Методы микроскопии. Методы микроскопирования

В зависимости от свойств объекта свет изменяет свои физические свойства - цвет (длину волны), яркость (амплитуду волны), фазу, используются в современных микроскопах для создания контраста.

Рис. 1. Микроскоп МБИ-3: 1 - ножка, или башмак; 2 - барашки грубого движения тубуса; 3 - тубусодержатель; 4 - окуляры; 5 - бинокулярная насадка; 6 - головка для крепления револьвера с посадочным гнездом для смены тубусов; 7 - винт крепления бинокулярной насадки; 8 - револьвер на салазках; 9 - объективы; 10 - предметный столик; 11 - барашек продольного движения препаратодержателя; 12 - барашек поперечного движения препаратодержателя; 13 - апланатический конденсор прямого и косого освещения; 14 - центрировочные винты столика; 15 - головка винта, фиксирующего верхнюю часть предметного столика; 16 - кронштейн конденсора; 17 - барашек микромеханизма; 18 - зеркало; 19 - коробка с микромеханизмом.

Наиболее легко поддаются окрашиванию фиксированные, убитые препараты. Такие неподвижные препараты могут быть с высокой точностью рассмотрены и сфотографированы через микроскоп, но они не дают возможности оценить различные формы жизнедеятельности микроскопируемого объекта (движение, слияние, фагоцитоз и пр.). Известны красители, которые связываются с живыми клетками, не нарушая их жизнедеятельности.

Витальная (прижизненная) микроскопия показывает, что многие структуры живой клетки сравнительно мало изменяются при умелой фиксации и последующем окрашивании. Этим подтверждается высокая научная ценность информации, получаемой при помощи микроскопии окрашенных объектов. Витальная микроскопия возможна и без окрашивания, если в обычный микроскоп ввести так называемый темнопольный конденсор. Он освещает объект так, что в глаз наблюдателя попадают только те лучи, которые рассеялись на частицах объекта и тем самым изменили направление своего распространения. Лучи, прошедшие через фон без рассеяния, в глаз не попадают. Поэтому частицы объекта светятся и ярко выделяются на темном фоне (темном поле). Частицы объекта хорошо видны, даже если их размеры меньше разрешаемого расстояния.

Темнопольная микроскопия обеспечивает наибольший возможный контраст изображения, но четкость его и полезное увеличение заметно ниже, чем при обычной микроскопии. Темнопольная микроскопия успешно применялась для изучения спирохет, лептоспир и других слабо окрашиваемых микроорганизмов. При работе с гистологическими препаратами она неприменима.

Технически самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии является ультрамикроскопия , при которой мельчайшие изучаемые частицы освещаются мощным боковым пучком света и видны точками на черном фоне. Ультрамикроскопия позволяет подсчитывать частицы, оценивать их размеры и другие свойства. Применяется для изучения коллоидных растворов, аэрозолей, суспензий.

В последние годы темнопольная микроскопия применяется все реже, так как появились два новых типа контрастирующих приборов со значительно лучшими характеристиками - фазово-контрастный (рис. 2, а и б) и амплитудно-контрастный микроскопы. Технически они сходны, но в них используют различные изменения светового луча в объекте. Луч, прошедший через фон образца, в идеальном случае не претерпевает никаких изменений. Он проходит через точно определенные участки объектива. Луч, прошедший через объект, подвергается дифракции, т. е. распадается на пучки убывающей интенсивности, которые выходят из объекта под разными углами. Другие свойства луча (амплитуда, длина волны, фаза) изменяются в различных степенях в зависимости от особенностей объекта.

Рис. 2. Микроскоп МБИ-3 (а) с фазово-контрастным устройством КФ-1 (б): 1 - конденсор револьверной системы; г - набор объективов и кольцевых диафрагм; 3 - вспомогательный микроскоп.

Почти все живые микроскопические объекты выглядят в обычном микроскопе едва заметными, прозрачными, потому что они почти не изменяют ни амплитуды, ни цвета прошедшего через них луча.

Они изменяют только фазу его волны, но это изменение не улавливается ни глазом, ни фотопластинкой. Пучок лучей, дифрагированных объектом и сдвинутых им по фазе, проходит через те участки объектива, где не могут пройти прямые, недифрагированные лучи фона. Практически нетрудно определить, где именно пройдут эти лучи. Если накрыть этот участок одной из линз объектива полупрозрачной пластинкой, способной изменить фазу, интенсивность, цвет или все эти три свойства вместе, то изображение фона изменит свою фазу, уменьшится его яркость или преобразится цвет. Лучи, прошедшие через объект и отклоненные (дифрагированные) им, обойдут вложенную в объектив пластинку и, следовательно, не приобретут тех свойств, которые приобрели, пройдя через пластинку, лучи фона. В результате разница между лучами фона и объекта возрастет. Если разница фаз между лучами фона и объекта достигает 1/4 длины волны, то в конечном изображении возникает заметный для глаза и фотопластинки контраст: темный объект на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры пластинки, которую в этом случае называют «фазовой». Если же пластинка изменяет главным образом яркость и цвет фона, то такой микроскоп следует назвать амплитудно-контрастным (большое распространение получило более короткое, хотя и не совсем правильное название «аноптральный»). Таким образом, разница между фазово-контрастным и амплитудно-контрастным микроскопом определяется свойствами пластинки в объективе, изменяющей свойства недифрагированных лучей фона. Изображения, построенные этими микроскопами, значительно ярче и богаче деталями (рис. 3 и 4), чем темнопольные картины.

Рис. 3. Культура многоклеточной бактерии Caryophanon latum Peshkoff. Амплитудно-контрастная микроскопия.
Рис. 4. Микроколонии Вас. megatherium, зараженной фагом. Амплитудно-контрастная микроскопия.

С появлением фазово- и амплитудно-контрастных микроскопов витальная микроскопия получила прекрасную технико-методическую базу, возможности которой близки к предельным для световой оптики. Никакой фиксации или окраски объекта эти приборы не требуют. Современная витальная микроскопия чрезвычайно расширила наши знания о поведении и динамике живых микрообъектов в естественных и лабораторных условиях обитания и эксперимента. Ускоренная (рапид) и замедленная (цейтрафферная) микрокиносъемка сделали доступными для исследования процессы, скорость течения которых слишком велика или слишком мала для визуального наблюдения.

Выпускаемые промышленностью фазово-контрастные и амплитудно-контрастные (аноптральные) устройства недороги, легко монтируются на серийных микроскопах; использование их не представляет затруднений. Эти приборы, несомненно, будут находить все новые области применения как в научных исследованиях, так и в медицинской практике.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны. Это позволяет наглядно демонстрировать и изучать, в том числе количественно, распределение веществ в живых клетках или фиксированных препаратах. Так, например, белки и нуклеиновые кислоты одинаково прозрачны для видимого света; рассматривая неокрашенную клетку в видимом свете, нельзя определить, где расположен белок или нуклеиновая кислота. Но ультрафиолетовые лучи определенной длины нуклеиновая кислота поглощает значительно сильнее, чем белок. Поэтому в ультрафиолетовом микроскопе участок, содержащий нуклеиновую кислоту, выглядит значительно темнее. Так как ультрафиолетовые лучи непосредственно глазом не воспринимаются, приходится применять специальные преобразователи света. Ультрафиолетовая микроскопия технически значительно сложнее обычной световой, ее аппаратура дороже и методика тоньше. Несмотря на это, применение ее оправдано, так как научная значимость быстрого топографического описания химического состава живой клетки весьма велика.

Гораздо более доступна и перспективна люминесцентная микроскопия (см.), широко применяемая ныне в научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораториях. При этом живой объект обрабатывают специальными красителями, которые, будучи освещены синим, фиолетовым или ультрафиолетовым светом, начинают светиться, излучая более длинные волны (зеленые, желтые). Цвет возбужденного вторичного свечения зависит от химических свойств объекта и введенного в него красителя.

Поляризационная микроскопия основана на изменении плоскости колебаний световой волны после прохождения через кристаллы. В практической медицине не применяется.

Современная микроскопия требует применения разнообразной вспомогательной аппаратуры. Нагревательные столики и термостаты позволяют выдерживать и наблюдать объект длительное время при заданной температуре. Для длительного выращивания микробов или тканевых культур в поле зрения сильного объектива служат разнообразные микрокамеры. Окулярные и объективные микрометры делают возможными точные измерения микрообъектов. Промышленность выпускает микроманипуляторы (см.) для операций на микрообъектах. Для получения стереоскопического изображения при увеличениях до 100 раз предназначены бинокулярные лупы (см.) и стереомикроскопы (рис. 5). Широко производится и используется аппаратура для микрофотографии и микрокиносъемки (рис. 6). См. также Микроскопическая техника.

Рис. 5. Стереоскопический микроскоп МБС-1.

Рис. 6. Микрокиноустановка МКУ-1.

В данной статье мы ознакомимся широко развитой методикой исследования разнообразных микроэлементов нашего мира - микроскопией. Здесь мы рассмотрим описание микроскопа, его предназначение, устройство, правила работы и исторические факты.

Ознакомление с приборами микроскопии

Микроскоп - это механизм, предназначение которого заключается в получении увеличенного изображения какого-либо объекта, а также в измерении структурных деталей, которых невозможно наблюдать невооруженным глазом.

Изобретение и создание разнообразных видов микроскопов позволило создать микроскопию - технологический метод практической эксплуатации этих приборов.

Исторические сведения

Кем был создан первый микроскоп в истории человечества, определить довольно проблематично. Впервые такой механизм был изобретен на рубеже шестнадцатого и семнадцатого веков. Вероятным изобретателем считают Захария Янсена, голландского ученого.

Будучи еще ребенком, Янсен используя дюймовую трубочку, установил на двух ее краях по одной выпуклой линзе. Увиденное заставило изобретателя создать нечто новое и улучшить его. Возможно, это обусловило изобретение первого в мире микроскопа, что произошло приблизительно в 1590 году.

Однако еще в 1538 г. итальянец Дж. Фракасторо, работая врачом, выдвинул предположение о комбинировании двух линз с целью создания еще большего увеличения изображений. Следовательно, его работа могла стать началом для появления первого микроскопа. Хотя термин был введен гораздо позже.

Другим первооткрывателем считается Галилео Галилей. Услышав приблизительно в 1609 г. о появлении такого увеличительного устройства и разобравшись в общей идее его механизма, уже в 1612 г. итальянский физик создал собственное массовое изготовление микроскопов. Название этому прибору дал академический друг Галилея, Джованни Фабер в 1613.

Уже в шестидесятых годах XVII века были получены данные о применении микроскопа в научной исследовательской деятельности. Первый это сделал Роберт Гук, занимавшийся наблюдением за устройством разнообразных растений. Именно он в работе «микрография» сделал зарисовки увиденного в микроскоп изображения. Он установил, что растительные организмы строятся из клеток.

Разрешающие способности

Одним из параметров микроскопа является его разрешающая способность. Различные виды микроскопов имеют, соответственно, разный показатель этой характеристики. Так что же это такое?

Разрешающая способность - это возможности прибора показывать четкое и качественное изображение, картинку двух расположенных рядом, фрагментов исследуемого объекта. Показатель степени углубления в микромир и общая возможность его исследования базируются именно на этой способности. Данную характеристику определяет длина волны излучения, которую используют в микроскопе. Главным ограничением является невозможность получения картинки объекта, размеры которого меньше размера длины излучения.

Ввиду написанного выше становится очевидно, что благодаря разрешающей способности мы можем получать четкое изображение деталей изучаемого объекта.

Основные параметры

К другим важным параметрам в строении микроскопа относятся его увеличение, насадки, размер предметного столика, возможности подсветки, оптическое покрытие и т. д.

Рассмотрим главный из перечисленных в этом пункте показателей - увеличение.

Увеличение - это общая способность микроскопа показывать изучаемые объекты в больших размерах, чем они есть на самом деле. Вычисление этого параметра можно произвести путем умножения объективного увеличения на окулярное. Данная возможность в оптических микроскопах доходит до 2000 крат, а электронный имеет увеличение в сотни раз больше, чем световой.

Основная характеристика микроскопа - это именно его разрешающая способность, а также увеличение. Поэтому при выборе такого прибора на эти показатели необходимо обратить особое внимание.

Составные элементы

Микроскоп, как и любой другой механизм, состоит из определенных деталей, среди которых выделяют:

предметный столик;
рукоятку переключения;
окуляр;
тубус;
держатель для тубуса;
микрометренный винт;
винт грубой наводки;
зеркальце;
подставку;
объектив;
стойку;
бинокулярную насадку;
оптическую головку;
конденсор;
светофильтр;
ирисовую диафрагму.

Ознакомимся с основными характеристиками образующих структур микроскопа.

Объектив - является средством определения полезного увеличения. Образуется из определенного количества линз. Увеличительные возможности указываются цифрами на его поверхности.

Окуляр - состоящий из двух-трех линз элемент микроскопа, увеличение которого обозначается на нем цифрам. Общий показатель увеличительных способностей прибора определяется путем перемножения показателя увеличения объектива на увеличение окуляра.

Осветительные устройства включают в себя зеркальце или электроосветитель, конденсор и диафрагмой, светофильтр и столик.

Механическая система образуется подставкой, коробочкой с микрометренным механизмом и винтом, тубусодержателем, винтом грубой наводки, конденсором, винтом перемещения конденсора, револьвером и предметным столиком.

Оптическая микроскопия

Среди существующих видов микроскопов выделяют несколько основных групп, характеризующихся определенными особенностями устройства и предназначения.

Глаз человека - это своего рода естественная оптическая система с определенными параметрами, например, разрешением. Разрешение, в свою очередь, характеризуется наименьшим показателем разности в расстоянии между составными компонентами объекта, за которым наблюдают. Важнейшим пунктом здесь является наличие визуального отличия между наблюдаемыми фрагментами. Ввиду того, человеческий глаз не в силах наблюдать естественным путем за микроорганизмами, как раз и были созданы подобные увеличительные приборы.

Оптические микроскопы позволяли работать с излучением, лежащем в диапазоне от 400 до 700 нм и с ближним ультрафиолетом. Это длилось до середины двадцатого века. Подобные приборы не позволяли получать разрешающую способность меньшую, чем полупериод волны излучения опорного типа. Вследствие этого микроскоп позволял наблюдать за структурами, расстояние между которыми было около 0.20 мкм, из чего следует, что максимальное увеличение могло достигать 2000 крат.

Микроскопы бинокулярного типа

Бинокулярный микроскоп - это устройство, при помощи которого можно получить объемное увеличенное изображение. Другое название таких приборов - стереомикроскопы. Они позволяют человеку четко различать детали исследуемых объемных объектов.

В бинокулярном микроскопе рассмотрение объекта происходит сквозь две линзы, независимые между собой. В настоящее время используются сразу 2 окуляра и 1 объектов. Отлично работают в условиях наличия проходящего и отраженного света.

Электронная микроскопия

Появление электронного микроскопа позволило использовать электроны, обладающие свойствами и частиц, и волн в микроскопии.

Электрон обладает длинной волны, которая зависит от его энергетического потенциала: E = Ve, где V - величина разности потенциалов, e - электронный заряд. Длина волны электрона при пролете разности в потенциалах равной 200000 В составит около 0,1 нм. Электрон легко фокусируется при помощи электромагнитных линз, что обуславливается его зарядом. После электронную версию изображения переводят в видимую.

Среди таких увеличительных устройств набрал широкую известность цифровой микроскоп. Он позволяет подключать адаптеры к аппарату с целью переноса изображения на компьютер и его сохранения. При работе с подобными устройствами камера регистрирует наблюдаемое изображение, далее переносит его на ПК при помощи USB-кабеля.

Цифровой микроскоп может классифицироваться в соответствии с его режимом работы, увеличительной кратности, числу подсветок и разрешению камеры. Их главными достоинствами считаются наличие возможности переносить изображение на ПК и сохранять его, возможность в пересылке полученной информации на большие расстояния, редактирование, детальный анализ и хранение результатов исследования, а также умение проецировать картинку при помощи проекторов.

Электронные микроскопы обладают разрешающей способностью превосходящей световые в 1000-10000 раз.

Сканирующие зонды

Другой вид микроскопа - это сканирующий зонд. Сравнительно новая ветвь в развитии таких приборов.

Сокращенно их называют - ЗСМ. Изображение воспроизводится благодаря регистрации взаимодействия зонда и поверхности, которую он исследует. В современном мире такие механизмы позволяют наблюдать за взаимодействием зонда с атомами. Разрешающая способность ЗСМ сопоставима с микроскопами электронного типа, а в некоторых параметрах даже лучше.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновский микроскоп был создан для наблюдением за чрезвычайно малыми объектами, величина которых сопоставима с рентгеновскими волнами. Базируется на эксплуатации излучения электромагнитного характера, в котором длина волны не превышает один нанометр.

Разрешающая способность таких микроскопов заняла промежуточное место между оптическими и электронными. Теоретическая р.с. такого устройства может достигать 2-20 нм, что гораздо больше возможностей оптических микроскопов.

Общие сведения для работы с микроскопом

Эксплуатируя данный прибор необходимо знать правила работы с микроскопом:

Работу необходимо выполнять сидя.
Следует осмотреть прибор и протереть от пыли мягкими салфетками зеркальце, объектив и окуляр.
При работе с микроскопом нежелательно его передвигать, поставить слева от себя.
Произвести открытие диафрагмы, привести конденсор к верхнему положению.
Работу стоит начинать с малого увеличения.
Объектив довести до одного сантиметра от стекла с наблюдаемым объектом.
Равномерно распределить освещение поля зрения, используя окуляр, в который необходимо смотреть глазом, и вогнутое зеркало.
Переместить микропрепарат на столик микроскопа. Наблюдая сбоку, опустить объектив до уровня 4-5 мм над исследуемым объектом, используя для этого макровинт.
Глядя глазом в окуляр, производить вращательные движения грубого винта, для подведения объектива к положению, в котором будет четко видно изображение.
Перемещая стекло с препаратом, найдите место, где исследуемый объект будет располагаться по центру вашего поля зрения в микроскопе.
В случае отсутствия изображения, повторите с шестого по девятый пункты.
Используя микрометренный винт, добейтесь необходимой четкости изображения. Обратит внимание на то, не выходит ли точка между рисками на микрометренном механизме, за пределы рисок. Если выходит, то верните ее в стандартное положение.
Заключаем правила работы с микроскопом, уборкой рабочего места. Необходимо вернуть увеличение с большого на малое, произвести поднятие объектива, снять препарат и протереть микроскоп, далее накрыть полиэтиленом и вернуть в шкафчик.

Данные правила в большей мере относятся к оптическим микроскопам. Строение микроскопа, например, электронного или рентгеновского, отличается от светового, а потому основные правила работы могут также отличаться. Особенности работы с такими устройствами можно найти в инструкции к ним.

Микроскопические методы исследования представляют собой способы изучения разнообразных объектов с использованием специального оборудования. Оно позволяет рассматривать строение веществ и организмов, величина которых находится за границами разрешающей способности человеческого взгляда. В статье проведем краткий анализ микроскопических методов исследования.

Общие сведения

Современные методы микроскопического исследования используют в своей практике разные специалисты. Среди них вирусологи, цитологи, гематологи, морфологи и прочие. Основные методы известны достаточно давно. В первую очередь это световой способ рассмотрения объектов. В течение последних лет активно вводятся в практику и другие технологии. Так, популярность приобрели фазово-контрастный, люминесцентный, интерференционный, поляризационный, инфракрасный, ультрафиолетовый, стереоскопический метод исследования . Все они базируются на разнообразных свойствах света. Кроме этого, широко используются электронно-микроскопические методы исследования . Эти способы позволяют отобразить объекты с помощью направленного потока заряженных частиц. Стоит отметить, что такие приемы изучения применяются не только в биологии и медицине. Достаточно популярен в промышленности. Такое изучение позволяет оценивать поведение соединений, вырабатывать технологии для минимизации вероятности разрушения и усиления прочности.

Световые способы: характеристика

Такие микроскопические методы исследования микроорганизмов и других объектов базируются на различной оборудования. Немаловажными факторами при этом является направленность луча, особенности самого объекта. Последний, в частности, может быть прозрачным или непрозрачным. В соответствии со свойствами объекта, меняются физические свойства светового потока - яркость и цвет, обусловленные амплитудой и длиной волны, плоскость, фаза и направленность распространения волны. На использовании этих характеристик и строятся разные .

Специфика

Для изучения световыми способами объекты, как правило, окрашивают. Это позволяет выявить и описать те или иные их свойства. При этом необходимо, чтобы ткани были фиксированными, поскольку окраска выявит определенные структуры исключительно в убитых клетках. В живых элементах краситель обосабливается в виде вакуоли в цитоплазме. Она не прокрашивает структуры. Но с помощью светового микроскопа можно исследовать и живые объекты. Для этого используется витальный способ изучения. В таких случаях применяется темнопольный конденсор. Он встраивается в световой микроскоп.

Изучение неокрашенных объектов

Оно осуществляется с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот способ базируется на дифракции луча в соответствии с особенностями объекта. В процессе воздействия отмечается изменение фазы и длины волны. В объективе микроскопа присутствует полупрозрачная пластинка. Живые или фиксированные, но не окрашенные объекты из-за своей прозрачности почти не изменяют цвет и амплитуду луча, проходящего сквозь них, провоцируя только сдвиг волновой фазы. Но при этом, пройдя через объект, световой поток отклоняется от пластинки. В итоге между лучами, пропущенными сквозь объект, и входящими в световой фон, появляется разность волновой длины. При определенном ее значении возникает визуальный эффект - темный объект будет четко виден на светлом фоне либо наоборот (в соответствии с особенностями фазовой пластинки). Для его получения разность должна составлять не меньше 1/4 длины волны.

Аноптральный способ

Интерференционные приемы

Эти решают в целом те же задачи, что и фазово-контрастные. Однако в последнем случае специалисты могут наблюдать только контуры объектов. Интерференционные микроскопические методы исследования позволяют изучать их части, выполнять количественную оценку элементов. Это возможно благодаря раздвоению светового луча. Один поток проходит сквозь частицу объекта, а другой - мимо. В окуляре микроскопа они сходятся и интерферируют. Возникающая разность фаз может определяться по массе разных клеточных структур. При последовательном ее измерении с заданными можно установить толщину нефиксированных тканей и живых объектов, содержание белков в них, концентрацию сухого вещества и воды и пр. В соответствии с полученными данными специалисты получают возможность косвенно оценивать проницаемость мембран, активность ферментов, клеточный метаболизм.

Поляризация

Она осуществляется с помощью призм Николя или пленчатых поляроидов. Их помещают между препаратом и источником света. Поляризационный микроскопический метод исследования в микробиологии позволяет изучать объекты с неоднородными свойствами. В изотропных структурах быстрота распространения света не зависит от выбранной плоскости. При этом в анизотропных системах скорость изменяется в соответствии с направленностью света по поперечной либо продольной оси объекта. В случае если величина преломления вдоль структуры будет больше, чем вдоль поперечной, создается двойное положительное лучепреломление. Это свойственно многим биологическим объектам, у которых обнаруживается строгая молекулярная ориентация. Они все являются анизотропными. К этой категории, в частности, относятся миофибриллы, нейрофибриллы, реснички в мерцательном эпителии, коллагеновые волокна и прочие.

Значение поляризации

Сравнение характера лучевого преломления и показателя анизотропии объекта дает возможность оценивать молекулярную организацию структуры. Поляризационный метод выступает как один из гистологических способов анализа, используется в цитологии и пр. В свете можно изучать не только окрашенные объекты. Поляризационный метод дает возможность исследовать неокрашенные и нефиксированные - нативные - препараты тканевых срезов.

Люминесцентные приемы

Они базируются на свойствах некоторых объектов давать свечение в сине-фиолетовом участке спектра или в УФ-лучах. Многие вещества, например белки, некоторые витамины, коферменты, лекарственные средства, наделены первичной (собственной) люминесценцией. Другие объекты начинают светиться при добавлении флюорохромов - специальных красителей. Эти добавки избирательно или диффузно распространяются на отдельные клеточные структуры или химические соединения. Это свойство легло в основу использования люминесцентной микроскопии при гистохимических и

Области использования

Применяя иммуно-флуоресценцию, специалисты обнаруживают вирусные антигены и устанавливают их концентрацию, идентифицируют вирусы, анти тела и антигены, гормоны, разнообразные продукты метаболизма и так далее. В этой связи при диагностике герпеса, эпидемического паротита, вирусного гепатита, гриппа и прочих инфекций используются люминесцентные методы исследования материалов. Микроскопический иммуно-флуоресцентный способ позволяет распознавать опухоли злокачественного характера, определять ишемические участки в сердце на ранних этапах инфаркта и пр.

Использование ультрафиолета

Оно основывается на способности ряда веществ, включенных в живые клетки, микроорганизмы или фиксированные, но неокрашенные, прозрачные при видимом свете ткани поглощать УФ-лучи определенной длины волн. Это характерно, в частности, для высокомолекулярных соединений. К ним относят белки, ароматические кислоты (метилаланин, триптофан, тирозин и пр.), нуклеиновые кислоты, пирамидиновые и пуриновые основания и так далее. Ультрафиолетовая микроскопия позволяет уточнить локализацию и количество этих соединений. При изучении живых объектов специалисты могут наблюдать изменения процессов их жизнедеятельности.

Дополнительно

Инфракрасная микроскопия используется при исследовании непрозрачных для света и УФ-лучей объектов посредством поглощения их структурами потока, длина волны которого 750-1200 нм. Чтобы применить этот способ нет необходимости предварительно подвергать препараты химической обработке. Как правило, инфракрасный метод используется в антропологии, зоологии и прочих биологических отраслях. Что касается медицины, то этот способ применяют преимущественно в офтальмологии и нейроморфологии. Изучение объемных объектов осуществляется с помощью стереоскопической микроскопии. Конструкция оборудования позволяет выполнять наблюдение левым и правым глазом под различным углом. Непрозрачные объекты исследуются при сравнительно небольшом увеличении (не более 120 раз). Стереоскопические способы используются в микрохирургии, патоморфологии, в судебной медицине.

Электронная микроскопия

Она используется для изучения структуры клеток и тканей на макромолекулярном и субклеточном уровнях. позволила сделать качественный скачок в сфере исследований. Этот способ широко применяется в биохимии, онкологии, вирусологии, морфологии, иммунологии, генетике и прочих отраслях. Значительное усиление разрешающей способности оборудования обеспечивается потоком электронов, которые проходят в вакууме сквозь электромагнитные поля. Последние, в свою очередь, создаются специальными линзами. Электроны обладают способностью проходить сквозь структуры объекта либо отражаться от них с отклонениями под разными углами. В результате создается отображение на люминесцентном экране прибора. При просвечивающей микроскопии получается плоскостное изображение, при сканирующей, соответственно, объемное.

Необходимые условия

Стоит отметить, что перед тем, как пройти электронное микроскопическое исследование, объект подвергается специальной подготовке. В частности, используется физическая либо химическая фиксация тканей и организмов. Секционный и биопсийный материал, кроме этого, обезвоживают, внедряют в эпоксидные смолы, разрезают алмазными или стеклянными ножами на ультратонкие срезы. Затем их контрастируют и изучают. В сканирующем микроскопе исследуются поверхности объектов. Для этого на них напыляют специальные вещества в вакуумной камере.

Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием

Микроскопические методы исследования

способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная . В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности Микроскоп а имеет и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости свойств объекта изменяются физические свойства света - его и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный , который встраивают в .

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный . Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования (Гистологические методы исследования), способом микробиологической диагностики (Микробиологическая диагностика), находит применение в цитологических исследованиях (Цитологическое исследование) и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые , коферменты, некоторые и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная ). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные и их концентрацию в клетках, идентифицируют , определяют антигены и , гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как , эпидемический , вирусный , грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают , такие как , белки, ароматические кислоты ( , триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии (Микрохирургия), в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4 ), при сканирующей - объемное (рис. 5 ). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования (Иммунологические методы исследования), позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30-50 нм . Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также Микроскоп .

Рис. 5. Электронограмма лейкоцита и фагоцитируемой им бактерии, полученная при сканирующей электронной микроскопии; ×20000.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Микроскопи́ческая те́хника

Смотреть что такое "Микроскопические методы исследования" в других словарях:

Микроскопические методы исследования - исследование объектов экспертизы с помощью микроскопа. В экспертной практике применяются исследования в проходящем свете, в падающем свете (по методам светлого и темного полей), в поляризованном свете, по методу фазового контраста,… … Криминалистическая энциклопедия

МЕТОДЫ ВРАЧЕБНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ - І. Общие принципы врачебного исследования. Рост и углубление наших знаний, все большее, и большее техническое оснащение клиники, основанное на использовании новейших достижений физики, химии и техники, связанное с этим усложнение методов… … Большая медицинская энциклопедия

Археологи по существу подобны детективам, занятым воссозданием и постижением жизни людей прошлых эпох; поэтому неудивительно, что для извлечения информации из материальных следов, оставленных древними людьми, они используют самые разнообразные… … Энциклопедия Кольера

I Обследование больного Обследование больного комплекс исследований, направленных на выявление индивидуальных особенностей больного, установление диагноза болезни, обоснование рационального лечения, определение прогноза. Объем исследований при О … Медицинская энциклопедия

I Кость (os) орган опорно двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Совокупность К., связанных (прерывно или непрерывно) соединительной тканью, хрящом или костной тканью, образует Скелет. Общее количество К. скелета… … Медицинская энциклопедия

Основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями… … Медицинская энциклопедия