Fluorescentna in situ hibridizacija. Fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH)

V nekaterih primerih citogenetska študija ni dovolj za sklepanje o kariotipu; v teh primerih se uporabijo molekularne citogenetske metode, zlasti fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH).

Pojav novih tehnologij molekularne citogenetike, ki temelji predvsem na in situ hibridizaciji nukleinskih kislin, je bistveno razširil možnosti kromosomske diagnostike. Metoda hibridizacije in situ je bila razvita za lokalizacijo specifičnih zaporedij DNA neposredno na citoloških preparatih. Pri identifikaciji kromosomov in kromosomskih regij je prišlo do prehoda od analize citološke organizacije kromosoma do analize zaporedij DNK, ki so vključene v njihovo sestavo. Primerjava učinkovitosti klasičnih citoloških metod za odkrivanje in analizo kromosomskih preureditev, kot je diferencialno barvanje kromosomov, s sodobnimi molekularno citogenetskimi tehnologijami je pokazala, da pri hematoloških obolenjih citološka analiza kromosomov odkrije in pravilno identificira le približno tretjino kromosomskih celic. preureditve, odkrite s spektralnim kariotipiziranjem (SKY) . Približno tretjina preureditev je s citološkimi metodami napačno ugotovljena, tretjina pa ostane popolnoma neopažena. Klasične metode citogenetske analize lahko odkrijejo le približno 15 % kromosomskih preureditev, ugotovljenih s pomočjo SKY.

Metoda FISH uporablja fluorescentne molekule za barvanje genov ali kromosomov in vivo. Metoda se uporablja za gensko kartiranje in identifikacijo kromosomskih aberacij.

Tehnika se začne s pripravo kratkih zaporedij DNK, imenovanih sonde, ki so komplementarne zaporedjem DNK, ki predstavljajo ciljno tarčo. Sonde se hibridizirajo (vežejo) na komplementarne regije DNK in zaradi dejstva, da so označene s fluorescentno oznako, omogočajo ogled lokalizacije genov, ki nas zanimajo, znotraj DNK ali kromosomov. Za razliko od drugih metod za proučevanje kromosomov, ki zahtevajo aktivno celično delitev, lahko FISH izvajamo na celicah, ki se ne delijo, kar daje metodi fleksibilnost.

FISH je mogoče uporabiti za različne namene z uporabo treh različnih vrst sond:

* lokusno specifične sonde, ki se vežejo na določene kromosomske regije. Te sonde se uporabljajo za identifikacijo obstoječega kratkega zaporedja izolirane DNA, ki se uporablja za pripravo označene sonde in njeno kasnejšo hibridizacijo z nizom kromosomov;
*alfoidne ali centromerne ponavljajoče se sonde so ponavljajoče se sekvence centromernih regij kromosomov. Z njihovo pomočjo lahko vsak kromosom pobarvate v drugo barvo, kar vam omogoča hitro določanje števila kromosomov in odstopanj od njihovega običajnega števila;
* sonde za celoten kromosom so niz majhnih sond, ki so komplementarne posameznim odsekom kromosoma, vendar na splošno pokrivajo njegovo celotno dolžino. Z uporabo knjižnice takih sond je mogoče "obarvati" celoten kromosom in pridobiti diferencialni spektralni kariotip posameznika. Ta vrsta analize se uporablja za analizo kromosomskih aberacij, kot so translokacije, ko se del enega kromosoma prenese na krak drugega.

Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)

Material za študijo je kri, kostni mozeg, biopsija tumorja, placenta, fetalno tkivo ali amnijska tekočina. Vzorce za testiranje je treba dostaviti v laboratorij sveže. Predmetna stekelca se pripravijo neposredno iz vzorcev tkiva ali po tem, ko so bila gojena. Uporabimo lahko tako metafazne kot interfazne celične pripravke. Specifične sonde DNA, označene s fluorescentnimi oznakami, se hibridizirajo s kromosomsko DNA, hkrati pa je mogoče uporabiti več sond za različne lokuse.

FISH je uporabna in občutljiva citogenetska analizna metoda za odkrivanje kvantitativnih in kvalitativnih kromosomskih aberacij, kot so delecije (vključno z mikrodelecijami), translokacije, podvajanja in anevploidije. FISH na interfaznih kromosomih je hitra metoda za prenatalno diagnozo trisomij 21, 18 ali 13 ali aberacij spolnih kromosomov. V onkologiji lahko FISH zazna številne translokacije (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), povezane s hematološkimi malignostmi. Metodo je mogoče uporabiti tudi za spremljanje ostankov raka po kemoterapiji in presaditvi kostnega mozga ter identifikacijo nadreguliranih onkogenov (c-myc/n-myc), povezanih s slabo prognozo pri nekaterih tumorjih. FISH se uporablja tudi za spremljanje preživetja alotransplantata kostnega mozga, pridobljenega od posameznika nasprotnega spola.

FISH je občutljiva metoda za prepoznavanje kromosomskih aberacij in za hitro enkratno analizo velikega (> 500) števila celic. Metoda je zelo natančna pri prepoznavanju narave kromosomov in neznanih fragmentov kromosomske DNA.

Tradicionalna citogenetika pri proučevanju kariotipa je bil vedno omejen na raven pasovne ločljivosti. Tudi pri uporabi metod visoke ločljivosti za diferencialno barvanje kromosomov smo zaznavali le več trakov na kromosomu, vendar nismo bili prepričani, da smo dosegli molekularno raven ločljivosti. Nedavni napredek v tehnologiji DNK in citogenetike je omogočil uporabo metod FISH za analizo sprememb v kromosomski DNK na molekularni ravni. Molekularna citogenetika je poskrbela za revolucionaren preboj v citogenetiki in omogočila:

Analizirajte strukturo DNK kromosomov v območju 10-100 kilobaz;
diagnosticirati nedeljive interfazne celice, kar je imelo velik vpliv na prenatalno diagnozo in predimplantacijsko genetsko diagnozo (PGD).

FISH tehnologija uporablja sondo DNA, ki veže ali seži specifične sekvence DNA znotraj kromosoma. Denaturirana sonda se inkubira z nativno DNA celice, prav tako denaturirano v enoverižno stanje. Sonda nadomesti biotin deoksiuridin trifosfat ali digoksigenin uridin trifosfat s timidinom. Po renaturaciji naravne DNA s sondo lahko kompleks sonda-DNA zaznamo z dodatkom avidina, ki veže biotin, označenega s fluorokromom, ali s fluorokromom označenega antidigoksigenina. Dodatno izboljšanje signala lahko dosežemo z dodajanjem antiavidina in preučevanjem nastalega kompleksa s fluorescenčno mikroskopijo. Z označevanjem različnih DNA sond z več različnimi fluorokromi je mogoče hkrati vizualizirati več kromosomov ali kromosomskih segmentov znotraj ene celice kot večbarvne signale.

Možnost definicije specifične genske segmente, prisoten ali odsoten na kromosomih, je omogočil diagnosticiranje sindromov genskega zaporedja na ravni DNK, pa tudi translokacij v interfaznih jedrih, pogosto v posameznih celicah.

Material za RIBE lahko služijo bodisi metafazni kromosomi, pridobljeni iz delečih se celic, bodisi interfazna jedra iz celic, ki niso v fazi delitve. Odrezki so predhodno obdelani z RNazo in proteinazo, da se odstrani RNK, ki bi lahko navzkrižno hibridizirala s sondo in kromatinom. Nato jih segrejemo v formamidu, da denaturiramo DNK, in fiksiramo z ledeno mrzlim alkoholom. Sondo nato s segrevanjem pripravimo za hibridizacijo. Sondo in pripravek kromosomov nato zmešate in zaprite s pokrovom pri 37 °C za hibridizacijo. S spreminjanjem inkubacijske temperature ali sestave soli hibridizacijske raztopine je mogoče povečati specifičnost vezave in zmanjšati označevanje ozadja.

Uporaba fluorescentne in situ hibridizacije - FISH tehnologija

Učinkovitost tehnologije FISH je bilo prvič dokazano z lokalizacijo genov na . Z uvedbo fluorescentnega označevanja se je hibridizacija in situ izkazala za nepogrešljivo za diagnosticiranje kromosomskih nepravilnosti, ki jih tradicionalne metode povezovanja ne odkrijejo. FISH je prav tako igral ključno vlogo pri enem najbolj izjemnih odkritij v sodobni genetiki: genomski imprinting.

Njegova razvojna tehnologija RIBE prejeli v treh oblikah. Za centromere ali alfa satelitske sonde je značilna relativna kromosomska specifičnost in se najpogosteje uporabljajo v genetiki interfaznih celic. Te sonde ustvarjajo nekoliko razpršene signale ustrezne moči v regiji centromere, vendar se ne križajo s kromosomi, ki imajo podobna zaporedja centromer. Trenutno so bile razvite sonde z eno kopijo, ki zagotavljajo diskretni signal iz specifičnega kromosomskega pasu in se izogibajo pojavu navzkrižne hibridizacije. Te sonde je mogoče uporabiti tudi za določanje števila kopij in specifičnih kromosomskih regij, za katere sumimo, da so povezane z določenim sindromom. Za prenatalno diagnozo se uporabljajo sonde z eno kopijo in centromere, zasnovane za kromosome 13, 18, 21, X in Y.

Prav tako je mogoče "obarvati" celotne kromosome z uporabo RIBE. Zahvaljujoč tehnologiji spektralne kariotipizacije, ki uporablja mešanico različnih fluorokromov, je zdaj mogoče ustvariti edinstven fluorescentni vzorec za vsak posamezen kromosom s 24 ločenimi barvami. Ta tehnologija omogoča odkrivanje kompleksnih kromosomskih preureditev, ki niso vidne s tradicionalnimi citogenetskimi tehnikami.

Metoda RIBE v prenatalni diagnostiki. Za ženske v starejši rodni dobi je lahko nosečnost vzrok ne toliko za veselje kot zaskrbljenost. Starost ženske je povezana s tveganjem za nastanek kromosomskih nepravilnosti ploda. Amniocenteza, opravljena v 16. tednu nosečnosti, ki ji sledi analiza kariotipa, traja 10-14 dni. Uporaba FISH v predhodnem pregledu lahko pospeši diagnozo in skrajša čakalno dobo. Večina genetikov in laboratorijev je mnenja, da se FISH ne sme uporabljati ločeno za odločanje o nadaljnjem vodenju nosečnosti. Metodo FISH je treba dopolniti s kariotipsko analizo, njeni rezultati pa morajo vsaj korelirati s patološko sliko ultrazvočnega ali biokemičnega presejanja v materini krvi.

Genski sindromi zaporedja znani tudi kot mikrodelecijski sindromi ali segmentna anevzomija. To so delecije sosednjih fragmentov kromosomov, ki običajno vključujejo veliko genov. Sindromi genskega zaporedja so bili prvič opisani leta 1986 s klasičnimi citogenetskimi tehnikami. Zdaj je zahvaljujoč FISH mogoče identificirati submikroskopske delecije na ravni DNK, kar je omogočilo identifikacijo najmanjše izbrisane regije, povezane z razvojem določenega sindroma, imenovane kritična regija. Ko je identificirana kritična regija za sindrom, je pogosto mogoče identificirati specifične gene, katerih odsotnost je prepoznana kot povezana s sindromom. Nedavni vodnik o sindromih zaporedja genov poroča o 18 sindromih izbrisov in mikrodelecij, povezanih s 14 kromosomi. Nekateri najpogostejši sindromi zaporedja genov in njihove klinične manifestacije so podani v tabeli. 5-2.

Telomeri- tvorbe, ki pokrivajo konce dolgih in kratkih krakov kromosomov. Sestavljeni so iz ponavljajočih se sekvenc TTAGGG in preprečujejo zlitje koncev kromosomov med seboj. Telomerne sonde igrajo pomembno vlogo pri prepoznavanju kompleksnih translokacij, ki jih s tradicionalnimi citogenetskimi metodami ni mogoče odkriti. Poleg tega je bilo eno od odkritij projekta človeškega genoma dejstvo, da so regije kromosomov, ki mejijo na telomere, bogate z geni. Zdaj je bilo dokazano, da so submikroskopske subtelomerne delecije odgovorne za pojav številnih genetsko pogojenih bolezni.

In situ hibridizacija nukleinskih kislin Metoda temelji na možnosti tvorbe dvoverižnih hibridov med označenimi sondami, umetno ustvarjenimi na osnovi enoverižnih zaporedij (ribo- ali deoksiribo-, oligo- ali polinukleotidnih) in njihovih komplementarnih zaporedij v tarčah. - analizirane molekule DNA ali RNA. Za identifikacijo območij hibridizacije je DNA sonda (DNA sonda) označena s katero koli reportersko skupino: radioaktivnim izotopom, fluorokromom, encimom, ki proizvaja barvo ali luminiscentni produkt, haptenom, na katerega se veže označeno telo itd.

Z identifikacijo hibrida zaradi prisotnosti reporterske skupine v sondi je mogoče - oceniti število genov, ki kodirajo določeno vrsto RNA, - določiti delež neprepisane DNA v genomu, - ugotoviti povezavo. določenih genov med seboj – in njihovo natančno lokacijo na kromosomih. Metoda molekularne hibridizacije ima visoko občutljivost (možno je zaznati majhno količino označene sonde (10 -15 in 10 -19 M) in s tem njeno komplementarno zaporedje v tarči) in hitro analizo, kar omogoča uporabo to metodo tako za raziskovalno dejavnost kot za diagnostiko dednih in nalezljivih bolezni v medicini, veterini in rastlinstvu.

Pojav novih tehnologij molekularne citogenetike, ki temelji predvsem na in situ hibridizaciji nukleinskih kislin, je bistveno razširil možnosti kromosomske diagnostike.

Interfazna citogenetika: 1. Multicolor chromosome banding (MCB). 2. Fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH). 3. Kombinacija FISH z drugimi metodami: -citologija + FISH; -histologija + RIBE; -imunofenotipizacija + RIBE (FIKCIJA); Metafazna citogenetika: 1. Celotna slika kromosomov. 2. Primerjalna genomska hibridizacija (CGH). 3. Kariotipizacija spremembe barve (CCK). 4. Večbarvna kariotipizacija: spektralna kariotipizacija (SKY); večbarvna RIBA (M - RIBA, M - PAS).

FISH – fluorescenčna in situ hibridizacija – je citogenetska metoda, ki se uporablja za detekcijo in lokalizacijo specifičnih zaporedij DNA na kromosomih, majhnih RNA itd. Tehnika temelji na hibridizaciji fluorescentno označene sonde DNA/RNA s komplementarno DNA/RNA. zaporedje. Oznako zaznamo s fluorescenčnim mikroskopom. Metoda FISH je bila predstavljena pred več kot 30 leti. Postala je zelo razširjena kot metoda za fizično preslikavo genov na kromosomih. Kasneje so ga uporabili na drugih področjih raziskovanja (klinična genetika, reproduktivna medicina, toksikologija, evolucijska biologija, primerjalna in celična genomika ter kromosomska biologija). Trenutno se FISH uporablja predvsem za izdelavo fizičnih in genetskih zemljevidov kromosomov, za identifikacijo strukturnih preureditev, translokacij, mikrodelecij in pomnožitev genov v interfaznih in metafaznih kromosomih. Zaradi znanstvenega napredka (boljše razumevanje kemijskih in fizikalnih lastnosti nukleinskih kislin in kromatina) ter razvoja fluorescenčne mikroskopije in digitalnega slikanja se je metoda nenehno izboljševala (izboljšala se je občutljivost, specifičnost, ločljivost) in razvitih je bilo veliko različic te metode.

1) Celice spustimo na stekelce, kar povzroči širjenje kromosomov 4) Kromosome nasprotno obarvamo z DAPI 2) Fluorescentno označeno sondo namestimo na kromosome in zapremo. 3) Sondo in kromosome denaturiramo, hibridiziramo in nato speremo. 5) Predmetno stekelce si ogledamo pod fluorescenčnim mikroskopom.

Splošni pogled na protokol za določanje stopnje FISH lahko predstavimo takole: 1. Priprava histološkega ali citološkega preparata. Priprava histološkega preparata poteka po standardnem postopku: rezanje, označevanje, ožičenje, polnjenje, mikrotomija, postavitev rezine na predmetno stekelce in devoskanje. Pri pripravi citološkega pripravka se uporabljajo posebne raztopine za obarjanje in centrifugiranje, kar omogoča pridobitev koncentrirane celične suspenzije. 2. Predobdelava (če je potrebna). Zdravilo je obdelano s proteazami, da se odpravi prisotnost proteinov, ki ovirajo hibridizacijo. 3. Nanos DNA sonde na pripravek in kasnejša denaturacija. Da bi denaturirali sondo in vzorec DNK, ju obdelamo s formamidom in segrejemo na temperaturo okoli 85 -900 C.

4. Hibridizacija. Po denaturaciji zdravilo ohladimo na določeno temperaturo (v primeru kliničnih študij 370 C) in nekaj ur inkubiramo v vlažni komori (trajanje inkubacije je navedeno v posameznem protokolu). Trenutno se za denaturacijo in hibridizacijo uporabljajo avtomatski hibridizatorji. 5. Pranje. Po končani hibridizaciji je potrebno sprati nevezane sonde, ki bi sicer ustvarile ozadje, ki bi otežilo ovrednotenje rezultatov FISH analize. Za izpiranje se običajno uporablja raztopina, ki vsebuje natrijev citrat in klorid (SSC). 6. Protibarvanje. S fluorescenčnimi barvili (DAPI - 4,6-diamidin-2 fenilindol; propidijev jodid) se obarva vsa jedrna DNA. 7. Analiza rezultatov s fluorescenčnim mikroskopom Rutinske operacije (razvoskanje, predobdelava, pranje) je mogoče avtomatizirati.

Preučevanje telomernih regij s fluorescenčnim mikroskopom. Slike, dobljene na stopnji interfaze (jedro) in metafaze (posamezni kromosomi), se združijo. modra barva - DAPI.

Prednosti metode FISH: 1. možnost preučevanja genetskega materiala v interfaznih jedrih; 2. pridobivanje objektivnih rezultatov po principu “da/ne” - to je kvantitativna metoda; za analizo rezultatov pod mikroskopom je potrebno visokokakovostno fluorescentno barvilo.

Metoda FISH temelji na reakciji hibridizacije med sondo DNA, ustvarjeno s posebnimi tehnologijami, ki je nukleotidno zaporedje omejene velikosti, in komplementarno regijo jedrske DNA citogenetskega pripravka, ki ga proučujemo. Sonda DNA, glavni element za FISH, nosi "oznako", tj. vsebuje nukleotide, neposredno povezane s fluorokromom ali haptenom za nadaljnjo vizualizacijo s protitelesi, ki nosijo fluorokrom. Nevezano označeno DNA speremo, nato pa sondo hibridizirane DNA zaznamo s fluorescenčnim mikroskopom.

Označevanje DNK delimo na neposredno in posredno. Direktno označevanje, vnos reporterskih elementov v DNK - fluorokromi (rodamin, dietilaminokumarin, teksaško rdeče itd.). Metoda indirektnega označevanja - vzorec DNK predhodno konjugiramo z intermediarnimi ligandi (biotin, dioksigenin, 2,4-dinitrofenol), katerih prisotnost na citološkem preparatu nato detektiramo s fluorokromi. V tem primeru se občutljivost metode znatno poveča, saj lahko ligand vsebuje več mest interakcije s fluorokromom. Hibridizacija in situ s sondo, označeno s 32 P, je bila prvič opisana leta 1969. Zaradi razvoja neradioaktivnih sistemov za označevanje in detekcijo DNA sond je metoda in situ hibridizacije postala varna, enostavna za izvedbo in manj delovno intenzivna pri obdelavi rezultatov. Fluorescentna barvila so blaga in enostavna za uporabo, lahko jih hranimo za nedoločen čas, zagotavljajo visoko ločljivost in omogočajo hkratno preiskavo več zaporedij DNK.

Sonde: enoverižne/dvoverižne DNA/RNA primarno/sekundarno označene sonde. Sonde označujemo: 1) direktno: z vstavitvijo nukleotidov, na katere je pritrjen fluorokrom (PCR ali nick translacija) 2) preko reporterske molekule (npr. digoksigenin, biotin), na katero so pritrjena fluorescentno označena protitelesa. Za okrepitev signala lahko uporabimo sekundarna, terciarna itd. protitelesa, označena s fluorescenčno oznako. DNase nicks DNA Nick Translation DNA polimeraza I doda nove nukleotide 3' hidroksilni DNA polimerazi I odstrani posamezne baze s 5' konca Vizualizacija kromosoma: z uporabo DAPI (2 mg/ml). 4',6-diamidino-2-fenilindol; močna vezava na področja DNA, bogata z A-T; vzbujanje z UV svetlobo; emisija 461 nm (modra).

Trenutno obstaja več glavnih pristopov, ki se pogosto uporabljajo v sodobni molekularni citogenetiki: Identifikacija materiala iz razširjenih kromosomskih regij in celotnih kromosomov. Odkrivanje specifičnega zaporedja DNK v območju, ki nas zanima. Analiza neravnovesja posameznih kromosomskih regij. Za identifikacijo materiala razširjenih kromosomskih regij in celotnih kromosomov se pogosto uporabljajo kromosomsko specifične in regionalno specifične DNK sonde ("slikarske sonde").

Značilnosti sond različnih vrst 1. lokus-specifične sonde (LSI – locus – specific identifiers, vezava na določene regije kromosomov.) Te sonde se uporabljajo za identifikacijo obstoječega kratkega (neponavljajočega se) zaporedja izolirane DNA, ki se uporablja za pripravo označene sonde in njeno kasnejšo hibridizacijo z nizom kromosomov. Namenjeni so ugotavljanju diagnostično in prognostično pomembnih kromosomskih aberacij pri različnih patoloških stanjih (monosomije in trisomije na posameznih kromosomih). Najbolj razširjena uporaba teh vzorcev je bila pridobljena v prenatalni citogenetski diagnostiki, zlasti pri študijah celic horionskega tkiva in interfaznih jeder amniocitov.

2. DNK sonde za telomerne regije kromosomov (TEL telomericprobe) so zasnovane za odkrivanje izbrisov in preureditev, ki vplivajo na končne dele kromosomskih krakov. Takšne sonde so specifične za p- ali q-krake kromosomov in so komplementarne regiji dolžine približno 300 kb. od konca kromosoma. DNK sonde za kratke in dolge kromosomske krake so praviloma povezane z različnimi fluorokromi, kar omogoča detekcijo obeh telomernih regij kromosoma na enem citogenetskem preparatu.

3. centromere repeat probes, alfoidne ali kromosomske enumeracijske sonde (CEP - centromere. Enumeration. Probe) so za kromosome specifične DNK sonde, ki jih predstavljajo zaporedja tandemskih alfa in beta satelitskih ponovitev. Te ponovitve se nahajajo pretežno v centromernih ali pericentromernih heterokromatskih regijah kromosomov. Z njihovo pomočjo lahko vsak kromosom pobarvamo v drugo barvo, kar omogoča hitro določitev števila kromosomov in odstopanja od njihovega normalnega števila, 4. sonde za celoten kromosom, celokromosomska sonda (WCP – Whole-Chromosome- Slika so niz) majhnih sond, ki dopolnjujejo posamezne odseke kromosoma, vendar na splošno pokrivajo njegovo celotno dolžino. Z uporabo knjižnice takih sond lahko "obarvamo" celoten kromosom in dobimo diferencialni spektralni kariotip posameznika. Ta vrsta analize se uporablja za analizo kromosomskih aberacij, kot so translokacije, ko se del enega kromosoma prenese na krak drugega.

Področja uporabe FISH se široko uporablja za reševanje naslednjih kliničnih diagnostičnih problemov: 1. Perimplantacijska prenatalna in diagnostika kromosomskih nepravilnosti. Uporablja se v klinikah za in vitro oploditev (IVF) in perinatalnih centrih. Omogoča pravočasno (pred implantacijo zarodka v primeru IVF ali v zgodnjih fazah razvoja ploda) prepoznavanje genetskih motenj pri nerojenem otroku in sprejetje potrebnih ukrepov. 2. Onkohematologija. Onkohematološke bolezni nastanejo kot posledica različnih kromosomskih aberacij, zato se za njihovo diagnostiko uporabljajo ustrezne sonde CEP in LSI. 3. Diagnostika solidnih tumorjev. Trenutno se ugotavlja vse več vzročno-posledičnih povezav med razvojem določenih onkoloških bolezni in spremembami v genomu, značilnimi zanje. Zato lahko z uporabo ustreznih DNA sond opravimo onkološko FISH diagnostiko.

Interfazna citogenetika: Kombinacija FISH z drugimi metodami: - FISH imunofenotipizacija (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) – za preučevanje tumorskih celic. Za to analizo se uporabljajo neobarvani brisi krvi, kostnega mozga ali pripravki drugih tkiv. 1. stopnja - zdravila se inkubirajo s specifičnimi monoklonskimi protitelesi, 2. stopnja - izvede se konjugacija s fluoroforji za kasnejšo vizualizacijo kompleksa antigen-monoklonsko protitelo. Faza 3 - izvede se in situ hibridizacija z DNA sondami. Za odkrivanje monoklonskih protiteles in DNA sond se uporabljajo fluoroforji, ki se razlikujejo po barvi. Preučevanje zdravila pod fluorescenčnim mikroskopom v prisotnosti potrebnega nabora filtrov omogoča hkratno analizo imunofenotipa hibridizacije in signalov v interfaznih jedrih.

Kromosomska delecija TNFAIP 3 v c. HL odkrit z interfazno citogenetiko. FIKCIJA analize. predstavnik c. Združevanje ohišij HL. Ekspresija CD 30 (rdeča) in sonde FISH za TNFAIP 3 in centromero kromosoma 6 (modra [b]). V dvobarvnih testih v A–C ter E in F je sonda TNFAIP 3 označena z zeleno (g); pri trobarvnem testu, uporabljenem v D, daje sonda TNFAIP 3 g/oranžni kolokaliziran (co) signal. Za prikaz dvo- in trobarvnih testov FISH v kombinaciji z imunofluorescenco CD 30 se uporabljata dve različni strategiji; i. e. , so dvobarvni testi (A–C ter E in F) prikazani s trobarvnim zaslonom, medtem ko se lažni večbarvni prikaz, kot ga pridobi programska oprema Isis, uporabi za tribarvni test (D), da hkrati prikaže štiri barve ( tj. CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] in oranžna ter centromera kromosoma 6 [b]).

Digitalno snemanje mikroslik je odprlo možnost pretvorbe ne le kombinacij fluoroforjev v psevdobarve, temveč tudi njihova razmerja intenzitet

Večbarvno barvanje kromosomov (Muli. Color Banding - MCB) Ta metoda ni namenjena popolni analizi vseh kromosomov, temveč podrobni analizi posameznega kromosoma. DNA sonde, specifične za lokus, so označene z različnimi fluoroforji ali kombinacijami fluoroforjev, tako da se raven signala vsake DNA sonde razlikuje po intenzivnosti. Prekrivajoči se profili intenzitete signala sond DNA zagotavljajo variacije v razmerjih intenzivnosti fluorescence različnih fluoroforjev vzdolž kromosoma. Razmerja intenzivnosti je mogoče pretvoriti v psevdobarve in tako bo vsaka točka na sliki in posledično vsak od kromosomskih lokusov imela svojo psevdobarvo. Ta različica večbarvne metode FISH se je izkazala za zelo učinkovito pri analizi ne le medkromosomskih, ampak tudi znotrajkromosomskih preureditev pri raku. Za njegovo uspešno uporabo pa je treba najprej določiti kromosom, ki ga bomo pregledali. Ta metoda molekularne citogenetike je primerna za analizo nepravilnosti kariotipa, povezanih s specifičnimi kromosomi.

Do danes so bili ustvarjeni kompleti DNK sond, ki zagotavljajo MSV za vse človeške kromosome (ilustracija Meta. Systems Gmb. H) (in situ hibridizacija regionalno specifičnih knjižnic DNK kromosoma 5; signal). profili regionalno specifičnih knjižnic DNK na kromosomu 5; idiogram kromosoma 5, uporabljen za MSV).

Metafazna citogenetika, ki je zgodovinsko nastala prej kot interfazna citogenetika, omogoča odkrivanje širokega spektra kromosomskih nepravilnosti, vendar je za to potrebno, da so proučevane celice v metafazni fazi mejoze.

Večbarvna kariotipizacija Analiza se izvaja z DNA sondami za kontinuirano barvanje krakov ali celih kromosomov (WCP sonde - whole chromosome paint). Takšne sonde se hibridizirajo s številnimi kratkimi zaporedji DNA, ki se nahajajo vzdolž celotne dolžine kromosoma. Tako je pri pregledu pod fluorescenčnim mikroskopom kromosom videti enakomerno obarvan v določeni barvi.

Sonde DNK, ki se uporabljajo za to analizo, so sestavljene iz mešanice enobarvnih sond za celoten komplet človeških kromosomov, označenih s kombinacijo več fluorokromov, katerih razmerje je izbrano posebej za vsak par kromosomov. Uporaba ustreznih metod registracije in računalniških programov za analizo slike, ki ocenjujejo intenzivnost luminiscence vseh fluorokromov za vsako slikovno točko, omogoča kariotipizacijo, pri kateri ima vsak par kromosomov svojo edinstveno "psevdobarvo".

M-FISH (multitarget multifluor multicolor ali multiplex. FISH) je generično ime za tradicionalne večbarvne FISH, ki uporabljajo nize filtrov, specifične za fluorokrom. Princip M-FISH je sestavljen iz ločenega digitalnega zapisa signala vseh uporabljenih fluorokromov, kar se doseže z zaporedno menjavo filtrskih sklopov. Vse slike so posnete v ločenih datotekah, kar omogoča njihovo učinkovito obdelavo, povezano z ločevanjem signala in ozadja, ter kvantitativno oceno signala. Obdelava vseh posnetih informacij s posebno programsko opremo pretvori podatke o ravni fluorokromnih signalov na vsaki točki slike v psevdobarve. Ena od glavnih omejitev števila uporabljenih sond DNK je število razpoložljivih fluorokromov z neprekrivajočimi se vzbujevalnimi in emisijskimi spektri ter razpoložljivost ustreznih kompletov filtrov.

24-barvni FISH M-FISH se najbolj uporablja kot 24-barvni FISH za hkratno identifikacijo materiala iz vseh človeških kromosomov. Je zelo učinkovit pri odkrivanju kromosomskih translokacij, vendar ni namenjen odkrivanju delecij in inverzij. Delno pa je to težavo mogoče rešiti s sočasnim barvanjem kromosomov z DAPI, ki omogoča analizo diferencialne proge kromosomov, katerih kromosomska pripadnost je že ugotovljena. Na žalost je treba opozoriti, da je kakovost DAPI-pasov kromosomov po M-FISH bistveno slabša od diferencialnega obarvanja GTG in celo DAPI-pasov po običajni in situ hibridizaciji.

Rx. FISH Načelo M-FISH je bilo uporabljeno za ustvarjanje večbarvne črtne kode za človeške kromosome in metode večbarvnega povezovanja kromosomov, ki temelji na medvrstni hibridizaciji in situ. Za razliko od 24-barvne FISH, ta metoda omogoča neposredno detekcijo nekaterih znotrajkromosomskih preureditev. DNA sonde, uporabljene v Rx. RIBE, označene s kombinacijo 3 fluorokromov, kar ima za posledico 7 psevdobarv. Posebej obarvajo posamezne regije kromosomov in ustvarijo njihove barvne proge. To je značilnost vzorcev DNK za Rx. RIBE se določijo glede na način njihovega pridobivanja. So kromosomsko specifične knjižnice DNK dveh vrst gibonov: Hylobates concolor in Hylobates syndactylus.

Zaradi intenzivnih kromosomskih preureditev, ki so se zgodile med nastankom sodobnih vrst gibonov, se je izkazalo, da je material njihovih kromosomov močno premešan v primerjavi z organizacijo kromosomov pri ljudeh, katerih kromosomi so znani po svoji konzervativnosti. Razmerje med človeškim kromosomom 1 in kromosomi gibona je prikazano na sliki 1.

Slika 2 prikazuje splošen pogled na človeške kromosome, pridobljene kot rezultat Rx. RIBE. a) Metafazna plošča b) Razporeditev kromosomov.

Vendar pa ima RXFISH precej resne omejitve - kromosomskih preureditev, ki so se zgodile znotraj enega barvnega pasu RX, s to metodo ni mogoče zaznati, razen če povzročijo pomembne in lahko vidne spremembe v velikosti tega pasu. - sonde obarvajo več kromosomskih regij različnih kromosomov v eno psevdobarvo. Vendar pa bo s povečanjem števila uporabljenih fluorokromov RXFISH nedvomno bolj informativen kot rutinski 24-barvni FISH.

Prednosti RXFISH trenutno vključujejo naslednje točke: Metoda omogoča analizo celotnega človeškega genoma v enem večbarvnem eksperimentu FISH. Na voljo so komercialno dostopni kompleti označenih sond DNK in potrebni sistemi za odkrivanje. Metoda omogoča hitro identifikacijo pomembnega dela intra- in interkromosomskih preureditev. Možna je samodejna identifikacija metafaznih kromosomov "barvnih pasov". Za vsak človeški kromosom obstaja edinstvena barvna črtna koda. RXFISH je integriran v delovno postajo Cyto. Vision in standardni fluorescenčni mikroskopski sistemi.

Spektralna kariotipizacija (SKY-spektralna kariotipizacija) Osnovna načela analize mikroskopske slike za spektralno kariotipizacijo so praktično enaka tistim, ki se uporabljajo za M-FISH. Razlike so povezane z načinom registracije slike. Tehnologija SKY omogoča pridobitev spektralnih krivulj za vse slikovne točke v eni meritvi, ne glede na to, ali je povezana z epifluorescenčno ali tradicionalno svetlobno mikroskopijo. Za spektralno kariotipizacijo vseh človeških kromosomov se uporablja pet fluorokromov, eden v zelenem spektru, dva v rdečem in dva v infrardečem spektru. Vzbujanje in emisija vseh fluorokromov, ki se uporabljajo pri označevanju DNA sond, poteka z enim nizom filtrov, s čimer se izognemo njihovi zaporedni spremembi, vmesnemu fokusiranju in posledično povezanim težavam, kot so premik prostorske slike, določanje mejnih vrednosti in segmentacijske maske. Na podlagi analize spektralnih krivulj se ugotavlja prisotnost ali odsotnost specifičnih fluorokromov na določeni točki.

Naslednji korak je postopek klasifikacije, ki omogoča neposredno in nedvoumno določitev kromosomske identitete analiziranega materiala. To zagotavlja zanesljivo identifikacijo (znotraj natančnosti kromosoma) materiala markerskih kromosomov, kot tudi kromosomskih derivatov, ki so posledica različnih preureditev. Velika prednost SKY je, da se barva DAPI snema vzporedno s spektralno sliko. Programska izboljšava pasov DAPI omogoča doseganje diferencialnih črt v kakovosti, ki je blizu pasov GTG. Možnost vzporedne analize spektralne slike in kakovostno diferencialno barvanje kromosomov močno poenostavi interpretacijo rezultatov SKY in omogoča natančnejše določanje točk kromosomskih prelomov. Nedvomne prednosti SKY vključujejo možnost uporabe fluorokromov s prekrivajočimi se vzbujevalnimi in emisijskimi spektri, kar bistveno razširi seznam fluorokromov, primernih za uporabo, in poveča tudi število fluorokromov, ki se lahko uporabljajo hkrati. Vključitev novega fluorokroma na seznam ne zahteva nakupa novega kompleta filtrov, saj za SKY zadostujeta ena banka filtrov za spektralni FISH in ena banka filtrov za DAPI.

Slabosti SKY so: - dolg čas osvetlitve, potreben za snemanje mikroskopskih slik. - SKY je nekoliko manj učinkovit kot M-FISH, če je treba izvajati študije z relativno majhnimi DNA sondami.

Kariotipizacija s spreminjanjem barve (CCKc Kariotipizacija s spreminjanjem barve) Ta metoda temelji na analizi razlik v dolžini signala med vzorci DNA, hibridiziranimi s sondami DNA, povezanimi s fluorokromi, in s sondami DNA, ki vsebujejo protitelesa. Metoda je izvedljiva s samo 3 filtri in ne zahteva posebnih kamer ali programske opreme. Za identifikacijo kromosomov se izvede ena hibridizacija in dobijo se dve sliki. Metoda temelji na razliki v dolžini fluorescenčnega signala, saj je čas izpostavljenosti vzorcev DNK, povezanih s protitelesi, 80 - 90 % krajši od časa izpostavljenosti vzorcev, povezanih s fluorokromi. Po hibridizacijski reakciji se brisi izpostavijo ustreznim primarnim protitelesom in nato slikajo, da dobimo prvo sliko. Stekelca nato izpostavimo sekundarnim protitelesom in avidinu, ki je povezan z istimi fluorokromi. Brise je mogoče nasprotno obarvati z DAPI.

Nato se ponovno pridobijo slike preparatov z uporabo 3 filtrov zaporedoma. Te slike se primerjajo s posebno programsko opremo za izdelavo druge slike, na kateri bodo vidni le kromosomi, povezani z določenimi protitelesi. Tako bodo nekateri kromosomi fluorescirali samo na prvi ali drugi sliki, medtem ko bodo drugi spremenili barvo na različnih slikah.

Primerjalna genomska hibridizacija (CGH) Metoda je bila ustvarjena za odkrivanje kvantitativnih nepravilnosti v genomu. Temelji na in situ hibridizacijski reakciji z uporabo celotnega genoma kot sonde DNA. Izolirano in normalno DNK darovalca označimo s fluorokromi različnih barv in ju tako spremenimo v DNK sonde. Enakovredne količine teh sond se zmešajo in uporabijo pri hibridizaciji s kontrolnim citogenetskim pripravkom. Po FISH se metafaze analizirajo na fluorescenčnem mikroskopu z uporabo specializiranega računalniškega programa za analizo slik za določitev intenzivnosti fluorescence dveh fluorokromov vzdolž celotne dolžine vsakega kromosoma.

V odsotnosti kvantitativnih sprememb v kariotipu proučevanega vzorca bo opaziti določeno razmerje intenzivnosti luminiscence obeh fluorokromov. V primeru pomnoževanja gena se bo intenziteta signala ustreznega fluorokroma povečala, v primeru izgube dela genskega materiala pa bo, nasprotno, oslabela. Tako lahko CGH zazna genomska neravnovesja, vendar te metode ni mogoče uporabiti za odkrivanje uravnoteženih translokacij in inverzij, trisomije in delecije pa je mogoče zaznati le, če je velikost neuravnotežene regije vsaj 10 milijonov baznih parov.

Kromosomsko neravnovesje v testnem vzorcu ocenimo z razliko v intenzivnosti fluorescence dveh različnih fluorokromov z izračunom fluorescentnega razmerja (FR).

Metoda CGH ima številne prednosti v primerjavi z drugimi metodami za analizo sprememb genoma: Prvič, ni odvisna od vira preučevanega materiala in jo je mogoče uspešno izvesti z majhno količino testirane DNK, vključno z arhivskim gradivom. . Drugič, omogoča nam pridobitev podrobnih informacij o izgubi ali povečanju števila kopij genskega materiala v celotnem genomu v enem poskusu. Tretjič, metoda CGH ne zahteva priprave preparatov metafaznih kromosomov iz proučevanega tkiva, to pomeni, da ni odvisna od procesa celične kulture in povezanih artefaktov.

Genomska situ hibridizacija (genomicin situ hybridization in, GISH) je različica metode situ hibridizacije, ki je sestavljena iz dejstva, da se za hibridizacijo s fiksnimi vzorci uporabi celotna genomska DNA ene vrste organizma kot fluorescenčno označena sonda, s kateri tekmuje celotna genomska DNK druge vrste organizma; uporablja se za določanje medvrstnih in znotrajvrstnih razlik v genomih, kromosomskih preureditev, delecij in substitucij.

Različice FISH 1) Q-FISH – kvantitativni FISH: razvili Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward in P. M. Lansdorp. 1998. Kratke telomere na človeškem kromosomu 17 str. Nat. Genet. 18: 76-80. Kvantitativna metoda. Zasnovan za uporabo s pretočno citometrijo. Sprva se uporablja za merjenje dolžine kromosoma (ločljivost: 200 bp) s štetjem števila telomernih ponovitev. Uporabljajo se sonde, konjugirane s PNA. Sprva so proučevali metafazne kromosome (sam QFISH), zdaj pa je ta metoda uporabna tudi za interfazne kromosome (IQ-FISH). Q-FISH se izvaja na celični kulturi in tkivnih rezih (oboje na steklu). Trenutno je Q-FISH pomembno orodje pri proučevanju vloge telomerov v procesih staranja in nastajanju raka.

PNA-FISH - Peptidne nukleinske kisline FISH: Peptidne nukleinske kisline (PNA) so sintetični analogi DNK, v katerih je ogrodje deoksiriboza fosfatnega sladkorja, ki podpira dušikovo bazo, nadomeščeno z nenaelektrenim peptidnim ogrodjem. Zaradi te strukture: ko oligomerna sonda PNA hibridizira s komplementarno DNA/RNA, ne pride do elektrostatičnega odbijanja. Dupleksi PNA-DNA (PNA-RNA) so veliko bolj stabilni kot naravni homo/heterodupleksi. Visoka specifičnost vezave PNA-DNA: Hibridizacija PNA-DNA je veliko bolj občutljiva na neujemanja baznih parov kot hibridizacija DNA-DNA. Tako je z uporabo sonde PNA možno razlikovati med dvema centromernima ponovitvama, ki se razlikujeta samo v enem baznem paru. PNA je relativno hidrofoben (v primerjavi z DNA), zaradi česar PNA bolje difundira skozi celične stene => široka uporaba v mikrobiologiji. Na podlagi visoke specifičnosti vezave se verjame, da bo tehnologija PNA kmalu postala osnova za razvoj alelno specifičnih sond za in situ hibridizacijo. Uporablja se v genetiki, citogenetiki, epigenetiki, mikrobiologiji itd.

3) Flow-FISH – FISH za pretočno citometrijo: Predlagano leta 1998: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Dinamika dolžine telomer v subpopulacijah človeških limfocitov, merjena s pretočno citometrijo. Nature Biotechnol. 16, 743–747 (1998). Kombinacija Q-FISH in pretočne citometrije, ki omogoča analizo (merjenje) in sortiranje signala. Flow-FISH uporablja celično suspenzijo (za merjenje dolžine kromosomskih telomer), kromosomske razpone in izolirane kromosome (za nadaljnje preslikavo). Kot pri Q-FISH se uporabljajo telomerne sonde, označene s PNA (na primer za vizualizacijo in merjenje dolžine telomernih ponovitev). Glavna prednost je hitrejša metoda (analiza/razvrščanje velikega števila celic/kromosomov). Pogosto se uporablja za preučevanje različnih težav: staranje, ohranjanje telomer, preučevanje suspenzij hematopoetskih matičnih celic ex vivo, preučevanje bakterij.

Multiparametrična analiza omogoča diferenciacijo tipov celic znotraj enega vzorca, kar omogoča notranjo kontrolo in analizo podtipov levkocitov.

Prednosti flow-FISH: Enostavno ponovljivi rezultati Sposobnost analize podskupin celic v populaciji z uporabo fizične imunofluorescence in markerjev Boljša zmogljivost kot Q-FISH Sposobnost pridobivanja kvantitativnih podatkov o fluorescenci iz tisočev celic.

ŠTUDIJA IZOLIRANIH KROMOSOMOV z metodami pretočne citometrije 1. Razvrščanje kromosomov s pretočno citometrijo - Kariotipizacija s pretočno citometrijo se uporablja za nadaljnje gensko kartiranje in gradnjo kromosomskih knjižnic. - Identifikacija in lokalizacija genov na razvrščenih kromosomih se izvaja s kasnejšo uporabo metode FISH/PRINS (primed in situ labeling) ali njenih variacij in kromosomsko specifične PCR. - Do leta 2011 so uspešno razvrstili kromosome le 17 vrst kulturnih rastlin. - Razvrščanje metafaznih ali pahitenskih kromosomov z visokim indeksom delitve.

Fluorescentno označevanje: - Kromosomi so označeni s fluorokromi, specifičnimi za nukleinsko kislino. - Fluorokromi so izbrani v skladu z 1) specifičnostjo za dušikove baze, 2) eksperimentalnimi pogoji (vključno z upoštevanjem valovnih dolžin razpoložljivih laserjev). 1. Za monovariantno analizo se uporabljajo barve, ki niso specifične za pare A-T ali G-C: propidijev jodid (vrh vzbujanja: 535 nm, vrh emisije: 617 nm, potreben laser: 488 nm argonov laser ali svetilka + dolgoprepustni filter) etidij bromid (vrhovi vzbujanja: 300 in 520 nm, emisija: 600 nm, potreben laser: 488 nm argonov laser ali svetilka + dolgoprepustni filter) Te oznake obarvajo DNK ne glede na vsebnost A, G, T ali dušikovih baz. 2. Za bivariatno analizo uporabite: kromomicin (specifičen za bazne pare G-C), vzbujanje vrha A 3: 458 nm, emisija 580 nm. Laser: 458 nm najmanj 400 V moči. Hoechst 33258 (specifičen za bazne pare A-T), vzbujanje: 351 -364 nm, emisija: 470 nm. Laser: 351 -364 nm (močan). Laserji morajo biti časovno in prostorsko ločeni zaradi delnega prekrivanja spektrov fluorokroma.

2. Študij kromosomskih/nukleotidnih zaporedij po razvrščanju (za izdelavo fizičnih in genetskih zemljevidov itd.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Študija velikih genomov z dolgimi kromosomi. Preslikava zaporedij z velikim številom ponovitev (npr. telomerne in centromerne regije). Uporaba kratkih sond. Zaradi velikega števila ponovitev je signal močan. Standardna velikost sonde: 15 – 30 nukleotidov. RIBE

Izzivi FISH: Zaporedja DNK z enim lokusom (tj. neponavljajoča se edinstvena zaporedja DNK) je težko lokalizirati, ker bo signal zelo šibek z uporabo standardnih kratkih sond. Povečanje dolžine sonde na več kilobaz za izboljšanje signala bo privedlo do zmanjšanja občutljivosti in => nespecifične vezave. Rešitev: BAC-FISH -BAC-FISH je kombinacija FISH in uporabe klonov genomske DNK, vdelanih v bakterijske umetne kromosome (BAC), kar omogoča vstavljanje velikih sekvenc DNK. -Učinkovita metoda za identifikacijo in kartiranje posameznih kromosomov organizmov z majhnimi genomi. Uporabljena sonda so BAC sonde, overgos (prekrivajoči se oligonukleotidi).

Alternativa FISH: PRINS PRINS (primed in situ labeling) je metoda označevanja kromosomov z uporabo žarjenja oligonukleotidnega primerja DNA s homolognim zaporedjem denaturirane kromosomske DNA in naknadnega encimskega podaljšanja primerja in situ z označenimi nukleotidi. Prvič so ga opisali Koch et al. leta 1989 (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N., in Bolund, I. (1989) Oligonukleotidne metode priprave za kromosomsko specifično označevanje satelitske DNA alfa in situ. Kromosom 98, 259 –265). PRINS je alternativa FISH. Uporablja se za lokalizacijo nukleotidnih sekvenc, prepoznavanje in štetje metafaznih ali interfaznih kromosomov ali kromosomskih parov (vključno s kromosomsko anevploidijo). žarjenje neoznačenega primerja (primer) s proučevanim DNA z uporabo termostabilne DNA polimeraze in označenih nukleotidov (pritrditev blokirne molekule na 3' koncu) Primer: restrikcijski fragment PCR produkt oligonukleotid; Označevanje nukleotidov: - direktno (fluorokromi) - indirektno (biotin/ dig fluorokrom konjugiran avidin/ anti-dig) - V rezultatih vsake PRINS reakcije je mogoče identificirati samo en par homolognih kromosomov (en kromosom). Naslednjo PRINS reakcijo na istem steklu lahko izvedemo šele po blokadi prejšnje. - Uporablja se za zaporedja DNK z velikim številom ponovitev.

Prednosti PRINS: 1. Minimalne informacije o zaporedju, potrebne za sintezo oligonukleotidnega primerja. 2. Najhitrejša in najenostavnejša metoda za odkrivanje zaporedja, ki nas zanima na kromosomu (v primerjavi z uporabo težkih sond za FISH, ki se hibridizirajo v zelo dolgem časovnem obdobju). 3. Odprava faze označevanja sonde. 4. Sposobnost podaljšanja primerja z označenimi nukleotidi za izboljšanje signala c-PRINS pri odkrivanju kratkih edinstvenih zaporedij. Za identifikacijo nizkokopiranih ponovitev ali kratkih unikatnih zaporedij se uporablja bolj občutljiva metoda - ciklično PRINS (c -PRINS). C-PRINS so predlagali Gosden et al. leta 1991 izboljšan široko uporabljan protokol – Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Lokalizacija zaporedij DNK na rastlinskih kromosomih z uporabo PRINS in C-PRINS. Metode v celični znanosti 23: 71 -82). C-PRINS vključuje vrsto termičnih ciklov, podobnih PCR.

Tekočina za ovojnico za FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Pretočna citometrija in FISH za merjenje povprečne dolžine telomer (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Pretočno razvrščanje mitotičnih kromosomov pri navadni pšenici (Triticum aestivum L.). Genetika. 2000; 156(4): 2033 -41) -Mg . So 4 pufer brez ditiotreitola (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gen physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, no. 2: 99 -103 ) -avtoklavirano 0,1 % (mas./vol.) Na. Cl -50 m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Razvrščanje kromosomov pri tetraploidni pšenici in njegov potencial za analizo genoma. Genetika. 2005, 170(2): 823– 829) - Poliaminski pufer, ki stabilizira kromosome (tekočina ovojnice, ki vsebuje beljakovine) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2. izdaja, del B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Fluorescenčna in situ hibridizacija

Fluorescenčna hibridizacija in situ , ali metoda FISH (eng. Fluorescenca in situ hibridizacija - RIBE ) - citogenetska metoda, ki se uporablja za odkrivanje in določanje položaja določenega zaporedja DNA na metafaznih kromosomih ali v interfaznih jedrih. in situ. Poleg tega se FISH uporablja za odkrivanje specifičnih mRNA v vzorcu tkiva. V slednjem primeru metoda FISH omogoča ugotavljanje prostorsko-časovnih značilnosti izražanja genov v celicah in tkivih.

Sonde

S fluorescentno hibridizacijo in situ uporabite DNK sonde (DNK sonde), ki se vežejo na komplementarne tarče v vzorcu. Sonde DNA vsebujejo nukleozide, označene s fluoroforji (neposredno označevanje) ali konjugate, kot sta biotin ali digoksigenin (posredno označevanje). Z neposrednim označevanjem lahko sondo DNA, vezano na tarčo, opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom takoj po končani hibridizaciji. V primeru posrednega označevanja je potreben dodaten postopek barvanja, pri katerem biotin dokazujemo s fluorescentno označenim avidinom ali steptavidinom, digoksigenin pa s fluorescentno označenimi protitelesi. Čeprav posredna različica označevanja s sondo DNA zahteva dodatne reagente in čas, ta metoda običajno omogoča doseganje višje ravni signala zaradi prisotnosti 3-4 molekul fluorokroma na protitelesu ali molekuli avidina. Poleg tega je v primeru posrednega označevanja možno kaskadno ojačanje signala.

Za izdelavo vzorcev DNK se uporabljajo klonirane DNK sekvence, genomska DNK, PCR reakcijski produkti, označeni oligonukleotidi in DNK pridobljena z mikrodisekcijo.

Označevanje sonde lahko izvedemo na različne načine, na primer z nick translacijo ali s PCR z označenimi nukleotidi.

Hibridizacijski postopek

Shema poskusa fluorescentne hibridizacije in situ za lokalizacijo položaja gena v jedru

Prva faza vključuje izdelavo sond. Velikost sonde mora biti dovolj velika, da pride do hibridizacije na določenem mestu, vendar ne prevelika (ne več kot 1 tisoč bp), da ne moti procesa hibridizacije. Pri identifikaciji specifičnih lokusov ali pri barvanju celotnih kromosomov je treba blokirati hibridizacijo DNA sond z needinstvenimi ponovljenimi zaporedji DNA z dodajanjem neoznačenih ponovitev DNA v hibridizacijsko mešanico (na primer Cot-1 DNA). Če je sonda DNA dvoverižna DNA, jo je treba pred hibridizacijo denaturirati.

Na naslednji stopnji se pripravijo pripravki interfaznih jeder ali metafaznih kromosomov. Celice se fiksirajo na podlago, običajno na stekelcu, nato pa se DNK denaturira. Za ohranitev morfologije kromosomov ali jeder se denaturacija izvaja v prisotnosti formamida, kar omogoča znižanje temperature denaturacije na 70°.

Vezane sonde DNA se vizualizirajo s fluorescenčnim mikroskopom. Intenzivnost fluorescenčnega signala je odvisna od številnih dejavnikov – učinkovitosti označevanja s sondo, vrste sonde in vrste fluorescenčnega barvila.

Literatura

Rubtsov N.B. Metode dela s kromosomi sesalcev: Učbenik. dodatek / Novosibirsk. stanje univ. Novosibirsk, 2006. 152 str.

Rubtsov N.B. Hibridizacija nukleinskih kislin in situ pri analizi kromosomskih nepravilnosti. Poglavje v knjigi “Uvod v molekularno diagnostiko” Vol. 2. “Molekularno genetske metode v diagnostiki dednih in onkoloških bolezni” / Ed. M.A. Paltseva, D.V. Zaletaeva. Učna literatura za študente medicine. M.: Medicina, 2011. T. 2. P. 100–136.

Opombe

Fundacija Wikimedia.

2010.

Poglejte, kaj je "Fluorescentna in situ hibridizacija" v drugih slovarjih:

Ta izraz ima druge pomene, glej hibridizacija. Hibridizacija DNA, hibridizacija nukleinskih kislin, in vitro združevanje komplementarnih enoverižnih nukleinskih kislin v eno molekulo. S popolnim dopolnjevanjem... ... Wikipedia Metoda določanja

fluorescenčna in situ hibridizacija. Material v študiji

Glej opis

Možnost obiska na domu

Študija se uporablja za izbiro posamezne adjuvantne kemoterapije za raka dojke ali raka želodca.

HER2 je receptor, ki je prisoten v tkivih in normalno sodeluje pri regulaciji celične delitve in diferenciacije. Njegov presežek na površini tumorskih celic (prekomerna ekspresija) določa hitro nenadzorovano rast tumorja, visoko tveganje za metastaze in nizko učinkovitost nekaterih vrst zdravljenja. Prekomerna ekspresija HER2 pri nekaterih podtipih raka dojke vodi do povečane proliferacije in angiogeneze, pa tudi do disregulacije apoptoze (gensko programirano samouničenje celic). Trenutno obstajajo zdravila, ki ciljajo na receptor HER2. To je predvsem Herceptin (trastuzumab), ki je monoklonsko protitelo proti receptorjem HER2/neu.

Pomnoževanje in prekomerna ekspresija onkogena HER2 (ErbB-2) sta razmeroma specifična dogodka za karcinom dojke in ju praktično ne najdemo v tumorjih drugih lokacij. Rak želodca (GC) je ena redkih izjem: aktivacija HER2 je opažena v približno 10-15% primerov malignih novotvorb tega organa in je povezana z agresivnim potekom bolezni. Pri HER2-pozitivnem raku dojke je lahko na površini tumorskih celic prisoten presežek receptorjev HER2 (to se imenuje HER2-pozitiven ali Hercept-pozitiven status). Ta pojav opazimo pri 15-20% žensk z rakom dojke. Ocenjevanje statusa HER2 je pomembno za določitev taktike zdravljenja.

Glavni standardizirani metodi za odkrivanje prekomerne ekspresije HER2/neu in/ali pomnoževanja gena HER2/neu sta imunohistokemična (IHC) in fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH). Obe študiji se izvajata na histoloških preparatih (odseki tumorskega materiala, vdelani v parafin) z uporabo poliklonskih protiteles (IHC), fluorescentnih sond (FISH) in različnih slikovnih sistemov.

Pri ocenjevanju rezultatov IHC reakcije se upošteva izraženost le v invazivni komponenti tumorja. Rezultati reakcije so ocenjeni s točkovno lestvico: 0, 1+, 2+, 3+, ki jo je razvil proizvajalec testa in odobrili strokovnjaki. Status Hercepta, ocenjen kot 0 in 1+, je treba obravnavati kot negativnega - ni prekomerne ekspresije proteina, kar je v korelaciji z odsotnostjo pomnoževanja njegovega gena. Status Hercepta, ocenjen kot 3+, je pozitiven, tj. prisotna je čezmerna ekspresija beljakovin, kar je v korelaciji s prisotnostjo pomnoževanja gena. Status Hercept 2+ se šteje za negotovega, kar pomeni, da izražanje beljakovin, določeno na podlagi imunohistokemične reakcije, ne more zanesljivo oceniti pomnoževanja gena, zato je potrebna študija, ki neposredno razkrije prisotnost ali odsotnost pomnoževanja. Metoda FISH se uporablja na rezih iz istega vzorca (bloka), na katerem je bila opravljena imunohistokemična študija. Med hibridizacijo FISH se prisotnost pomnožitve gena HER2 oceni z izračunom razmerja rdečih fluorescenčnih signalov (ki ustrezajo označenim genom HER2) in zelenih fluorescenčnih signalov, ki označujejo centromerno regijo 17. kromosoma. Razmerje, večje od 2, kaže na prisotnost ojačanja HER2. FISH je bolj občutljiv kot IHC, ker omogoča neposredno oceno prisotnosti ali odsotnosti ojačanja.

Material za raziskavo: parafinski blok z biopsijo tumorja.

Pozor! OBVEZNO:

preparat z IHC barvanjem s protitelesi proti HER2/neu
napotnico zdravnika ali izpisek z rezultati histoloških in IHC študij s protitelesi proti Her-2/neu

Literatura

Zavalishina L.E., Frank G.A. Morfološka študija statusa HER2. Metodologija in atlas. - M.: Založba. Media Medica. 2006:98.
Maligne bolezni v Rusiji v letu 2011 (obolevnost in umrljivost). Ed. V.I. Chissova, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. - M.: FSBI “MNIOI im. P.A. Herzen" ruskega ministrstva za zdravje. 2013: 289.
Onkologija. Klinična priporočila. Združenje onkologov Rusije. Ed. V.I. Chissova, S.L. Darjalova. - M.: Založba. "GEOTAR-Media". 2008: 702.
Bang Y. J., Van Cutsem E., Feyereislova A., Chung H. C., Shen L., Sawaki A. et al. Trastuzumab v kombinaciji s kemoterapijo v primerjavi s samo kemoterapijo za zdravljenje HER2-pozitivnega napredovalega raka želodca ali gastroezofagealnega spoja (ToGA): odprto, randomizirano kontrolirano preskušanje faze 3. Lanceta. 2010;376:687-697.
Dabbs D.J. Diagnostična imunohistokemija: Teranostične in genomske aplikacije. Elsevier, 4. izdaja. 2013: 960.
Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C., Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Incidenca raka in umrljivost po vsem svetu: IARC Cancer Base št. 10. Lyon, Francija: Mednarodna agencija za raziskave raka; 2010. Dostopno na: http://globocan.iarc.fr.
Goldhirsch A., Glick J.H., Gelber R.D., Coates A.S., Thurlimann B., Senn H.J. Poudarki srečanja: Mednarodno strokovno soglasje o primarni terapiji zgodnjega raka dojke 2005. Annals of Oncology. 2005;16(10):1569-1583.
Kurman R.J., Carcangiu M.L., Herrington C.S., Young R.H. Klasifikacija WHO tumorjev ženskih reproduktivnih organov. WHO Press, 4. izdaja. 2014; 4: 316.
NordiQC. http://www.nordiqc.org.
Park D.I., Yun J.W., Park J.H. et al. Povečanje Her2/neu je neodvisen prognostični dejavnik pri raku želodca. Prebavne bolezni in znanosti. 2006;51(8):1371-1379.
Slamon D. et al. Adjuvant Trastuzumab pri HER2-pozitivnem raku dojke. New England Journal of Medicine. 2011;365:1273-1283.