушению не только мико­токсинов, но и полезных нутриентов, а также к нарушению их всасывания.

Рис. 12.Санитарно-микробиологический анализ пищевых продуктов

14.8.1 Методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения и определения содержания микотокси­нов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количествен­ные аналитические и биологические методы.

Скрипипг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения се­рийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и не­загрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослой­ной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и имлгуноферментны-ми методами. В настоящее время наиболее распространенными являются хими­ческие методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количес­твенного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от со­единении с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсалыгым методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющей­ся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характери­зовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и рас­пределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сы­пучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер:

в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошиб­ку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами вес продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднороднос­ти (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотыс зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жид­кости: молоко, растительные масла, соки, шоре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов 1-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (го­могенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих вели­чине среднего образца (100 200 г), при условии, что продукт происходит из од­ной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатокси­нов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфич­ности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т-2 токсин при обработке пластин концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов яв­ляются следующие:

Газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использова­нием УФ-фотомстрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксипов и зеараленона).

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы ВЭЖХ, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку длиной от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специаль­ным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотомеорический детектор является наиболее распространенным ви­дом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектлзофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюен-та протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фото­приемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно ре­гистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуори­метрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет про­точную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов В 1 и М 1 длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны ис­пускаемого излучения - 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуоримет-рического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детекти­рование.

Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.

Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. В настоящее время наиболее распространенными являются химические методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсальным методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).

При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющейся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характеризовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и распределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сыпучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. Например, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер: в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошибку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.

С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами все продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднородности (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотые зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жидкости: молоко, растительные масла, соки, пюре; мука, размолотые шроты).

Для получения представительного среднего образца продуктов l-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (гомогенизированного) среднего образца.

Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.

Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатоксинов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфичности их спектров поглощения и флуоресценции.

В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или, флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. Однако выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. Например, Т -2 токсин при обработке пластин; концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией;) в УФ-свете.

Арбитражными методами количественного определения микотоксинов являются следующие:

Газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием УФ-фотометрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);

ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксинов; и зеараленона).

На рис. 2 представлено устройство современного жидкостного хроматографа в простейшем исполнении.

Подвижная фаза из емкости 1 через входной фильтр 9 подается насосом высокого давления 2 в систему ввода образца 3 - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее через фильтр 8 образец с током подвижной фазы поступает через предколонку в разделительную колонку 4. Затем поток подвижной фазы, выходящий из колонки и содержащий компоненты разделяемой смеси (элюат), поступает в детектор 5 и удаляется в сливную емкость 7. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор 6 или в компьютер.

Устройство жидкостного хроматографа (изократическая система):

1 - емкость; 2 - система высокого давления; 3 - ручной инжектор или автосамплер; 4 - разделительная колонка; 5 - детектор; б - регистратор или компьютер; 7 - сливная емкость; 8 - фильтр; 9 - входной фильтр

Система, приведенная на рис. 2, является изократической: в процессе хроматографирования состав подвижной фазы не изменяется. Если в ходе хроматогфического анализа необходимо изменять концентрацию одного или нескольких компонентов подвижной фазы, то применяют так называемые градиентные системы, состоящие обычно из двух или более насосов. В случае градиентного элюирования каждый растворитель подается из отдельного сосуда в специальную смесительную камеру с магнитной мешалкой, где по определенной программе происходит их смешивание с заданным соотношением объемов.

Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.

Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку ой от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специальным сорбентом на основе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.

УФ-фотометрический детектор является наиболее распространенным видом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектрофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюента протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фотоприемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно регистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (например, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.

Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуориметрический) детектор. Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов B 1 и М 1 длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны испускаемого излучения - 420 нм.

Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуориметрического детектора, поэтому при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детектирование.

ГОСТ 32835-2014

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ

Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)

Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

МКС 67.080.01

Дата введения 2016-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" (ФГБОУ ВПО "МГУПП")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.

5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:

- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары);
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru . - Примечание изготовителя базы данных.


- Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. N 406/2006/ЕС "О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах");

- AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей, за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов - патулина и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0,1 до 100,0 мкг/дм и охратоксина А от 0,1 до 20,0 мкг/дм.

Примечание - Настоящий стандарт рекомендуется применять в целях апробации и накопления дополнительной информации в части его применения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определения относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 1. Общие положения

ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 2. Методы экстракции и очистки

ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 3. Определение и подтверждение результатов

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сокращения

ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-спектрометрия;

ОТА - охратоксин А;

ПАТ - патулин;

ESI - ионизация распылением в электрическом поле (Electrospray Ionization );

IARC - Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний;

LOD - предел детектирования;

LOQ - предел количественного определения;

SRM - идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring ).

4 Сущность метода

Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, перерастворении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда

Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС* с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а.е.м.), с точностью измерения массы не ниже 0,1 а.е.м, ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль ВЭЖХ, состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50°С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм C длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0,1 до 100,0 мкг/дм.
________________
* Дополнительная информация о рекомендуемых ВЭЖХ-МС/МС системах приведена в приложении А.


Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0,1%.

Весы по ГОСТ OIML R 76-1, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг.

Баня ультразвуковая.

Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000-5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 см.

Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000-12000 об/мин для пробирок типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200°С.

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .

Встряхиватель для перемешивания.

Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20-1000 мм с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2,5%.

Микрофильтр - насадка на шприц (регенерированная целлюлоза, диаметр 13 мм, размер пор 0,2-0,4 мкм).

Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.

Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98%.

Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61 , ч.д.а.

Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.

Метанол для градиентной ВЭЖХ.

Магний сернокислый безводный, х.ч.

Кальций хлористый безводный, гранулированный, х.ч.

Хлороформ по ГОСТ 20015 , х.ч.

Толуол по ГОСТ 5789 , х.ч.

Спирт этиловый абсолютированный.

Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 29227 .

Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5, 10, 25, 50, 100 и 1000 см исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770 .

Колбы остродонные вместимостью 10, 25 см.

Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.

Микропробирка вместимостью 100-400 мм.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250 см любого исполнения по ГОСТ 1770 .

Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см

Чашка фарфоровая диаметром 125-150 мм.

Эксикатор лабораторный вместимостью 3 дм.

Воронки лабораторные по ГОСТ 25336 .

Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100, 250 см по ГОСТ 25336 .

Стаканы химические вместимостью 10, 20, 50, 100 и 200 см по ГОСТ 25336 .

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

6 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26313 . Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671 , ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .

7 Подготовка к проведению испытаний

7.1 Общие требования

Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление подвижной фазы А

В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты, 100 см метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.

7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б

В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.

Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].

7.2.3 Приготовление растворителя 1

В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.

7.3 Подготовка сернокислого магния

Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180°С - 200°С в течение 6-10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30°С - 40°С и через 2-3 мин перемешивания реакционной массы.

7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов

7.4.1 Приготовление растворов ПАТ

7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 мкг/см

Берут 2,0 мг чистого кристаллического ПАТ, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в мерной колбе вместимостью 10 см в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.

Срок хранения исходного раствора ПАТ при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 1 мес.

7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 мкг/см

Переносят 1 см полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5,0 см полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 см, затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5,0 см абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.

Массовую концентрацию ПАТ в растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле

где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП;

- молекулярная масса ПАТ, равная 153,1 г/моль;

- коэффициент пересчета;


- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600, м/моль.

7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 мкг/см

5 см исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200 мкг/см (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см, концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.

7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.

Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя -.

7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА

7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 мкг/см

2,0 мг чистого кристаллического ОТА, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в химическом стакане вместимостью 25 см растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.

Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 300 до 370 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.

Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле

где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;

- молекулярная масса ОТА, равная 402,7 г/моль;

- коэффициент пересчета;

- поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А;

- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 544, м/моль.

Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более четырех лет.

7.4.2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 мкг/см

Отбирают 2,5 см исходного раствора ОТА (7.4.2.1), переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.

Срок хранения раствора ОТА при температуре 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.

Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) -.

7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА

Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые аналиты.

7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ

7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 нг/см (раствор n -1)

1 см раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1 см стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100 мкг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.

7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 нг/см (раствор n -2)

1 см раствора -1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.

7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ

Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов n -1 и n -2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.


Таблица 1 - Объемы растворов n -1 и n -2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ

7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА

7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 нг/см (раствор A -1)

1 см раствора ОТА концентрацией 5 мкг/см (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 см.

7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 нг/см (раствор А -2)

0,5 см промежуточного раствора ОТА А -1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят ацетонитрилом раствор до метки.

7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА

Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А -1 и А -2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.


Таблица 2 - Объемы растворов А -1 и А -2 для приготовления градуировочных растворов ОТА

Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.

Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10 мм приготовленных по 7.5.1.3 и 7.5.2.3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.

Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.

7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы

Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.

При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.

При этом должны быть соблюдены следующие условия:

- температура окружающего воздуха от 20°С до 25°С;

- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;

- напряжение в электросети (220±10) В;

- частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;

- относительная влажность воздуха от 40% до 80%.

7.7 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы

Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,999 (для ПАТ) и 0,965 (для ОТА), а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более ±10%.

Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5%.

8 Проведение испытаний

8.1 Экстракция

10 см () предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см. В пробирку добавляют 20 см ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех-пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000-5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5°С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (). 18-19 см () экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 см. Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40°С и немедленно перерастворяют в 1 см () ацетонитрила.

При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех-пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см и центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 3-5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пор 0,2-0,4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100-400 мм. Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10 мм приготовленной пробы.

8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов

Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ 11,2%. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030 .

Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.

8.3 Проведение измерений

8.3.1 Общие условия

Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.

ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа, прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.

Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.

8.3.2 Идентификация микотоксинов

Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микотоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго m/z -перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.

Соотношение пиков для одного микотоксина не должно отличаться более чем на 20% от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.

9 Обработка и оформление результатов испытаний

9.1 Количественное определение

Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.

Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции , мкг/дм, рассчитывают по формуле

где - коэффициент перевода из кубических сантиметров в кубические дециметры;

- концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 мм, инжектированном в ВЭЖХ-МС/МС систему, определенное по градуировочной зависимости, нг;

- объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, см;

- общий объем экстракта, из которого отбирается для концентрирования объем , см;

- объем пробы, введенный в хроматограф (=10 мм), мм;

- объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, см;

- объем экстракта, отобранный для концентрирования, см.

При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.

За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где , - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, мкг/дм;

, , - результаты трех параллельных определений, мкг/дм;

- значение критического диапазона, %.

Расхождение между тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) , равного 3,6· при вероятности =0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.

Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 .

9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.

10 Метрологические характеристики

Метрологические характеристики метода для ПАТ и ОТА соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.


Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС

Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD - 0,03 мкг/дм, LOQ - 0,1 мкг/дм.

11 Контроль качества результатов измерений

Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
ГОСТ 12.1.007 .

ВНИМАНИЕ! При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным нефротоксическим, иммунотоксическим, тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации IARC ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду, в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.

Приложение А (обязательное). Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента CF для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах

Приложение А
(обязательное)

Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах

А.1 Для определения массовых концентраций микотоксинов в исходных растворах (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) используют спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности растворов в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см в интервале длин волн от 200 до 400 нм.

Калибровку спектрофотометра проводят следующим образом.

Измеряют оптическую плотность трех растворов дихромата калия (KCrO) в серной кислоте (HSO) - 0,25; 0,125 и 0,0625 ммоль/дм в максимальной точке поглощения (длина волны около 350 нм), используя в качестве контроля раствор серной кислоты (HSO) концентрации 0,009 ммоль/дм.

Затем рассчитывают значение молярного коэффициента оптической плотности , м/моль, для каждой концентрации дихромата калия по формуле

где - измеренное значение оптической плотности раствора дихромата калия в серной кислоте для соответствующей концентрации, ед. ОП;

- концентрация раствора дихромата калия в серной кислоте, ммоль/дм.

Если разница между тремя полученными значениями выходит за пределы гарантированного интервала точности измерений оптической плотности , то необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование. Рассчитывают среднеарифметическое значение .

Определяют поправочный коэффициент (безразмерная величина) для конкретного оборудования (спектрофотометра и кювет) по формуле

где - характерное значение молярного коэффициента оптической плотности для растворов дихромата калия (KCrO), м/моль;

- молярный коэффициент оптической плотности, рассчитанный по формуле (А.1), м/моль.

Если полученное значение поправочного коэффициента менее 0,95 или более 1,05, то для устранения отклонений необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование (для калибровки и проверки чистоты используют один и тот же набор кювет) -.

Приложение Б (справочное). Примеры ВЭЖХ-МС/МС систем для определения микотоксинов в соках и другой соковой продукции*

Приложение Б
(справочное)

________________
* Данные примеры являются рекомендуемыми и приведены для удобства пользователей настоящего стандарта.

Б.1 ВЭЖХ-МС/МС система N 1

Аппаратная платформа: Varian 320-MS LC/MS/MS.

Ионный